CN116124925B - 一种黄曲霉毒素b1的双预警分子的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于有害污染物预警分子检测领域，涉及一种黄曲霉毒素B1的双预警分子AVN和ST的测定方法。该方法以AVN和ST为双预警分子，将基于Fe3O4/ZIFs的MSPE技术与HPLC联用，建立早期、精准的AFB1预警分子检测技术，包括：提取样品中的AFB1双预警分子AVN和ST，获得样品提取液，将样品提取液进行基于Fe3O4/ZIFs的MSPE后，进行HPLC检测分析，获得双预警分子的定量结果。本发明首次提出了以AFB1生物合成路径中的前体物质AVN和ST为双预警分子，且本发明建立的基于Fe3O4/ZIFs的磁性固相萃取结合HPLC检测方法具有成本低、有机试剂消耗小、准确度和灵敏度高的优点。
Description
技术领域
本发明属于有害污染物预警分子检测领域，具体涉及一种黄曲霉毒素B1的双预警分子AVN和ST的测定方法。
背景技术
黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是由曲霉属真菌产生的一种毒性很强的次级代谢产物，具有很强的毒性、致癌性和致突变性。AFB1广泛存在于农产品中，不仅引起了严重的公共安全和健康问题，而且造成了巨大的经济损失。AFB1具有高的热稳定性和化学稳定性，一旦产生就很难被去除。如果能在产生AFB1之前就及时发现污染风险，将有利于提前采取相应的控制措施，阻断AFB1的生物合成，防止农产品被AFB1污染。
AFB1早期预警技术可以预测AFB1污染的发生，是一种有效防止AFB1污染产生和降低经济损失的重要防控策略。传统的AFB1预警技术主要是基于霉菌生长的预测微生物学和微生物生长指标监测法，由于存在可靠性低和滞后性的缺点而无法被广泛应用。近年来，以前体物质为预警分子的AFB1预警技术成为了一种有潜力的策略。在黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)生物合成途径中已经发现了大约15种前体物质。这些前体物质是在AFB1之前产生的，有望作为AFB1的早期预警分子。前体物质的准确、灵敏测定是保证前体预警技术有效性的关键。以合成AFB1分支路径中的Versicolorin A(Ver A)和杂色曲霉素(Sterigmatocystin，ST)为预警分子可以精准预测AFB1产生的风险，并且已有若干Ver A和ST测定的方法被报道。但是，Ver A和ST位于AFB1合成路径的末端，仅以它们作为预警分子存在预警时间短的缺点。而且，已有报道中所采用的样品前处理均为传统固相萃取，存在操作过程繁琐、有机溶剂消耗大、成本高、效率低等缺点。
为了实现早期、精准的预测AFB1的污染风险，同时以AFs生物合成前端的前体物质(早期预警)和末端AFB1分支路径的前体物质(精准预警)作为双预警分子是十分必要的。但是，前端和末端的前体物质具有不同的极性，且化学结构差异较大(如图1所示)。传统的固相萃取剂中与目标物之间的作用位点单一且暴露不足，难以同时萃取极性和化学结构差异较大的多种前体物质。发展作用位点丰富且充足的萃取剂以同时萃取具有不同极性和化学结构的前体物质，并建立相关检测方法是具有挑战性的。
目前未见基于AFB1合成路径前端和末端前体物质的AFB1双预警分子的相关测定方法。
发明内容
针对现有技术中仅涉及到一种合成路径末端的预警分子，不能更早地对AFB1污染进行预警，以及检测方法中样品前处理过程操作复杂、试剂消耗量大、效率低、无法同时高效萃取结构差异较大的前体物质的问题，本发明提供一种以AFB1生物合成路径中第二个稳定的前体物质Averantin(AVN)和末端AFB1分支路径中的前体物质ST为双预警分子的检测方法，所述检测方法是基于优化的Fe3O4/ZIFs的磁性固相萃取(Magnetic solid phaseextraction,MSPE)技术结合高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)法进行。
本发明的技术方案为：
以AFB1的前体物质AVN和ST为双预警分子，将基于Fe3O4/ZIFs的MSPE技术与HPLC联用，建立简单、有机试剂消耗小、能同时高效萃取AVN和ST的萃取体系，以及准确和灵敏测定AVN和ST的检测方法，包括以下步骤：称取定量样品，提取样品中的前体物质AVN和ST，获得样品提取液，将样品提取液进行基于Fe3O4/ZIFs的MSPE后，进行HPLC分析，获得双预警分子AVN和ST的定量结果。
在进一步的方案中，所述MSPE过程中Fe3O4/ZIFs的用量和解吸剂的用量比为1～15mg:0.25～2.5mL。
所述MSPE过程中Fe3O4/ZIFs的吸附时间为10～50min。
所述MSPE过程中的解吸剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、0.1mol·L-1盐酸/乙腈＝1:9、1:6、1:3或1:1(v/v)、0.1mol·L-1甲酸/乙腈＝1:9(v/v)或0.1mol·L-1乙酸/乙腈＝1:9(v/v)。
所述MSPE过程中的解吸时间为2～12min。
优化后的基于Fe3O4/ZIFs的MSPE方法中，Fe3O4/ZIFs的用量和解吸剂的用量比为10mg:2mL。Fe3O4/ZIFs的吸附时间为25min。解吸剂为0.1mol·L-1甲酸/乙腈＝1:9(v/v)。解吸时间为2min。
所用的吸附剂Fe3O4/ZIFs的合成过程中Fe2+和Zn2+的摩尔比为1:8，具体按以下步骤制备得到：
将FeSO4·7H2O、Zn(CH3COO)2·2H2O和FeCl3·6H2O溶解在去离子水中，得溶液1；将溶液1中充满氮气，加热至80℃。制备二甲基咪唑的水溶液，将二甲基咪唑的水溶液按照1:1的体积比在剧烈搅拌下倒入溶液1中，剧烈搅拌10min。自然冷却后，用磁铁收集产物，用乙醇洗涤三次，去离子水洗涤2次，然后真空冷冻干燥过夜。所得产物为Fe3O4/ZIFs。
上述步骤中，溶液1中FeSO4·7H2O的浓度为0.05mol·L-1、Zn(CH3COO)2·2H2O的浓度为0.4mol·L-1、FeCl3·6H2O的浓度为0.1mol·L-1。二甲基咪唑水溶液中二甲基咪唑的浓度为2.5mol·L-1。
本发明实施例还将上述优化后的MSPE技术与HPLC结合用于大米样品中AVN和ST的测定，首先提取大米中的AVN和ST；然后采用上述优化后的基于Fe3O4/ZIFs的MSPE技术对AVN和ST进行萃取；接着用HPLC检测AVN和ST的含量。
提取大米中的AVN和ST的具体步骤为：
将大米磨碎后过100目筛，于-18℃冰箱保存。准确称取5.0g大米样品于50mL离心管中，加入10mL 80％的乙腈水溶液，涡旋混匀1min，然后超声提取10min。提取完成后，5000rpm离心5min。移取2mL上清液，50℃下氮吹浓缩至近干，用10mL一级水将残渣复溶。
本发明的有益效果为：
(1)本发明采用具有丰富官能团的多孔Fe3O4/ZIFs可以同时高效萃取具有不同极性和结构的AVN和ST，且Fe3O4/ZIFs的合成成本低，操作过程简单。
(2)本发明首次建立了AFB1双预警分子AVN和ST的检测方法，可准确、灵敏的检测大米样品中的AVN和ST。
(3)本发明建立的Fe3O4/ZIFs-MSPE-HPLC方法为AFB1的早期、精准预警提供了一种新的测定方法和研究途径。
附图说明
图1为AVN和ST的结构式。
图2为Fe3O4/ZIFs的透射电镜图。
图3为Fe3O4/ZIFs的氮气吸附-脱附曲线图。
图4为Fe3O4/ZIFs的孔径分布图。
图5为大米加标样品在MSPE萃取前(c)和后(d)的色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
本发明实施例首先制备并筛选吸附剂，然后对筛选出的吸附剂萃取AVN和ST的参数进行优化，最后将优化参数与HPLC结合应用于大米样品中AVN和ST的测定。
实施例1
Fe3O4/ZIFs(1:8)的制备
将2.0mmol FeSO4·7H2O、16mmol Zn(CH3COO)2·2H2O和4.0mmol FeCl3·6H2O溶解在40mL去离子水中。在N2保护下，加热至80℃。然后，将40mL含有100mmol的二甲基咪唑水溶液在剧烈搅拌下倒入上述溶液中，剧烈搅拌10min。自然冷却后，用磁铁收集产物，用乙醇洗涤三次，去离子水洗涤2次，然后真空冷冻干燥过夜。所得产物即为Fe3O4/ZIFs(1:8)，其透射电镜图、氮气吸附-脱附曲线图和孔径分布图分别如图2、图3和图4c所示，比表面积为333.2m2·g-1。
实施例2
Fe3O4/ZIFs(1:5)的制备
将2.0mmol FeSO4·7H2O、10mmol Zn(CH3COO)2·2H2O和4.0mmol FeCl3·6H2O溶解在40mL去离子水中。在N2保护下，加热至80℃。然后，将40mL含有100mmol的二甲基咪唑水溶液在剧烈搅拌下倒入上述溶液中，剧烈搅拌10min。自然冷却后，用磁铁收集产物，用乙醇洗涤三次，去离子水洗涤2次，然后真空冷冻干燥过夜。所得产物即为Fe3O4/ZIFs(1:5)，其氮气吸附-脱附曲线图和孔径分布图分别如图3和图4b所示，比表面积288.48m2·g-1。
实施例3
Fe3O4/ZIFs(1:3)的制备
将3.0mmol FeSO4·7H2O、9mmol Zn(CH3COO)2·2H2O和4.0mmol FeCl3·6H2O溶解在40mL去离子水中。在N2保护下，加热至80℃。然后，将40mL含有100mmol的二甲基咪唑水溶液在剧烈搅拌下倒入上述溶液中，剧烈搅拌10min。自然冷却后，用磁铁收集产物，用乙醇洗涤三次，去离子水洗涤2次，然后真空冷冻干燥过夜。所得产物即为Fe3O4/ZIFs(1:3)，其氮气吸附-脱附曲线图和孔径分布图分别如图3和图4a所示，比表面积268.36m2·g-1。
上述结果表明，通过改变Fe2+:Zn2+的比例可以调控Fe3O4/ZIFs的比表面积和孔径大小。Zn2+比例越高，Fe3O4/ZIFs的比表面积越大，微孔孔径更宽。
实施例4
Fe3O4/ZIFs(1:3)吸附AVN和ST
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为300μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入5mg Fe3O4/ZIFs(1:3)，在220rpm、35℃条件下振荡20min后，移取2mL上述混合溶液，经PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，Fe3O4/ZIFs(1:3)对AVN和ST的吸附效率分别为33.09％和74.80％。
实施例5
Fe3O4/ZIFs(1:5)吸附AVN和ST
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为300μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入5mg Fe3O4/ZIFs(1:5)，在220rpm、35℃条件下振荡20min后，移取2mL上述混合溶液，经PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，Fe3O4/ZIFs(1:5)对AVN和ST的吸附效率分别为36.69％和84.26％。
实施例6
Fe3O4/ZIFs(1:8)吸附AVN和ST
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为300μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入5mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡20min后，移取2mL上述混合溶液，经PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，Fe3O4/ZIFs(1:8)对AVN和ST的吸附效率分别为53.69％和93.59％。
与相同条件下使用Fe3O4/ZIFs(1:3)和Fe3O4/ZIFs(1:5)吸附AVN和ST的实施例4和5相比，Fe3O4/ZIFs(1:8)吸附效率最高，这表明Zn2+比例越高，Fe3O4/ZIFs的比表面积越大，微孔孔径更宽，更有利于目标物在吸附剂上的传质，从而提高萃取效率。AVN和ST的分子大小相似，理论上，基于比表面积和微孔的物理吸附对两者的吸附效率应该相差不大。但是，Fe3O4/ZIFs对ST的吸附效率明显高于AVN，说明还存在不同相互作用力导致的化学吸附，可能是π-π共轭作用、疏水作用、氢键、静电作用和表面络合作用，且Fe3O4/ZIFs与ST之间的相互作用力更强。在萃取过程中，ST可能更难从Fe3O4/ZIFs上洗脱，导致萃取回收率较低。
实施例7
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为1mg，吸附时间20min，解吸剂2mL 0.1mol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入1mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡20min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL 0.1mmol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为12.82％和39.14％。
实施例8
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间20min，解吸剂2mL 0.1mol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡20min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL 0.1mmol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为64.49％和67.76％。
实施例9
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为15mg，吸附时间20min，解吸剂2mL 0.1mol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入15mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡20min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL 0.1mmol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为62.32％和52.97％。
根据实施例7～9可以得出，当吸附剂用量从1mg增加至10mg时，AVN和ST的萃取回收率增加，继续增加到15mg时，AVN的萃取回收率变化不大，而ST的萃取回收率下降。这是由于ST与Fe3O4/ZIFs(1:8)之间的作用力比AVN强，吸附剂用量过多将不利于解吸。
实施例10
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间10min，解吸剂2mL 0.1mol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡10min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL 0.1mmol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为58.90％和65.97％。
实施例11
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间25min，解吸剂2mL 0.1mol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡25min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL 0.1mmol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为71.90％和71.73％。
实施例12
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间50min，解吸剂2mL 0.1mol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡50min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL 0.1mmol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为66.22％和75.62％。
根据实施例10～12可以得出，当吸附时间从10min增加至50min时，AVN的萃取效率在吸附时间为25min时达到最大值，继续延长时间，略有下降。ST的萃取回收率随着时间延长而缓慢增加。由此可见，充足的吸附时间有利于提高分析物的吸附效率，但过长的吸附时间会导致时间成本增加。
实施例13
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间25min，解吸剂2mL丙酮，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡25min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL丙酮，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为64.76％和7.39％。
实施例14
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间25min，解吸剂2mL乙腈，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡25min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL乙腈，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为71.65％和10.14％。
实施例15
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间25min，解吸剂2mL甲醇，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡25min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL甲醇，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为69.33％和22.00％。
实施例16
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间25min，解吸剂2mL乙醇，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡25min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL乙醇，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为70.61％和28.44％。
根据实施例13、14、15和16可以得出，乙腈、丙酮、甲醇和乙醇为解吸剂时，能将大部分的AVN(>60％)从吸附剂上洗脱下来，说明Fe3O4/ZIFs(1:8)与AVN之间起主导作用的是π-π作用和疏水作用，但是无法有效洗脱ST(<30％)，说明Fe3O4/ZIFs(1:8)与ST之间起主导作用是其他作用力。
根据实施例11和14可以得出，乙腈解吸剂中加入盐酸对ST的萃取回收率影响十分显著。说明Fe3O4/ZIFs(1:8)在萃取ST时起主要作用的是静电和表面络合作用。
实施例17
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间25min，解吸剂2mL 0.1mmol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:6)，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡25min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL 0.1mmol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:6)，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为64.10％和89.22％。
实施例18
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间25min，解吸剂2mL 0.1mmol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:1)，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡25min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL 0.1mmol·L-1盐酸/乙腈(v:v＝1:1)，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为59.09％和93.83％。
根据实施例11、17和18可以得出，增加盐酸的比例有利于提高ST的萃取效率，但是不利于AVN的解吸。这主要是因为Fe3O4/ZIFs(1:8)与AVN和ST之间存在的主要相互作用力不同。
实施例19
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间25min，解吸剂2mL 0.1mol·L-1甲酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡25min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL 0.1mmol·L-1甲酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为80.52％和91.65％。
实施例20
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间25min，解吸剂2mL 0.1mol·L-1乙酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡25min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL 0.1mmol·L-1乙酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为78.63％和69.93％。
根据实施例11、19和20可以得出，由于ZIFs中的Zn2+与羧酸盐的结合能(38.14kcal·mol-1)远高于与羟基的结合能(15.54kcal·mol-1)，带羧基的甲酸和乙酸可以与AVN和ST中的羟基竞争Fe3O4/ZIFs中的Zn2+，从而破坏AVN和ST与Fe3O4/ZIFs间的静电作用和表面络合作用。另外，甲酸的分子比乙酸小，可能比乙酸更容易接近吸附位点，所以萃取效率最高。
实施例21
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间25min，解吸剂0.25mL 0.1mol·L-1甲酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm,35℃条件下振荡25min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入0.25mL 0.1mmol·L-1甲酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN的萃取效率分别为66.91％，而ST的仅有20.87％。
实施例22
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间25min，解吸剂2.5mL 0.1mol·L-1甲酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡25min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2.5mL 0.1mmol·L-1甲酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸10min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为73.43％和94.46％。
根据实施例19、21和22可以得知，解吸剂的体积对ST的萃取回收率的影响比对AVN的更明显，这是由于ST与吸附剂之间产生的作用力更强，需要加入足够的解吸剂才能充分地将ST从吸附剂上洗脱下来。
实施例23
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间25min，解吸剂2mL 0.1mol·L-1甲酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸2min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡25min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL 0.1mmol·L-1甲酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸2min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为81.21％和86.96％。
实施例24
Fe3O4/ZIFs(1:8)萃取AVN和ST(吸附剂Fe3O4/ZIFs(1:8)的质量为10mg，吸附时间25min，解吸剂2mL 0.1mol·L-1甲酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸12min)
配置AVN和ST的混合水溶液待用，其中AVN和ST的浓度均为10μg·L-1。量取10mLAVN和ST的混合水溶液，调节溶液的初始pH为7，加入10mg Fe3O4/ZIFs(1:8)，在220rpm、35℃条件下振荡25min后，通过磁铁分离，弃去上清液。加入2mL 0.1mmol·L-1甲酸/乙腈(v:v＝1:9)，超声解吸12min。磁性分离后，将上清在50℃下氮吹至近干，加入100μL乙腈复溶残渣。经0.22μm的PTFE滤膜过滤后，利用HPLC分析AVN和ST的浓度。
结果显示，AVN和ST的萃取效率分别为80.35％和94.46％。
根据实施例19、23和24可以得出，解吸时间延长对AVN的萃取效率影响不大，有利于提高ST的萃取效率，但是解吸时间过长会增加实验的时间成本。
实施例25
基于Fe3O4/ZIFs(1:8)的MSPE技术结合HPLC用于测定大米样品中的AVN和ST
大米样品从郑州当地市场购买。将大米磨碎后过100目筛，于-18℃冰箱保存。准确称取5.0g大米样品于50mL离心管中，加入10mL 80％的乙腈水溶液，涡旋混匀1min，然后超声提取10min。提取完成后，5000rpm离心5min。移取2mL上清液，50℃下氮吹浓缩至近干，用10mL一级水将残渣复溶。然后在优化的MSPE条件下(实施例23中的MSPE条件)进行萃取，用HPLC检测AVN和ST的含量。大米样品在萃取前后的代表性HPLC色谱图如图5所示。
本发明方法对0.5～100μg·kg-1范围内的AVN和1.0～100μg·kg-1范围内的ST有良好的线性关系，相关系数(R2)分别为0.997和0.998。AVN的检出限(S/N＝3)为0.08μg·kg-1，定量限(S/N＝10)为0.25μg·kg-1。ST的检出限为0.36μg·kg-1，定量限为1.18μg·kg-1。该方法在1、5和10μg·kg-1三个加标水平的AVN和ST的加标回收率分别在80.6％～104.1％和79.8％～105.9％之间，RSD分别在3.1％～12.2％和7.3％～17.0％之间。
结果表明，本发明建立的Fe3O4/ZIFs-MSPE-HPLC方法可以用于测定大米样品中的AVN和ST。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。
Claims (3)
1.一种黄曲霉毒素B1的双预警分子的测定方法，其特征在于，以黄曲霉毒素B1的前体物质AVN和ST为双预警分子，将基于Fe3O4/ZIFs的磁性固相萃取技术与高效液相色谱联用测定样品中的AVN和ST；
所述的Fe3O4/ZIFs按以下步骤制备得到：
将FeSO4·7H2O、Zn(CH3COO)2·2H2O和FeCl3·6H2O溶解在去离子水中，得溶液1，在氮气保护下将溶液1加热至80 ℃；
将二甲基咪唑的水溶液按照1:1的体积比在剧烈搅拌下倒入溶液1中，剧烈搅拌10min；
自然冷却后，收集产物，洗涤，然后真空冷冻干燥过夜，所得产物为Fe3O4/ZIFs；Fe3O4/ZIFs的合成过程中Fe2+和Zn2+的摩尔比为1:8；
磁性固相萃取中，Fe3O4/ZIFs的用量和磁性固相萃取中解吸剂的用量比为10 mg:2 mL，Fe3O4/ZIFs的吸附时间为25 min，解吸剂为0.1 mol·L-1甲酸/乙腈=1:9（v/v），解吸时间为2～12 min；
所述样品为大米。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取样品中的前体物质AVN和ST，获得样品提取液，将样品提取液进行基于Fe3O4/ZIFs的磁性固相萃取后，进行HPLC检测分析，获得双预警分子AVN和ST的定量结果。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，溶液1中FeSO4·7H2O的浓度为0.05 mol·L-1、Zn(CH3COO)2·2H2O的浓度为0.4 mol·L-1、FeCl3·6H2O的浓度为0.1 mol·L-1，二甲基咪唑水溶液中二甲基咪唑的浓度为2.5 mol·L-1。
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