CN112305099A - 黄曲霉毒素污染发生前的早期预警方法 - Google Patents

黄曲霉毒素污染发生前的早期预警方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及黄曲霉毒素污染发生前的早期预警方法。步骤如下：称取定量样品，进行样品毒素提取，获得样品提取液，将样品提取液进行液相色谱‑高分辨质谱仪检测分析，收集质谱信息，根据质谱信息进行定性分析，获得定性结果，并依据其对应色谱峰面积，并结合内标，基于各预警分子的色谱峰面积/内标峰面积‑预警分子浓度的标准曲线进行定量分析获得这些预警分子定量结果；利用基于以上预警分子的含量为变量，以化学计量学方法建模得到的分类预测模型，输入黄曲霉菌产毒菌株预警分子的定量结果，基于分类预测模型输出风险评估结果来对样品黄曲霉毒素污染风险进行评估。实现黄曲霉毒素污染发生前的早期预警。

Description

黄曲霉毒素污染发生前的早期预警方法
技术领域
本发明涉及黄曲霉毒素污染发生前的早期预警方法，属于分析检测领域。
背景技术
真菌毒素是一种由丝状真菌产生的次生代谢产物，可在全产业链上污染花生，玉米，棉花，坚果等作物。它们不仅在全球范围内发生率很高，造成全球每年25％的作物受真菌毒素污染而造成巨大的经济损失，同时严重危害人民生命健康。例如它们具有致癌性，免疫抑制性，肝毒性，肾毒性以及神经毒性等属性。黄曲霉毒素主要有黄曲霉菌产生，它被认为是全世界十大最恐怖的真菌之一。这种真菌在世界广泛分布，包括中国，是导致中国地区性肝癌的重要诱因。目前，许多国家设置了严格的黄曲霉毒素限量标准，以保障农产品质量安全和避免因此而产生贸易壁垒。很显然，开发黄曲霉毒素早期预警方法变得迫在眉睫。
黄曲霉毒素污染风险主要分为产毒黄曲霉菌和黄曲霉毒素的污染。
本发明中，为了实现黄曲霉毒素污染风险预警，我们提出两个策略：(1)开发产毒黄曲霉菌生物预警分子来早期鉴定花生或土壤中黄曲霉菌的产毒力从而对黄曲霉毒素污染进行早期预警。(2)通过动态监测产毒力相关的预警分子来预测黄曲霉毒素污染严重程度。众所周知，真菌已经演化成千上万的次生代谢物为化学武器或盔甲使其占据有利的生态位和保护它们的食物免受竞争者的争夺。理论上，这些多样性为本研究在亚种水平筛选产毒黄曲霉菌的生物预警分子在理论上铺平了道路。这里我们提出系统调查黄曲霉群体代谢多样性属性并结合机器学习技术筛选可有效区分高低产毒力菌株的预警分子，同时根据预警分子的动态变化预测农产品中黄曲霉毒素污染的严重程度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有黄曲霉毒素污染发生前预警缺乏而提供基于黄曲霉毒素产毒菌株预警分子进行黄曲霉毒素污染发生前的早期预警方法。
本发明为解决上述技术问题，所采用的技术方案为：
黄曲霉毒素污染发生前的早期预警方法，步骤如下：
称取定量样品，进行样品毒素提取，获得样品提取液，将样品提取液进行液相色谱-高分辨质谱仪检测分析，收集质谱信息，根据质谱信息进行定性分析，获得versiconol(VOH),杂色曲菌素B versicolorin B(Ver B),5-甲基杂色曲霉素5-methoxysterigmatocystin(5-MST)、预警分子A和预警分子B的定性结果，并依据其对应色谱峰面积，并结合内标，基于各预警分子的色谱峰面积/内标峰面积-预警分子浓度的标准曲线进行定量分析获得这些预警分子定量结果，
所示的定性分析是通过测定样品中预警分子的一级质谱和二级质谱信息，根据预警分子的一级质谱精确质量数与其理论值比较，质谱偏差在5ppm内，然后结合二级质谱信息，通过比对主要二级质谱特征离子峰进行定性分析；
各预警分子的一级质谱峰信息如下：
Figure RE-GDA0002871942290000021
所述预警分子A的主要特征二级质谱峰包括：335.05045Da，320.02655Da，291.0243Da；
预警分子B的主要特征二级质谱峰包括362.03836Da,333.0355Da，319.0204Da。
各预警分子的质谱图见图11；
利用基于预警分子A的含量，或预警分子B的含量，或预警分子A和预警分子B中的一种或以上与versiconol(VOH)，杂色曲菌素B versicolorin B(Ver B)和5-甲基杂色曲霉素5-methoxysterigmatocystin(5-MST)中的一种或以上预警分子的含量为变量，以化学计量学方法建模得到的分类预测模型，输入黄曲霉菌产毒菌株预警分子的定量结果，基于分类预测模型输出风险评估结果来对样品黄曲霉毒素污染风险进行风险评估。
按上述方案，所述的化学计量学方法为层级聚类分析、最小偏二乘正交投影、随机森林等多元变量统计分析方法。
按上述方案，对样品进行培养3-4天后，取样进行产毒黄曲霉菌预警分子的检测，直接将预警分子versiconol(VOH),杂色曲菌素B versicolorin B(Ver B),5-甲基杂色曲霉素 5-methoxysterigmatocystin(5-MST),预警分子A和预警分子B的定量值输入到分类预测模型预测黄曲霉毒素风险。
按上述方案，上述方法还包括疑似样品筛查，对筛选到的疑似样品进行样品前处理，检测产毒曲霉预警分子，基于分类预测模型输出风险评估结果来对样品黄曲霉毒素污染风险进行风险评估，具体为：检测样品的黄曲霉毒素含量，将黄曲霉毒素未检出或黄曲霉毒素含量未超标样品进行微生物代谢加速培养实验(即加入到含霉菌培养基的无菌培养皿中，放入恒温培养箱中培养3-4天)，疑似污染样品将长出曲霉，疑似样品液氮淬灭研磨备用，对样品进行黄曲霉毒素含量检测，黄曲霉毒素高于国家限量标准的样品直接认定为高风险样品即疑似样品。
按上述方案，所述的样品为农产品或食品，包括花生等。
按上述方案，所述的提取黄曲霉菌产毒菌株预警分子为：使用甲醇：乙腈：水的体积比为2-4：2-4：0-1的溶液进行一次提取，然后使用另外一种提取溶液(甲醇：二氯甲烷：乙酸乙酯的体积比为1-3：1-2：1-2的溶液进行二次提取来提取黄曲霉菌产毒菌株预警分子，然后高速离心等获得样品提取液。
按上述方案，所述的样品分析方法为：将前述样品进行液相色谱-高分辨质谱仪检测分析。所述液相色谱-高分辨质谱仪检测分析中：色谱柱为C18反向色谱柱质谱分析采集模式分为正离子模式和负离子模式分开运行；采集模式为数据依赖采集模式,同时采集到一级质谱数据和二级碎片离子数据，进行定性定量分析，得到预警分子的分析结果。
按上述方案，所述的液相色谱-高分辨质谱仪检测分析含有内标物质，所述内标为樟脑丸酸(负离子模式)和2-氯苯丙氨酸(正离子模式)。
各预警分子色谱峰面积/内标峰面积-预警分子浓度的标准曲线分别如下：
Figure RE-GDA0002871942290000031
其中：X为预警分子浓度，Y为色谱峰面积/内标峰面积。
按上述方案，所述预警分子5-甲基杂色曲霉素5-methoxysterigmatocystin(5-MST)主要特征二级质谱峰包括340.0571Da，322.04675Da，311.05469Da：
预警分子versiconol(VOH)的主要特征二级质谱峰包括：329.06546Da，341.09506Da， 359.07596Da；
预警分子杂色曲菌素B versicolorin B(Ver B)的主要特征二级质谱峰包括：311.0542Da，311.0187Da，283.0238Da。
本发明利用最小偏二乘正交投影，随机森林等机器学习算法训练包含334个样本的训练集筛选到高稳定性的中高产毒力菌株预警分子。优选地，筛选到的高稳定性的高产毒菌和低产毒菌差异最大的前5个标识预警分子，对分类模型识别效果最优，这5个预警分子是： 5-methoxysterigmatocystin,预警分子A(标识分子A),预警分子B(标识分子B),versiconol,versicolorin_B。利用剩下的234个样本作为独立验证集，使用最小偏二乘正交投影，随机森林等机器学习算法来对预警分子进行验证。验证结果显示，验证集筛选到的预警分子排前5的与训练集筛选结果相同，分别是：5-methoxysterigmatocystin,预警分子A, 预警分子B,versiconol,versicolorin_B，从图4a可以看出，这5个预警分子的组合使随机森林模型分类判别效果最优。
上述黄曲霉毒素产毒菌株预警分子的具体筛选：首先将采集的568个样本分为训练集334 个，和独立验证集234样本。包括利用最小偏二乘正交投影，随机森林等机器学习算法训练包含334个样本的训练集筛选到高稳定性的中高产毒力菌株预警分子BioM174(预警分子A), BioM8(5-Methoxysterigmatocystin),BioM175(预警分子B),BioM-18(Versiconol), BioM-36(Versicolorin_B),如图4c，他们的分子式、质量精确数等信息如表1。然后利用剩下的258个样本作为独立验证集来对预警分子进行验证，验证结果表明，这5个预警分子在独立验证集同样被筛选到，且排在前五(如图5所示)，进一步地，这五个预警分子构建的模型具有最好的预测准确度(如图5d所示),因此，我们选择这些预警分子构建产毒黄曲霉菌株预警分子或其组合来进行黄曲霉毒素污染的评估。
表1.黄曲霉毒素B1和生物预警分子的LC-HRMS信息
Figure RE-GDA0002871942290000041
本发明的有益效果是：
1、本发明首次系统评估了我国黄曲霉群体代谢多样性，并首次利用先进的机器学习数据分析方法筛选到了产毒黄曲霉菌预警分子。在亚种水平上对产毒真菌的鉴定提供了精确的预警分子，为真菌毒素的早期预警提供了原创性预警分子。同时本研究策略可举一反三，推广到所有其他微生物亚种水平精准鉴定分类等研究提供了方法学借鉴。为解决食品质量安全研究领域中无早期预警预警分子可监测的难题提供了新途径。
2、本发明使用的群体代谢组学筛选预警分子为真菌毒素污染早期预警提供了一个范例。
3、本发明进一步采用机器学习的方法筛选预警分子，研究不同机器学习算法的差异，通过比较不同筛选结果的稳定性得到稳健的预警分子组合使分类模型准确率在最少的检测预警分子条件下实现最高的分类准确率。
4、本方法发现的预警分子具有原创性，可有效对产毒黄曲霉菌实现准确鉴定，建立的检测预警分子的灵敏度高，可实现高灵敏度检测分析。
附图说明
图1我国黄曲霉群体菌株产毒力筛选取样实验设计方案，根据菌株的产毒力，地理生态来源，进行精心挑选。
图2不产毒、低产毒和中高产毒力黄曲霉群体菌株的分类。
图3我国北部、中部和南部地区黄曲霉群体菌株产毒力区域划分。
图4通过随机森林算法筛选产毒黄曲霉菌生物预警分子。a.随机森林模型生存分析曲线 (ROC)。b.随机森林模型交叉验证结果.c.变量重要性筛选结果图。d.随机森林模型的预测准确率。
图5通过独立验证集确证生物预警分子的稳健性。a.随机森林模型的总生存分析曲线 (ROC)。b.通过随机森林模型筛选到的重要变量图。c.验证集中使用预警分子对高低产毒力菌株的主成分分析。d.使用预警分子预测的菌株产毒力值与实际测定的菌株产毒力值相关性分析图6皮尔逊相关性分析关联黄曲霉菌产毒力与预警分子，图6a是 5-methoxysterigmatocystin与产毒力相关性分析,图6b是预警分子A与产毒力相关性分析,图6c是预警分子B与产毒力相关性分析,图6d是versiconol与产毒力相关性分析,图6e 是versicolorin_B与产毒力相关性分析，图6f是5个预警分子加合平均值与产毒力相关性分析。
图7黄曲霉毒素B1和5个预警分子的标准曲线，用于黄曲霉毒素B1与预警分子的定量分析。
图8a图展示的是一个通过监测产毒曲霉真菌代谢预警分子来进行早期预警的工作流程； b,热图展示预警分子有效区分86个疑似样品。
图9为实际没有污染和污染产毒黄曲霉花生样品在13天培养的动态表型变化图。
图10为预警分子B和Versicolorin_B建立的Single-tree XGBoost。
图11为5个预警分子的二级质谱图及多级质谱碎裂离子树，用于预警分子的定性分析比对，即比对样品中测定分子的二级谱图中主要碎片离子与给定的二级谱图是否能匹配上来定性。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明中涉及到的化合物缩写说明：versiconol(VOH),versicolorin B(Ver B),aflatoxin B1(AFB1),aflatoxin B2(AFB2),5-methoxysterigmatocystin(5-MST)。
下述实施例中，标准曲线的建立过程中：称取200mg的黄曲霉菌丝加入研钵中，液氮研磨，然后加入5mL PBS缓冲溶液。将其梯度稀释成0.01,0.05,0.1,0.5,1,2,5,10,100μg/mg 菌丝液体来构建标准曲线。
实施例1黄曲霉毒素产毒菌株预警分子筛选
通过系统调查黄曲霉群体代谢多样性属性并结合机器学习技术筛选可有效区分高低产毒力菌株的预警分子，主要包括如下步骤：
代表性样本选择：按标准操作规程制备，依据黄曲霉群体菌株库信息，按地理来源，从菌株库中挑选菌株。
样本准备：黄曲霉菌在固体培养基上活化，使用利于产毒的沙氏液体培养基培养，得到各不同黄曲霉菌株的菌丝样品。
样品前处理，包括代谢组样品淬灭，菌丝研磨，加入含内标的提取液提取，高速离心，过滤膜得到上机样品；
样品检测：将前述样品进行液相色谱-高分辨质谱仪检测分析，进行定性定量分析，获得预警分子的分析结果。液相色谱-高分辨质谱仪检测中使用内标物质，所述的内标为樟脑丸酸 (负离子模式)和2-氯苯丙氨酸(正离子模式)。
一般所述的定性分析，包括第一，二，三层次定性分析结果。第一层次定性结果是检测到的化合物经过标准品验证，在一级，二级质谱信息完全匹配，保留时间一致。第二层次的定性结果为本样本中提取的特征峰与公共数据库二级质谱信息匹配得分达到50％及以上的定性化合物结果。第三层次的定性结果为，与研究物种中已经报道的化合物的一级精确质量数偏差小于5ppm。
本发明中的定性分析为：根据预警分子一级质谱精确质量数，判断质量偏差在5个ppm 以内，并结合二级质谱图与预警分子二级质谱谱的主要二级质谱特征离子峰(如图11)进行比对定性分析，将二级质谱图与我们事先构建的黄曲霉菌中检出的预警分子二级质谱谱进行比对，通过比对主要特征离子峰及其强度比例在相同的质谱检测条件下相似度很高的，认定样品中存在这些预警分子；结合内标物质,基于预先建立的色谱峰面积/内标峰面积-预警分子浓度的标准曲线进行定量分析。
定性得到代谢物列表后，我们使用Xcaliber 3.1软件对定性出来的代谢物进行峰提取检测，得到原始数据峰表。代谢组数据预处理是首先对包含一级和二级质谱信息的原始数据进行提峰(可导入Compound Discovery 2.1中，对原始数据进行提峰)，化学分子式预测；峰对齐，一级和二级质谱精确质量数匹配质谱数据库进行定性分析，得到原始数据峰表。
具体过程为：
(1)实验设计、样本前处理及代谢物检测和鉴定：
为了筛选到具有应用潜力的产毒黄曲霉菌株预警分子来评估黄曲霉毒素污染风险，样本的代表性至关重要。为此我们精心地从覆盖337个县取样样本建立的菌株库中挑选了来源于北部、中部、南部地区分离得到的不同产毒力菌株作为本研究样本。如图1所示：黄曲霉群体菌株产毒力筛选取样实验设计方案如下：根据花生种植比例和生态地理类型，我们从北部地区挑选了68株菌株，这其中33.8％具有高产毒力，66.2％是低或者不产毒菌株。从中部地区挑选了413株，其中42.6％为高产毒力菌株，57.4％为低或者不产毒菌株。从南部地区挑选了125株代表性菌株，59.2％为高产毒力菌株，40.8％为低或者不产毒菌株。我们对这568个样本进行了代谢组数据采集，在满足图1方案的要求下，不同来源的菌株在样品准备和数据采集或者后期标志物筛选过程中，这些菌株分布随机。其中334个样本作为训练集用来发现预警分子，剩下的234个样本作为独立验证集用来评估筛选到的预警分子的稳健性。不产毒、低产毒和中高产毒力黄曲霉群体菌株的分类如图2所示，产毒力鉴定分类的规则是：我根据菌株产毒力数值分为五组，第一组为不产毒菌株0-0.1mg/kg mycelium,第二组为低产毒力菌株，0.1-1mg/kg mycelium,第三组是中产毒力菌株组(1-10mg/kgmycelium),第四组是中高产毒力菌株组(10-100mg/kg mycelium)和第五组高产毒力菌株组(100-700mg/kg mycelium)如图2所示；
图3为我国北部、中部和南部地区黄曲霉群体菌株产毒力区域划分。(2)菌株培养和样品前处理实验方法
黄曲霉菌分生孢子接种在PDA琼脂培养基(Becton,Dickinson and company,France)，在29±1℃培养8-10天后，使用0.1％吐温-80清洗孢子，得到孢子悬浮液。使用血球计数板结合显微镜对孢子进行计数并计算孢子悬浮液浓度。然后准备液体培养基，其成分为0.25％酵母提取物,0.1％K2HPO4,0.05％MgSO4–7H2O,和10％葡萄糖，将培养基pH值调整到6.0，并使用三角培养瓶分装50mL准备好的液体培养基，高温灭菌20分钟。接种5×105孢子/mL 的孢子到灭菌后的液体培养基，设定180rpm，29±1℃，摇床上培养5天，过滤收集得到菌丝样品。
样品淬灭和前处理方法：按上述所述得到菌丝样品后，快速过滤菌丝样品，使用10mL， 4℃生理盐水(0.9％(wt/vol)NaCl)冲洗菌丝样品，然后使用液氮对样品进行淬灭。冻存于 -80度冰箱保存待干燥。然后使用冷冻干燥机将样品冻干，称取50mg样品，添加1ml包含内标的提取溶液(甲醇：乙腈：水＝2：2：1)提取，添加5粒钢珠，然后使用均质机将样品磨碎。冰浴超声提取10min,20000rpm离心取上清转移到新的EP管中。然后在含菌丝样品的EP 管中添加另外一种提取溶液(甲醇：二氯甲烷：乙酸乙酯＝1：1：1)进行二次提取。最后将两次提取液混合，20000rpm离心10min,使用0.22um滤膜过滤到进样小瓶，放于-20度冰箱保存，待上机。
(3)质谱分析
质谱检测条件如下：
使用高效液相色谱(Dionex,Sunnyvale,CA,USA)上进行色谱分离，色谱柱为C18反向色谱柱；使用Orbitrap Fusion静电轨道阱高分辨质谱(Thermo Scientific,USA)做质谱分析，所述液相方法为流动相A：甲醇/水(95/5，v/v，含0.1％甲酸和10mM甲酸铵)混合溶液；流动相B：水/甲醇(95/5，v/v，含0.1％甲酸和10mM甲酸铵)混合溶液。梯度洗脱程序为：0–1min:85％A相,1–3min:85–50％A相,3–5min:50-30％A相,5–10min:30-0％ A相,10-13min:0％A相,15min:0-85％A相,15-20min:85％A相(余量为B相)。所述的高分辨质谱条件：离子源加热温度为300度；喷雾电压：正离子模式下为3.5Kv，负离子模式下为3.0Kv；鞘气为40Arb；辅气为5Arb。离子传输毛细管温度为320℃，毛细管电压 -1.9Kv。主要的一级精确质量数全扫参数如下：检测器选用Orbitrap，分辨率选择120000FWHM (半峰宽)，扫描范围为100～1000m/z，自动增益控制设定为1.0e6，注入时间为100ms。一级扫描与二级扫描间主要的过滤参数如下：强度阈值为1.0e4，带电荷为1-2个，动态排除设定为1。数据依赖采集选择Top speed模式，循环时间设为1s。主要的二级质谱扫描(dd-ms2) 参数如下：碎裂模式为选择高能碰撞诱导裂解模式(HCD)，碰撞能正离子模式下设定为35ev，负离子模式设定为30ev。检测器类型为Orbitrap，分辨率设为30000FWHM，自动增益控制设为5.0e4，最大注入时间设为100ms，四级杆隔离宽度设为1Da。
(4)化合物鉴定
质谱原始数据导入到代谢组数据处理软件Compound Discovery 2.1中，共检测到超过 1483个代谢特征，我们通过比对online数据库和本地数据库，结合我们研究的物种的相关文献信息，共手动鉴定到217个代谢物。此外我们将所有提取出来的代谢特征按峰面积大小排序，对于在本研究中未鉴定的代谢特征，仍然保留下来加入数据矩阵进行后续多元统计分析。通过比对mzCloud数据库得到具有二级匹配得分来定性化合物。同时比对本地数据库。
(5)重要预警分子筛选
以上述随机选择的334个黄曲霉菌株代谢组数据集作为模型训练集，首先使用单变量和简单多元变量统计分析工具进行筛选，得到了大量候选差异预警分子。在前述筛选到的超过 30个重要预警分子的基础上，我们进一步训练了一个随机森林模型作为分类器来产生受试工作者曲线(ROC)用于重要预警分子的筛选。
为了筛选到最有效地产毒黄曲霉菌预警分子，我们评估了每一个候选预警分子对模型的重要性，并进行排序。图4c展示了模型筛选到的最重要的15个候选预警分子，包括：BioM174 (预警分子A),BioM8(5-Methoxysterigmatocystin),BioM175(预警分子B),BioM-18 (Versiconol),BioM-36(Versicolorin_B),BioM-26(Versicolorone),BioM-29(Hydroxyvers-icolorone),BioM18(O-Methylsterigmatocystin),BioM-32(Oxoaverantin), BioM-28(Hydroxyversicolorone)等。图4a中展示了不同变量数构建的模型的表现。模型1 是使用最重要的5个变量构建的模型，受试工作者曲线下的阴影面积AUC:0.999,自信区间 Cl:0.996-1。表明训练集中，通过最重要的前五个变量即可将高低产毒力菌株很好的分类。图4b是以最重要的5个变量构建的模型的表现确证结果。混淆矩阵(交叉验证)差异蒙特卡洛取样法，随机抽取训练集中的2/3数据样本来用于构建分类模型，1/3的样本来用于模型的内部模型评估。分类识别高产毒力菌株的正确率达到了97.8％。对模型的准确度进行了评估发现，最重要的5个预警分子分类准确度达到了97.8％，随着变量的增加，模型的预测分类准确度没有显著增加，如图4d所示。
进一步利用剩下的234个样本作为独立验证集来对预警分子进行验证，验证结果表明，这 5个预警分子在独立验证集同样被筛选到，且排在前五(如图5所示)，这五个预警分子构建的模型具有最好的预测准确度。
XGBoost模型参数和预测精度见下表3。
表3 XGBoost模型参数和预测精度
Figure RE-GDA0002871942290000101
图10为预警分子A和Versicolorin_B建立的Single-tree XGBoost简单决策树模型，准确率为94.25％。
(6)进一步地方法确证
为了保证结果的可靠性和一般适用性，通过检出限，定量限，精密度，线性和特异性进行方法学确证。检出限以信噪比大于3，定量限信噪比大于10来计算。方法精密度以日内连续进样和日间非连续的3天来计算测量误差来进行评估。线性范围评估是称取200mg的菌丝制备成破碎的黄曲霉菌丝进行稀释，制成梯度为0,0.01,0.05,0.1,0.5,1,2,5,10,100μg/mg的标准曲线，结果如图7。
所述黄曲霉毒素和产毒黄曲霉菌预警分子的检出限和定量限范围分别为0.003-0.20和 0.012-0.50μg/mg(菌丝)，日内日间精密度为0.02-0.56和0.06-0.44，R2从0.9993-0.9999。具体见下表2。黄曲霉毒素B1和产毒预警分子的定量标准曲线如图7所示。
表3.预警分子的方法学确证参数
Figure RE-GDA0002871942290000111
Figure RE-GDA0002871942290000121
RSD:relative standard deviation相对标准偏差
生物预警分子的特异性是通过分析花生土壤根际分离出来的以及农产品中存在的其他真菌的代谢组，比较生物预警分子在其他真菌中是否存在，评估本研究发现的生物预警分子的特异性。我们通过比较从花生根际土壤和花生样品中分离出来的其他15种真菌，我们发现产毒黄曲霉菌预警分子在其他真菌中没有发现，仅在产毒寄生曲霉菌中存在。如下表1所示。这表明本专利报道的预警分子具有良好的特异性用于在亚种水平上区分产毒真菌。这一有益研究可拓展到其他产毒真菌同样适用。
表2从根际土壤中分离的15种不同真菌菌株的特异性评估结果
Figure RE-GDA0002871942290000122
本发明通过将测定的五个表述分子的含量值与黄曲霉菌产毒力值，数据经过归一化取log 值后进行spearman相关性分析得到上述结果。各预警分子与黄曲霉菌的产毒力间的相关性分别为预警分子A(r＝0.98)，预警分子B(r＝0.91)， 5-methoxysterigmatocystin(r＝0.94),versiconol(r＝0.83),versicolorin_B(r＝0.82)(如图6所示)。
本发明首次通过大规模地选取代表性黄曲霉群体菌株进行代谢组研究，并使用组合的机器学习分析方法筛选到一些全新的预警分子并对其组合进行了验证，同时对预警分子的一般适用性进行了方法学确证和特异性评估，并进行了实际应用，取得良好的早期分类识别效果，为农产品产毒黄曲霉毒素早期预警提供了原创性的生物预警分子。该研究首次利用先进的代谢组学技术结合高级的机器学习差异筛选技术应用于真菌毒素早期预警预警分子开发研究，为我国农产品质量安全早期预警提供了一个研究范例，具有重要的理论研究和实际应用参考价值。
实施例2农产品中产毒黄曲霉菌早期预警研究
当前实际花生样品风险评估过程中存在一个被忽视的问题，即通常我们只检测样品中黄曲霉毒素是否超标，对于未超标样品的潜在风险仍知之甚少。我们假设如果花生样品被黄曲霉菌侵染，由于湿度等条件不适宜黄曲霉菌的生长，暂时处于休眠状态，此时花生样品中黄曲霉毒素未超标，甚至无法检测到黄曲霉毒素，一旦温湿度条件适宜，这类样品将面临很大的黄曲霉毒素污染风险。
为解决上述存在的问题，我们采用上述开发的产毒黄曲霉菌预警分子，通过将经黄曲霉毒素含量检测未超标的花生样品加入到霉菌选择培养基中，置于29度，90％湿度的培养箱中培养，疑似污染样品将看见长出霉菌。将疑似样品进行样品前处理提取产毒黄曲霉菌预警分子，然后分析检测这些预警分子，通过化学计量学法来实现污染和未污染样品的有效区分(如图8)。
由此本发明通过在早期进行产毒黄曲霉预警分子检测，在毒素未超标前即可在较短时间内判别样品中是否污染了产毒黄曲霉菌。如图8a是早期检测实际花生样品中的产毒黄曲霉菌的推荐工作流程。具体来说就是，在实际花生等农产品黄曲霉毒素风险评估过程中，先根据检测的黄曲霉毒素监测值，筛选出超标样品，认定这部分样品为高风险样品。然后，对未超标或未检出样品进行微生物生长加速实验，筛选出长出曲霉菌的疑似样品。对这部分样品在培养早期进行预警分子早期检测，根据我们建立的预警模型或开发简便直观决策工作流程进行风险评估判别。
图8b展示的是我们通过培养筛选429个未超标花生样品后，对长出霉菌的样品判定为疑似样品，筛选得到86个疑似花生样品，并通过检测产毒黄曲霉菌预警分子，使用R语言软件包等多元统计分析软件中的层级聚类分析来有效分类污染了产毒黄曲霉真菌样品和非产毒黄曲霉毒素真菌样品。发现其中39个样品污染了产毒黄曲霉菌，结果如图8b热图所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，例如文中所述的产毒黄曲霉菌可以将其含有拓展到产毒微生物范畴，研究思路与此类似，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.黄曲霉毒素污染发生前的早期预警方法，其特征在于：步骤如下：称取定量样品，进行样品毒素提取，获得样品提取液，将样品提取液进行液相色谱-高分辨质谱仪检测分析，收集质谱信息，根据质谱信息进行定性分析，获得versiconol(VOH),杂色曲菌素Bversicolorin B(Ver B),5-甲基杂色曲霉素5-methoxysterigmatocystin(5-MST)、预警分子A和预警分子B的定性结果，并依据其对应色谱峰面积，并结合内标，基于各预警分子的色谱峰面积/内标峰面积-预警分子浓度的标准曲线进行定量分析获得这些预警分子定量结果；
所示的定性分析是通过测定样品中预警分子的一级质谱和二级质谱信息，根据预警分子的一级质谱精确质量数与其理论值比较，质谱偏差在5ppm内，然后结合二级质谱信息，通过比对主要二级质谱特征离子峰进行定性分析；
各预警分子的一级质谱峰信息如下：
Figure FDA0002726018830000011
所述预警分子A的主要特征二级质谱峰包括：335.05045Da，320.02655Da，291.0243Da；
预警分子B的主要特征二级质谱峰包括362.03836Da,333.0355Da，319.0204Da；
利用基于预警分子A的含量，或预警分子B的含量，或预警分子A和预警分子B中的一种或以上与versiconol(VOH)，杂色曲菌素B versicolorin B(Ver B)和5-甲基杂色曲霉素5-methoxysterigmatocystin(5-MST)中的一种或以上预警分子的含量为变量，以化学计量学方法建模得到的分类预测模型，输入黄曲霉菌产毒菌株预警分子的定量结果，基于分类预测模型输出风险评估结果来对样品黄曲霉毒素污染风险进行评估。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的化学计量学方法为层级聚类分析、最小偏二乘正交投影、随机森林等多元变量统计分析方法。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：对样品进行培养3-4天后，取样进行产毒黄曲霉菌预警分子的检测，直接将预警分子versiconol(VOH),杂色曲菌素B versicolorin B(Ver B),5-甲基杂色曲霉素5-methoxysterigmatocystin(5-MST),预警分子A和预警分子B的定量值输入到分类预测模型预测黄曲霉毒素风险。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包括疑似样品筛查，对筛选到的疑似样品进行样品前处理，检测产毒曲霉预警分子，基于分类预测模型输出风险评估结果来对样品黄曲霉毒素污染风险进行风险评估，具体为：检测样品的黄曲霉毒素含量，将黄曲霉毒素未检出或黄曲霉毒素含量未超标样品进行微生物代谢加速培养实验，疑似污染样品将长出曲霉，疑似样品液氮淬灭研磨备用，对样品进行黄曲霉毒素含量检测，黄曲霉毒素高于国家限量标准的样品直接认定为高风险样品即疑似样品。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的样品为农产品或食品。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的提取黄曲霉菌产毒菌株预警分子为：使用甲醇：乙腈：水的体积比为2-4：2-4：0-1的溶液进行一次提取，然后使用甲醇：二氯甲烷：乙酸乙酯的体积比为1-3：1-2：1-2的溶液进行二次提取来提取黄曲霉菌产毒菌株预警分子，然后高速离心获得样品提取液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的样品分析方法为：将前述样品进行液相色谱-高分辨质谱仪检测分析。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述液相色谱-高分辨质谱仪检测分析中：色谱柱为C18反向色谱柱，质谱分析采集模式分为正离子模式和负离子模式分开运行；采集模式为数据依赖采集模式,同时采集到一级质谱数据和二级碎片离子数据，进行定性定量分析，得到预警分子的分析结果。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的液相色谱-高分辨质谱仪检测分析含有内标物质，所述内标为樟脑丸酸(负离子模式)和2-氯苯丙氨酸(正离子模式)。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述预警分子5-甲基杂色曲霉素5-methoxysterigmatocystin(5-MST)的主要二级质谱离子峰包括340.0571Da，322.04675Da，311.05469Da；
预警分子versiconol(VOH)的二级质谱离子峰包括：329.06546Da，341.09506Da，359.07596Da；
预警分子杂色曲菌素B versicolorin B(Ver B)的主要二级质谱离子峰包括：311.0542Da，311.0187Da，283.0238Da。
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