CN113831396A - 一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子及其用途。指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT‑YJFZP008的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。其用于鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力和鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，容易推广应用。

Description

一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子及其用途
技术领域
本发明涉及一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子及其用途指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子。
背景技术
黄曲霉毒素毒性强、危害大，是污染食品种类最多的污染物，近年总体呈现污染加重趋势，严重威胁食品安全和人民健康。黄曲霉毒素是自然界毒性最强的一类真菌毒素，其中黄曲霉毒素B1是国际癌症研究组织(International Agency for Research on Cancer,IARC)认定的I类致癌物，已引发过多起人畜群体中毒事件，成为肝癌病例高发的主要原因之一。根据近5年Web of Science检索数据统计：黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110种，高居污染物首位。然而，迄今国内外仍没有黄曲霉毒素等微生物毒素污染前的分子预警研究范例，难以满足事前预警的迫切需求。
现有黄曲霉毒素预警方法主要是基于黄曲霉毒素检测技术建立，用于毒素污染水平评价或产后污染程度与消费风险评估，一旦检测发现，污染往往已经发生，难以满足事前预警与指导防控的迫切要求。欧盟食品和饲料快速预警系统(Rapid Alert System forFood and Feed，RASFF)利用限量标准与检测获得食品与饲料中黄曲霉毒素含量，对各国输入欧盟的食品与饲料进行快速预警。美国研究机构基于黄曲霉毒素检测技术与污染监测数据，研究建立了多元罗吉斯蒂回归分析和叠加高斯处理等预警模型，主要用于评估产后玉米等农产品真菌毒素污染程度与消费风险。
综合国内外近二十年研究进展，当前黄曲霉毒素早期预警分子不明是根本原因。针对这一瓶颈难题，发明人团队经过十多年攻关研究，构建了我国黄曲霉毒素产毒菌株库、菌株产毒力数据库、强产毒菌株蛋白质抗体库，建立了用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的抗体库方法，并成功发明了一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子，并用于鉴别菌株产黄曲霉毒素能力，发现农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，为及时发现黄曲霉毒素污染风险与早防早控提供科学依据。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008，以及鉴别体系黄曲霉毒素产毒菌产毒力的用途。用于鉴别曲霉属菌株产黄曲霉毒素能力和鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，容易推广应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
提供一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008，指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
提供鉴别体系黄曲霉毒素产毒菌产毒力的方法，基于指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的含量检测，进行体系黄曲霉毒素产毒菌产毒力的鉴别，指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
具体可通过采用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的氨基酸序列或其中的部分序列，通过常规抗体制备流程，制备出与该蛋白质对应的抗体，并实现对该指示分子蛋白质的定量检测，也可以通过其他检测技术手段实现对这些与该蛋白质有一一对应关系的定量检测，从而达到上述用途，部分序列是指与该指示分子蛋白质有一一对应关系的全序列中的一部分。
鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力的应用，待鉴别菌株中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子含量越高，则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强；
具体应用方法包括：
(1)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体：
(2)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体；
(3)待鉴别菌株的待测液的制备：待鉴别菌株培养，稀释，获得待鉴别菌株的待测液；
具体可为：将待鉴别菌株在常规察氏培养基或者其他适宜菌株生长的培养基培养，培养的环境温度为15～35℃，培养时间不少于12h后，取培养基与培养物的混合体充分匀浆，再用无菌水稀释1-10倍，获得待鉴别菌株的待测液；
(4)待鉴别菌株产黄曲霉毒素能力的测定：
采用间接非竞争双抗体夹心法鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力，步骤包括：a酶标板中包被AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体，洗板；加入封闭液封闭，洗板；b加入待测液反应，洗板；c加入AFT-YJFZP008多克隆抗体反应，洗板；d加入与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；e加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果。
具体步骤为：
a将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体用ELISA包被缓冲液配制0.2-8.0μg/mL的包被液，再加入至酶标板中(以200μL/孔)，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液(每孔加300μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
b然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将待测液适当稀释，加入到酶标板孔中(每孔加入200μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
c然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的多克隆抗体适当稀释，加入到酶标板孔中(每孔加入200μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
d然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记抗体根据需要稀释，加入到酶标板孔中(每孔加入200μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
e然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算AFT-YJFZP008含量结果。
按上述方案，采用系列浓度梯度的产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液制作标准曲线。
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008在鉴别样品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株的应用，具体应用方法，步骤如下：
(1)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体：
(2)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体；
(3)待鉴别样品的制备：待鉴别样品培养，稀释，获得待鉴别样品的待测液；
具体可为：称量待鉴别样品，转移至适量无菌水中，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液，取10-1000μL样品均匀分散液加在含6-600mL常规察氏培养基或者其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基中，置于15-35℃下200±50rpm震荡培养，培养6-24h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
(4)用于鉴别样品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株：步骤包括：
a酶标板中包被AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体，洗板；加入封闭液封闭，洗板；b加入待鉴别样品液反应，洗板；c加入AFT-YJFZP008多克隆抗体反应，洗板；d加入与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记的抗体，反应，洗板；e加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果；
具体步骤为：
a将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体用ELISA包被缓冲液配制0.2-8.0μg/mL的包被液，再加入至酶标板中(以200μL/孔)，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液(每孔加300μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
b然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将待鉴别样品液适当稀释，加入到酶标板孔中(每孔加入200μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
c然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的多克隆抗体适当稀释，加入到酶标板孔中(每孔加入200μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
d然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记抗体根据需要稀释，加入到酶标板孔中(每孔加入200μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
e然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算AFT-YJFZP008含量结果。
(5)鉴别结果评判：
待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量越高，则说明待鉴别样品中产黄曲霉毒素能力即产毒力越强，根据上述酶标仪计算结果，获得单位体积待检测样品液中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的含量，判定待鉴别样品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。
按上述方案，所述的待鉴别样品为土壤、农产品、中药材或者饲料等。
按上述方案，指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的动物源不同，具体地：
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的获得可采用如下方法：利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得；
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体的获得可采用如下方法：利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的多克隆抗体制备技术方案即可研制获得指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体；
所述的与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记的抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体，可以直接购买商品获得。
黄曲霉菌株产毒力是衡量菌株产生黄曲霉毒素能力的指标，菌株产毒力越强，表明该菌株在相同时间和培养条件下能够产生黄曲霉毒素的量越多。本发明提供了一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008，利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量与菌株产毒力成正相关的特征，进一步提供了鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力和鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株的用途，实用且易推广用，为及时发现黄曲霉毒素污染风险与早防早控提供了关键抓手与科学依据，对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
本发明有益效果在于：
1.可用于鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌菌株产黄曲霉毒素能力；
2.可用于鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株；
3.易操作，实用性强，容易推广应用；
4.对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
具体实施方式
实施例1指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的制备
按照如下配方配置察氏培养基：3％(w/v)蔗糖，0.3％(w/v)NaNO3，0.1％(w/v)K2HPO4，0.05％(w/v)MgSO4·7H2O，0.05％(w/v)KCl，0.001％(w/v)FeSO4，pH6.5，配置获得察氏培养基。随机选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株HLJ-1、HeNZY-2、HuBha-24、JXZS-29-2、LNct-6、GXfc-34、GDZJ-122-2、JSnt-1、HuNdx-7、HBHA-8-17等10株，分别接种到上述察氏培养基中，于28℃200rpm/min培养5天后，常规方法充分匀浆、破碎细胞，用常规的蛋白质纯化系统、蛋白质电泳、免疫亲和等方法，即可纯化获得指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008。试验结果表明，上述产毒菌株培养物中均可以制备得到AFT-YJFZP008，在同样培养条件下，HBHA-8-17制备得到AFT-YJFZP008的量最多，而HLJ-1制备得到AFT-YJFZP008的量最少。
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的初始获得用发掘方法：
用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子AFT-YJFZP008的方法如下：
(1)取黄曲霉强产毒力菌株，培养获得菌株培养物和胞外分泌蛋白质混合物；然后将菌株培养物细胞破碎，获得胞内蛋白质混合物；将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并，加入碳二亚胺偶联获得黄曲霉抗原；
(2)将上述黄曲霉抗原免疫试验动物，获得纳米抗体库或单克隆抗体库；
(3)获得不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质合并溶液，利用步骤(2)获得的抗体库中的抗体，检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质，获得系列检测信号；
(4)找出检测信号与上述黄曲霉菌株产毒力呈现正相关的纳米抗体，即黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体，与黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体对应的蛋白质即发掘出的黄曲霉菌株产毒力指示分子。
上述方案中，步骤(1)的黄曲霉强产毒力菌株是通过常规方法从自然界分离、鉴定，或者通过人工改造获得，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果不小于10μg/kg。
步骤(3)中所述的不同产毒力的黄曲霉菌株不少3株，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果呈现为高、中、低至少3个层次。
所述的黄曲霉强产毒力菌株培养中采用的培养基为察氏培养基或者其他可供黄曲霉正常生长的营养物，培养时间不少于12h，培养的环境温度为15～35℃。
所述的菌株培养物细胞破碎是通过常规液氮研磨或者细胞破碎仪等方法。
所述的碳二亚胺的用量为每1.0mL合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物中，加入碳二亚胺量为0.005～0.1g。
所述的偶联反应指在15～37℃反应2～6h，在4～10℃反应过夜。
所述的免疫是常规免疫方式，接种黄曲霉抗原。所述的试验动物是指小白鼠或者羊驼或者其他具有相似效果的试验动物。
按上述方案，所述的抗体制备流程是指常规的纳米抗体制备技术流程或者常规的基于细胞融合的杂交瘤单克隆抗体制备技术流程。
按上述方案，所述的检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质是指采用常规的Western Blot技术流程，即将不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质移至硝酸纤维素膜上，再利用上述抗体库中抗体，经直接方法或者间接方法检测，或者采用具有类似功效的其他技术流程。
按上述方案，上述直接方法是指将上述抗体库中抗体通过常规方法与信号材料偶联，再与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应。
按上述方案，上述间接方法是指将上述抗体库中抗体先与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应，然后再利用第二抗体与信号材料偶联物与上述结合到硝酸纤维素膜上的抗体发生免疫结合反应。
上述检测中信号材料是辣根过氧化物酶或者是胶体金或者是荧光材料或者是具有类似功效的其他材料。检测信号是显色反应信号或者是斑点信号或者是荧光信号。
实施例2指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体制备
利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于0.1mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式免疫羊驼，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至羊驼血清效价不再上升后，随后对免疫羊驼的静脉取血、提取总RNA、合成cDNA、VHH基因的扩增、VHH基因片段的回收、VHH基因与双酶切处理的pCANTAB 5E(his)载体的连接、连接产物电转化、构建纳米抗体基因库以及纳米抗体基因库的拯救等操作参考专利文献CN103866401A的方法完成，最终获得拯救后的纳米抗体基因库。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，参考专利文献CN103866401A的方法对上述拯救后的纳米抗体基因库进行2-4次淘选，再用AFT-YJFZP008和间接非竞争ELISA鉴定每一噬菌体克隆产生的抗体，阳性结果对应的噬菌体为噬菌体阳性克隆，再将此阳性克隆通过纳米抗体制备的常规方式制备出纳米抗体，即为AFT-YJFZP008的纳米抗体，用于进一步应用研究工作，优选经ELISA方法表征，具有特异性强、亲和力高的纳米抗体。
实施例3指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的单克隆抗体制备
利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于0.1mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式BALB/c鼠，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至BALB/c鼠血清效价不再上升后，随后分离免疫小鼠脾细胞、脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0融合、半固体培养基对杂交瘤细胞的选择性培养操作参考专利文献CN103849604A的方法完成，待半固体培养基上长出针尖白色斑点后，将白色斑点分别挑取到内置杂交瘤常规培养基的96孔培养板，从而获得单克隆杂交瘤资源库。
参考专利文献CN103849604A的方法获取上述单克隆杂交瘤培养上清即单克隆抗体，将上述制备获得的AFT-YJFZP008按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，再用间接非竞争ELISA程序鉴定每一单克隆抗体，挑取阳性克隆，获得AFT-YJFZP008单克隆抗体，并用于进一步应用研究工作，优选经检测具有特异性强、亲和力高的特点的AFT-YJFZP008单克隆抗体。
实施例4指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体制备
利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的兔多克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008直接用作抗原，以浓度不低于0.1mg/mL的溶液与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式新西兰大白兔，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至免疫动物血清效价不再上升后，通过常规方法制备获得免疫动物的血清，即为指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体。
实施例5利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008鉴别黄曲霉毒素的菌株产毒力
第一步，待鉴别菌株的待测液的制备：按菌株产毒力强弱，选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株HBZHX-21、HBXY-36、HBHA-1-4、GDZJ-6、HeNZY-2、HuBha-24、JSnt-1、HuNdx-7、GDZJ-108-19、HBHA-8-17等10株，待鉴别菌株在常规察氏培养基或者其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养，培养的环境温度为15～35℃，培养时间不少于12h后，取培养基与培养物的混合体充分匀浆，再用无菌水稀释5倍，获得待鉴别菌株的待测液。
第二步，上述待鉴别菌株待测液的测定：将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体溶解在常规的ELISA包被缓冲液中，形成2μg/mL的包被液，再以200μL/孔加入至96孔酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，每孔加300μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述待测液体适当稀释，再每孔加入200μL，或者每孔加入200μL系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体适当稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体按说明稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算AFT-YJFZP008含量。
根据上述文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》结果，HBZHX-21、HBXY-36、HBHA-1-4、GDZJ-6、HeNZY-2、HuBha-24、JSnt-1、HuNdx-7、GDZJ-108-19、HBHA-8-17等10株菌株的产毒力依次为：0μg/L、0μg/L、3.8μg/L、4.9μg/L、67.2μg/L、81.7μg/L、192.0μg/L、204.4μg/L、297.4μg/L、1027.5μg/L，表明HBZHX-21和HBXY-36为不产毒菌株，HBHA-1-4和GDZJ-6等为弱产毒力菌株，HBHA-8-17和GDZJ-108-19等为强产毒菌株。
第三步，鉴别结果评判：待鉴别菌株中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量越高，则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强。按上述技术方案测定HBZHX-21、HBXY-36、HBHA-1-4、GDZJ-6、HeNZY-2、HuBha-24、JSnt-1、HuNdx-7、GDZJ-108-19、HBHA-8-17等10株菌的AFT-YJFZP008含量的结果——每毫升培养基中依次含有AFT-YJFZP008量为：0ng、0ng、7.8ng、11.2ng、43.7ng、51.5ng、99.4ng、109.0ng、166.5ng、562.3ng，结果同样表明：HBZHX-21和HBXY-36为不产毒菌株，HBHA-1-4和GDZJ-6等为弱产毒力菌株，HBHA-8-17和GDZJ-108-19等为强产毒力菌株。该测定结果与上述公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》公布的菌株产毒力强弱次序一致，且强产毒力菌株与弱产毒力菌株鉴定结果与文献一致，证明本发明提供的技术方案可以用于鉴别黄曲霉毒素的菌株产毒力，方法简便、易操作，实用性强。
实施例6利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008鉴别农田中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：选取吉林、辽宁、江西、福建等花生花期根际土壤样品共4份，依次命名为土样-1、土样-2、土样-3、土样-4。依次称量待测的农田土壤样品，粉碎后转移至无菌水中，浓度0.5g/mL,室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散样品均匀分散液液。取50μL土壤稀释液加在含30mL常规沙氏液体培养基中，置于28℃下200rpm震荡培养，培养24h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体溶解在常规的ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0μg/mL的包被液，再以200μL/孔加入至96孔酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，每孔加300μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述待测液体适当稀释，再每孔加入200μL，或者每孔加入200μL系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液(浓度为0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3、30、300ng/mL，用于获得标准曲线)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体适当稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体按说明稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并基于标准曲线计算AFT-YJFZP008含量结果。
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述技术方案测定土样-1、土样-2、土样-3、土样-4中AFT-YJFZP008含量结果——每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量依次为：0.2ng、0.1ng、10.6ng、19.2ng。该结果表明，土样-1和土样-2中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量均在1.0ng以下，不含黄曲霉毒素的强产毒力菌株，其相应农田中花生产后污染风险很低；土样-1和土样-2中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量均在10ng以上，含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，其相应农田中花生产后污染风险较高。
实施例7利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008鉴别农产品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：选取花生、玉米、大米、小麦等农产品样品共4份，依次称量待测的农田土壤样品，粉碎后转移至无菌水中，浓度0.5g/mL,室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取100μL样品均匀分散液加在含50mL常规沙氏液体培养基中，置于28℃下200rpm震荡培养，培养6h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体溶解在常规的ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0μg/mL的包被液，再以200μL/孔加入至96孔酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，每孔加300μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述待测液体适当稀释，再每孔加入200μL，或者每孔加入200μL系列浓度(浓度为0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3、30、300ng/mL，用于获得标准曲线)的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液(用于获得标准曲线)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体适当稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体按说明稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取，并基于标准曲线计算AFT-YJFZP008含量结果。
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述技术方案测定的花生、玉米、大米、小麦样品中AFT-YJFZP008含量结果——每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量依次为：10.2ng、12.6ng、0.4ng、0ng。该结果表明，花生和玉米样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量均在10ng以上，其含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，污染风险较高；大米样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量在1.0以下，不含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，污染风险很低；测定的小麦样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量为0，不含有黄曲霉毒素产毒菌株，基本无黄曲霉毒素污染风险。
实施例8利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008鉴别饲料中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：从市场上选取待测饲料样品共4份，依次命名为饲料-1、饲料-2、饲料-3、饲料-4。依次称量待测的饲料样品，粉碎后转移至无菌水中，浓度0.5g/mL,室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取50μL样品均匀分散液加在含30mL常规沙氏液体培养基中，置于28℃下200rpm震荡培养，培养24h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体溶解在常规的ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0μg/mL的包被液，再以200μL/孔加入至96孔酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，每孔加300μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述待测液体适当稀释，再每孔加入200μL，或者每孔加入200μL系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液(浓度为0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3、30、300ng/mL，用于获得标准曲线)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体适当稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体按说明稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算AFT-YJFZP008含量结果。
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述技术方案测定饲料-1、饲料-2、饲料-3、饲料-4中AFT-YJFZP008含量结果——每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量依次为：0.5ng、20.3ng、14.2ng、72.9ng。该结果表明，饲料-1样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量在1.0ng以下，不含黄曲霉毒素的强产毒力菌株，其污染风险很低；以50μL样品均匀分散液加在含30mL培养基中为例，饲料-2、饲料-3、饲料-4中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量均在10ng以上，含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。
＜110＞ 中国农业科学院油料作物研究所
＜120＞ 一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子及其用途
＜160＞ 1
＜210＞ 1
＜211＞ 18499
＜212＞ PRT
＜213＞ 黄曲霉
＜400＞ 1
ALAALASERL EPRALASERP HESERGLYPH ELYSALAPHE ASPSERSERP HEPRLEPRLY 60
SALAPHEPRA SNALAPRASP LYSALAGLYV ALILEPRGLS ERLEHISGLN ASPTHRVALG 120
LYTHRPHEGL YLYSALAILE HISASPGLVA LSERPRVALG LYASPTHRAS PALALELEGL 180
ARGALAILEA SNASPTYRIL EASPSERGLN LEASPLYSAL ALELEPHEGL YALAALAGLY 240
SERALAGLAS PPRVALVALV ALLYSALALE THRASNGLYA LAGLYALAIL ELYSALALEV 300
ALSERHISAS PGLYTHRPHE VALALAASPA LALYSALAAS NASNTYRCYS SERASNGLNV 360
ALGLGLYPRT YRSERLETYR SERGLYARGA LAPRVALVAL GLNTYRALAL EASNARGALA 420
SERMETVALT RPGLGLALAG LNGLNVALSE RGLYLYSALA SERPRSERTY RLETHRALAT 480
HRPRARGALA VALGLGLNSE RLEASPALAI LEARGALAVA LGLYGLNALA THRGLARGAL 540
AVALILETHR ASPILEVALA SNGLNGLNAR GALAVALSER PRSERPHEGL ASPVALTRPS 600
ERGLNPRARG ALATYRGLNG LYTYRPHEHI SSERASNASP ASPLELEASN ARGCYSASPV 660
ALALATHRTH RASPVALTYR TYRSERGLYL YSCYSVALTH RALAPRSERG LYPRCYSGLY 720
GLNLYSCYST YRALALEVAL ASNHISGLPH ESERARGASP ALAASPALAC YSASNGLYGL 780
YGLYILEGLT YRASPSERPR ALAASPTHRP RLEGLPHELY SASPALAGLY SERPRLYSPR 840
VALVALGLNI LEGLYHISGL GLYASPVALG LYVALALAGL ILEGLNASNM ETARGASPAL 900
AGLYTYRGLT HRSERILETH RASPTYRTRP GLYARGASPA LAVALTYRAL ALEASPALAI 960
LETYRGLYIL EASPALAARG ASPGLARGAL ASERLEASPV ALGLPRSERL EPRTRPPRAS 1020
NASPGLYILE PHEARGTRPA RGASPPHEPH EASNHISVAL THRILELYSA SPPHEGLYTR 1080
PASPSERALA PHEASPGLNL YSGLYASNSE RLEGLYLECY SLEPRTHRAS PPHELYSASP 1140
PHEPRCYSAS PVALGLNARG PRPRASPLEA LAALAASNAS PALALYSASP PHETHRASPI 1200
LETHRALAGL YSERSERILE GLYCYSASPG LYVALASNPR GLNTHRGLYL YSASPGLYAL 1260
AGLYGLNMET PHEILEPRLE ASNPRASNAL ATYRSERPRA SNTHRLEASN LYSASPGLYA 1320
SPLEVALTHR GLNGLNASNG LLEGLNGLYL YSASPLEASP GLNASPILEG LLYSLYSASP 1380
LEASNASPGL YGLYSERSER VALGLYVALG LNASNARGLY SASPLEASNP RASNGLYSER 1440
GLNPHEILET HRPRGLYGLY LYSASPLEPR TRPTYRGLNC YSASNGLNGL ILEHISTHRL 1500
EVALSERGLY LELEARGARG ASPASNILEL EPRGLASNLE ASPASPGLYL EPRSERGLNP 1560
HEVALTYRGL LYSASPASNT HRCYSASNAL APRILEPRVA LSERPHEPRV ALALAPRTHR 1620
ASPTHRLYSA SPPRPHELYS ALAILEILET HRLESERALA ARGLEASPTH RPHEALATHR 1680
ILEASNTHRL EPHELYSASP PRPRILEASN METGLYPRIL EPRALATHRT HRASPLETHR 1740
ASNMETASPA RGARGASPPR TYRMETPHEH ISGLNALAAS NLEARGASPG LNCYSASNTY 1800
RSERLEGLNT YRTHRILEGL YASNLYSASP GLNGLLYSAR GGLNARGASP GLNILEILEG 1860
LCYSARGASP THRLEVALIL EPRPRGLYSE RARGASPTHR SERLECYSPR METALAPRPR 1920
ASNSERPHEM ETSERTHRLE PRMETTHRAL AASPPHEARG ASPTHRTHRG LYPHEILEGL 1980
THRASPPRLE LYSASPVALH ISGLYPHEAL ATHRARGASP VALVALGLAL APHEARGASP 2040
TYRALACYSP RTRPASNGLY GLYGLGLVAL SERLELYSGL ALAALASERA LAALALEALA 2100
ALAGLYTYRL YSGLALAGLY LEVALPRPHE GLNVALSERP RTHRTHRLYS GLGLTYRASP 2160
GLGLYLEARG METVALASNL YSGLYLEALA LYSGLGLYAS NGLSERVALG LNVALPRARG 2220
ASNHISALAL ESERSERASP ARGGLHISHI SGLLEALAIL EALASERLYS GLILEASNGL 2280
NILEGLNARG GLILESERPH EASNGLNALA TRPLEARGGL LESERALATH RVALMETASP 2340
HISLELESER GLNARGGLLE VALLEVALLE GLYARGGLPR GLYALAGLGL YVALCYSGLT 2400
HRTHRPRGLY VALLYSGLPR GLYILECYSG LTHRTHRPRG LYVALLYSGL ARGGLLEASP 2460
SERARGGLSE RGLPHEPHEI LEARGPHEAL ALESERTHRT RPALAARGPH EALAASNGLN 2520
METPRASNGL YCYSGLNASP LEILESERTH RCYSLYSPHE ALASERASPA SPALACYSGL 2580
GLLYSPHEGL GLILEALAPR TYRVALASNG LYLYSARGPH EGLGLYTYRL EPRASPALAA 2640
RGPHEGLASN SERASNVALL YSPHEGLASN SERASNVALL YSSERSERVA LVALARGPHE 2700
GLYLYSPRVA LGLYALAVAL GLYSERALAA LATHRALALE LYSPHEGLYT RPTRPSERAL 2760
AASPGLYALA TRPPRGLYAL ALEASPASPP HEVALVALTR PVALGLNLYS LYSPHEHISA 2820
SPSERSERAS NASPSERGLY ASNARGPHEH ISVALLETHR ALAGLNLESE RPHEPRARGP 2880
HELEASPGLA LALETHRTYR PRPRPRLYSP HEASNSERLE ALAASPARGP HEGLNTYRPR 2940
GLYASPLEPH EASPGLNGLY THRTHRILEA RGPHESERSE RCYSSERGLY THRARGPHES 3000
ERTHRVALAL AGLYSERARG PHESERVALA LAGLILELEP RGLYALALYS PHEVALGLYG 3060
LYALASERTH RASPALAPHE ALAASPPRLY SPHEVALTHR ASPASNGLYA SPSERLYSGL 3120
YALAASPARG GLYARGGLYA SPALAGLYSE RPRVALPHES ERPRASPSER LYSGLYPHEP 3180
HETHRALAPR GLYARGGLYG LYGLYGLYGL YTHRPHEGLY VALVALMETG LSERTHRHIS 3240
ARGGLYGLYS ERGLYALALE GLYLEALAPH ESERGLALAL YSGLYILEAS PVALALALYS 3300
PRTHRGLYAR GGLYILEGLN ILEASNASPP RSERILEASN ASPASPSERV ALMETILETY 3360
RALAPRALAV ALARGGLYLE ARGASNSERG LYVALHISGL YTHRPHESER SERARGPRGL 3420
GLNGLGLILE GLNLYSGLYL ETYRALAGLY HISARGGLYP RLEASNGLGL YGLYLETYRA 3480
LAGLARGGLY GLNTHRPRLE PRILELEVAL ALAASPGLYA RGGLYSERAS PCYSSERTHR 3540
THRALAGLYG LYCYSCYSGL YGLYTHRGLY CYSGLNPRAS NGLTHRLEVA LPHEGLYSER 3600
SERASPLEAL AARGGLYVAL ASPPHETHRG LASPPRLELE GLNGLYARGG LYVALGLYSE 3660
RASPALATRP THRVALSERG LSERGLYARG GLYVALLEAR GPRVALSERT HRGLYSERAR 3720
GGLYVALTYR ASPILEARGG LYTYRLYSPR SERALASERS ERGLYSERLY SGLYTYRPRT 3780
HRSERGLNGL NASNTRPVAL GLYTHRLELE LEPRARGHIS ALAGLYGLNC YSGLYGLTYR 3840
HISGLASNLY SHISPHEGLN LEILEASNTH RALAALATYR TRPLYSHISP HETHRSERLE 3900
GLGLLYSHIS PHEVALASPT HRPHEGLYLE HISGLYHISL YSHISGLYGL YPRASNPHEG 3960
LGLNLEPRIL EASNGLNPRA RGHISLEPHE GLYLEHISAR GHISTHRASP TYRSERSERG 4020
LNGLSERTHR SERTYRLYSH ISVALASPGL YPHEGLYILE HISTHRPHEA RGHISVALTY 4080
RASPALAVAL GLNASPLYSI LEALAPHEAL ASERTYRLEG LGLTYRALAA RGILEALAPR 4140
GLNPHEGLYA SPLELYSILE ALASERLEAS NASPSERTYR GLTHRLELYS LYSARGILEP 4200
HEARGLELEG LYTHRPRASP GLASPSERTR PPRGLYVALT HRSERPHEPR ASPTYRLYSI 4260
LELEPHEASP SERASNASNV ALALATHRGL YVALGLNVAL SERTHRGLYG LYTHRPHEGL 4320
YTHRARGILE ASNPRHISGL LESERILEAR GASPPRASPP HETYRASNGL ILETYRVALT 4380
HRGLSERLYS ARGILEGLNA LAPHEVALIL ETYRPRGLAS NPHEASPLYS ILESERALAT 4440
YRVALGLGLY SERSERARGI LESERHISHI SALAGLNTHR LELEGLGLYL EGLYTHRHIS 4500
ARGTYRLEGL SERCYSTHRG LARGILESER TYRLYSGLPR GLYILECYSG LTHRTHRPRG 4560
LYVALLYSIL EVALPRGLGL TYRVALPRIL ETHRLYSILE VALGLNVALG LYASPLEARG 4620
ILEVALTHRP RASPGLYLYS ILETYRASPS ERILETYRVA LARGLYSALA LYSGLSERSE 4680
RSERGLSERS ERASPSERSE RGLSERGLSE RGLSERGLSE RGLASPGLLY SLYSPHETHR 4740
ASPTHRPRVA LLETYRGLYP RLYSLYSMET GLASPASPLE ARGLYSPRLE GLYTHRGLYT 4800
HRASPLETRP PRLYSLYSTH RLELEPHETY RALASERSER HISGLALAIL ESERPHEASP 4860
SERCYSARGL YSTHRSERSE RSERTHRALA THRSERTHRS ERTHRSERTH RGLYALAALA 4920
ALALEPRTHR ALAALAPHEG LYALAVALGL GLYGLYLEME TLEGLYVALV ALLEGLYVAL 4980
LEGLYLELEA SPARGPRPRV ALILEPRLEP RPRSERASPS ERASPVALTH RALAPHEARG 5040
LEGLGLLEAS NGLNARGLEG LGLNTYRARG METGLNLESE RGLYLELESE RGLNASNGLY 5100
GLNGLYSERL YSLEPHESER ILEPRALAAS PALAGLYASP ASPTYRLYSP RLYSLEPHES 5160
ERTYRLEASP THRGLNLEAS NARGLEPHET YRASNSERLE THRPRALAGL GLNGLNPHEV 5220
ALVALASPAL AILEARGLEL YSASPLEVAL LESERLELEA SNLESERSER PHEASPALAS 5280
ERGLYTYRIL EASPARGLEA SNTHRGLYAL AVALILEPRV ALLEVALARG LEPRASPILE 5340
CYSASNTHRC YSPHELYSLE SERGLNLEGL SERGLYLYSL ESERSERILE ALALEPRARG 5400
LETHRASPLE GLILEASNAR GLETHRGLYA SNLEGLYGLY GLASPTYRGL NASPLYSMET 5460
PRMETPRILE LEVALALAAS PGLYARGASN ALAGLYILEG LNTHRSERAR GASNALAHIS 5520
GLYGLNGLIL ELELEARGAS NALALEGLNT HRMETTYRAS PTHRGLNASP LYSASNASPP 5580
RVALALAVAL PHEASPGLYS ERVALILEPR LYSASNPHEA SPASNASPGL NHISARGASN 5640
PHEGLNGLLE PHEGLYILEL YSASNGLYAS PGLNSERPRP RSERALALEG LYPRLEPRSE 5700
RVALILEGLA RGASNHISAS NVALLESERA LAILEPRGLN GLPRTYRARG ASNHISTHRA 5760
LAGLYILEGL ALAARGASNL EGLTHRGLAR GGLNLEARGA SNLEGLVALL ESERLETHRL 5820
YSASNLEVAL GLYTHRSERG LYPHETHRSE RALAARGASN ASNVALILEI LEGLNLEASN 5880
ARGASNPRAS PLESERSERT HRSERASPTH RTHRASPVAL ILEARGASNS ERILELEGLG 5940
LYPRASPVAL LYSASNSERV ALVALGLYIL ELYSPRTHRV ALGLYLETHR SERARGASNV 6000
ALGLYLEVAL SERVALSERL EASPGLYLYS ASNVALLEAS PTYRGLYALA ARGASNVALV 6060
ALLEASPTHR THRALALESE RALAASNTHR LYSASNTRPH ISARGLESER PHETHRTYRA 6120
SNCYSTHRPR SERALAASNT YRGLNTYRIL EPRALATYRL YSASNTYRPH EALAGLTHRG 6180
LGLNVALMET PHEGLNPRGL YHISILEVAL ARGASNTYRI LEVALVALAS PALAASPSER 6240
SERPRLEGLN ILEVALILEA SPGLYPHEAR GPRPRMETGL ASPILEVALS ERPRTHRLEG 6300
LASPLEILEH ISLEALALEA RGARGPRPRG LNPRASPGLY ALATHRCYSI LELYSGLYAS 6360
NGLCYSGLAL APHECYSVAL ASPGLYVALC YSLYSPRGLN GLYASPPRLY SPRGLNSERI 6420
LEASPTHRIL EVALGLYTHR ASNLEHISME TASPILELES ERASPLEALA ALAALALEAL 6480
AGLYSERILE GLYVALALAP RSERSERASN LEASPPRTHR ARGLYSPRVA LALAASPALA 6540
ALAVALVALA SNALACYSGL SERPHEPRLE SERPHEASPT HRASPVALSE RARGARGPRT 6600
RPVALGLYGL YGLNILEVAL ASNSERILEP RALASERVAL GLLYSILEAL AVALLEGLGL 6660
NVALARGGLN ASPGLYHISP HESERVALPR SERTYRALAG LYHISVALAL ATHRMETTHR 6720
SERVALSERL EARGARGGLN ASPLEPHEGL ALAILEGLAL AGLYARGGLN ILEGLNTHRS 6780
ERARGGLNLE PRPRSERLEP RTYRTHRPHE TYRTHRSERT YRTHRSERGL ASPSERTYRL 6840
YSLYSGLNLE SERGLASPGL YVALASPVAL VALVALVALA LAGLARGARG ASPGLGLHIS 6900
GLNLEASPAS PASPPHEGLG LYILEASPAS PGLMETASPG LSERGLNSER ARGARGPRAS 6960
PLESERTHRP HEPHEALATH RLESERGLIL ESERPRASPG LALAARGARG PRPHEILEIL 7020
EALAARGARG PRGLYASPAR GSERHISSER ARGSERALAA LAALALESER THRSERGLLY 7080
SSERALAALA ALALESERTH RSERGLLYSA SPTRPLEGLN VALARGSERA LAALAASPGL 7140
YLEALASERA LAILETHRSE RLYSSERALA GLYTYRTHRP RLELYSSERA LAMETTHRLE 7200
PRARGSERAL ATHRVALMET THRTYRTRPL YSTHRGLGLG LYALAPRLEP RGLYCYSPRA 7260
RGTHRTHRLE GLNARGSERA SPASPALAIL ETHRARGTHR ASNPRASPAL ALELYSALAS 7320
ERALAVALPR GLYALASERA LALYSSERGL YASNTYRSER TYRGLYVALA RGSERGLYSE 7380
RSERPHESER SERILEGLYS ERALAILESE RMETSERLYS SERGLYSERV ALALALEGLY 7440
LYSSERHISL ESERVALVAL ASPGLYGLYG LASPGLYGLN ASNILEPRLE HISPRLEILE 7500
GLNPRGLARG SERILEALAV ALLYSALAPR SERPRTHRGL PRGLYSERPR ALASERPRGL 7560
YGLYSERGLN PRARGSERIL EILESERARG METLEVALTH RASPPRLYSS ERLEGLYASP 7620
VALCYSMETA SPLEGLNTHR ILETHRTHRS ERSERASPPR ASPPRLYSAR GSERASNILE 7680
THRGLILELE PRALAGLYTH RPRLEPRGLY THRALAALAT HRALAARGGL NASNPRASNP 7740
RALAALAALA ALASERTHRG LYGLYGLNAS PGLYGLYPRA SNASPALAVA LPRARGSERP 7800
RALAALAVAL GLNGLYILET YRGLYASNAR GSERSERGLL YSPRSERILE THRILEASPG 7860
LYASNASNIL EASNLYSSER SERGLYALAV ALTHRGLYGL NSERTHRARG SERSERGLYT 7920
HRGLYTHRSE RTHRGLYALA ALAALATHRG LYTHRGLTHR ASNALAALAS ERVALALALY 7980
SLEGLNMETG LYVALSERAL AALAGLYILE ALAGLYLEAL ALEGLYILET RPALALESER 8040
SERHISPRIL EGLVALPRVA LLYSSERTHR ASPTHRSERI LEASNVALAR GSERVALTHR 8100
SERGLYPHEV ALASPGLYIL ELYSSERVAL THRSERGLYP HEVALASPGL YILELYSASP 8160
GLYLEARGTH RALALEALAA SPTYRALALE CYSALAGLAL ATHRASNMET CYSARGTHRA 8220
LASERASNPH EASPGLNPRH ISSERASPGL SERALALEGL NHISLEARGT HRALAVALPR 8280
ILEASNGLYP RASPSERPRG LYTHRPRGLG LYVALLYSTH RASPTYRSER VALCYSGLYG 8340
LTHRTHRILE PHELYSTHRG LYTYRVALAS NTYRASNVAL ASPTHRTHRA SNLEARGTHR 8400
ILEPHEGLYT RPASPILEAL AGLGLYGLNL YSTHRILESE RASNVALVAL ASPASNGLLE 8460
ALAARGTHRI LEVALSERPR ASPGLYPHEA SNTRPASPTY RGLYSERTHR ARGTHRLEGL 8520
YILEASPILE ALAARGTHRL ESERTHRASN GLGLGLYTYR GLTHRSERAL AVALARGTHR 8580
METLEVALGL YMETASPVAL THRHISPRSE RPRGLYSERS ERALAASNAL APRSERVALA 8640
LAGLYMETVA LALASERVAL ASPSERTHRL ESERGLNTRP PRALAGLILE ARGVALGLNA 8700
RGTHRASNTH RGLNVALPRA SPALACYSTH RGLNCYSPHE GLNLYSTHRG LNGLYPRHIS 8760
SERTHRPHEA SPARGTHRSE RGLYSERGLY SERSERSERP RGLPRARGTH RTHRASPVAL 8820
GLYTHRPHEG LYGLNLYSTH RTHRGLYALA PHEASPGLSE RGLYPRPRLE SERGLNLYST 8880
HRTHRASNGL YILEVALSER THRASNGLSE RGLYARGTHR THRSERGLNT RPASNVALLE 8940
ASPLELYSTH RTHRTHRLEA SPGLNGLYHI STYRGLNSER ARGTHRTHRT YRASNVALVA 9000
LALAGLNTHR LYSTHRVALA SNVALASNAS NLELYSVALA LALEVALTYR GLYASPARGV 9060
ALALATHRIL EGLYSERALA THRPHEALAA RGVALCYSAS NLEILEGLYL EMETGLYLEA 9120
RGVALASPPH ETYRASNASN LELYSVALGL LEGLNSERLY SVALGLARGT HRGLYTYRAL 9180
AALAPHEARG VALGLSERAL ASERALAASP LEILESERTH RILETHRLYS VALPHEASPA 9240
LAGLYHISTH RVALPRALAP HEGLNPRGLT HRMETPHEAR GVALPHEGLA LAGLYHISGL 9300
VALPRALATY RGLNPRGLTH RALATYRGLI LEPHEHISAR GVALGLYGLG LGLTHRPRAL 9360
ALEVALHISA SPLEASNTHR ALAMETARGV ALGLYPHELE ALASERVALG LTHRPRALAS 9420
ERILEGLALA ALASERGLLE SERLYSVALG LYGLYTHRLE ALATYRVALS ERVALGLILE 9480
GLLYSVALLY SVALGLYTHR ILEILETHRG LYASPPRLEA SPPRPRVALL ELYSVALILE 9540
PRLEGLNGLY CYSASPALAA SPGLTYRGLY ARGVALLELE HISPRLELET HRALAALAAL 9600
ALELEGLYAL ASERALAARG ALAGLNSERV ALVALGLYTH RPRPHEGLYP HEALASERGL 9660
YTHRTHRGLY GLYGLYASNA LAALAPRALA ALAPRLYSVA LASNGLYVAL GLTYRGLYGL 9720
THRARGVALG LNLEASPGLG LYLELYSARG VALSERILET RPTHRGLSER TYRGLYGLYA 9780
RGVALSERAS NASPLEALAA RGVALSERGL NILESERGLY ASNARGPRLE ASPALALEAS 9840
PGLNGLYTHR ARGVALSERT YRTHRGLTYR ASPSERTYRT YRASPHISTY RASNLYSVAL 9900
THRASNSERP RSERASNLEV ALTRPTYRSE RILESERTHR ARGVALVALA LAVALASPTH 9960
RALASERASN LYSVALVALA SNTYRTYRSE RASPASPPRT HRGLYMETSE RASPSERGLY 10020
GLASPALAPH EASPMETARG LYSVALTYRA LATHRPRASP GLNASPILEG LHISGLYARG 10080
TRPASNGLTH RILETYRVAL ILEILETHRS ERPHESERAS PTHRLETHRI LEGLNPRTYR 10140
ASPTRPASNG LPHEARGLYS TRPASNPHEI LEMETASNSE RARGTRPARG HISTYRTYRL 10200
EARGTYRALA GLYGLTYRGL PHEGLNALAA SPLEPHELYS TYRCYSALAS ERALAGLNGL 10260
ASPASNALAT HRLEGLNALA LELEARGTYR ASPLEASNLE GLASNLYSTY RGLYPRSERP 10320
HETHRALAPH EPHEGLNGLG LNASNGLLYS TYRLYSGLPR GLYALAGLGL YVALCYSGLT 10380
HRTHRPRGLY VALLYSTYRL EALASERTHR GLNMETGLPR THRASPALAA RGTYRLEASP 10440
GLNGLNILET HRALAGLTHR LYSTYRLEAS PTHRLEPRGL ILELYSTYRL ETHRASNSER 10500
GLNALALEAL AASPLEPRTY RPHEALAGLL YSTYRLEVAL ASPGLNLEAS NPRGLGLYLY 10560
STYRGLNGLY ALASERGLNC YSPRPHEARG TYRGLNPRHI STHRVALTHR THRVALSERA 10620
LAGLYALASE RASPPRARGG LYSERPRGLG LYGLYGLYAR GTYRVALASP ALAGLYGLYP 10680
HEGLPRSERI LELYSTYRVA LTHRSERASN ALAVALSERV ALGLYVALTH RHISPHEALA 10740
GLYSERARGA LAALAALALE ALAGLLEVAL TRPSERGLYA SNARGALAAL AALAPRLYSS 10800
ERALAALALE ASPALALEGL NGLNSERILE TYRLEGLNPR LYSALAALAT HRTYRCYSPR 10860
GLASNILEGL LYSALAGLAS PTYRLELEAS NPRSERPRLY SALAGLHISC YSPHEASPTY 10920
RASPLESERT YRLYSPRALA ASPLYSALAG LASNGLNALA VALALAVALG LYARGALAGL 10980
YALAVALALA ALAVALVALT YRASNASNGL LYSALAGLYL YSPRTHRLEG LYPHELEASN 11040
PRLELETYRS ERGLYALALE LYSALAGLYS ERSERPRTHR ASPILEILES ERGLYILESE 11100
RASPLYSALA ILEHISASPG LVALSERPRV ALGLYASPTH RASPALALEL EGLARGALAI 11160
LEMETGLYAL AGLGLALAAL ALYSALALES ERGLMETILE LEGLNSERGL LYSALALEVA 11220
LGLGLYSERT HRPHEALALY SALALETYRS ERSERALAAL ATHRGLYTHR TYRALASERS 11280
ERTHRTHRVA LTYRLYSALA ASNGLGLNPR THRTRPVALT YRARGALAAS NPHEGLVALG 11340
LTHRPRARGA LAASNASNTY RCYSSERASN GLNVALGLGL YPRTYRSERL ETYRSERGLY 11400
ARGALAPRVA LVALGLNTYR ALALEASNAR GALAGLNASN ASPPRASNAL APHEGLYVAL 11460
VALALAALAA RGALASERAL AILEGLNLEA SPGLYILEIL ETYRARGALA SERMETVALT 11520
RPGLGLALAG LNGLNVALSE RGLYLYSALA SERASNSERL EGLNTYRVAL ASNVALGLNV 11580
ALLYSALATH RGLYASPVAL LEPHEASNTH RLYSALAVAL GLYGLNALAT HRGLARGALA 11640
VALHISGLAS PLEASPVALA LAALAILEAS PALAALAGLV ALARGALAVA LLELELEASP 11700
GLALAASPVA LPHEMETGLG LARGALAVAL SERPRSERPH EGLASPVALT RPSERGLNPR 11760
ARGCYSGLNS ERVALPHEAS NPRASNILEP RLYSASPALA TYRSERPRHI SGLILETYRS 11820
ERARGASPPH ETHRASPILE THRALAGLYS ERSERILEGL YCYSASPGLY VALASNPRGL 11880
NTHRGLYLYS ASPGLYLEGL GLYSERPHEL YSASPLYSAS PPRGLLYSAS PPRLYSALAI 11940
LEGLLEPRAR GASPGLNILE ILEGLCYSAR GASPSERGLY LEVALMETLY SASPSERPRL 12000
ETYRPRTYRA RGASPVALHI SGLYPHEALA THRARGASPV ALLYSSERME TLYSASPVAL 12060
VALVALVALG LYGLYGLYAL ASERGLYALA TYRALAALAV ALARGASPTY RGLNVALGLM 12120
ETVALASNLY SGLALAGLYL EVALPRPHEG LNVALSERPR THRTHRLYSG LGLPRSERPH 12180
EGLNPRASPA SPVALTHRLE LELESERGLN ASPPRGLYHI STRPGLLYSG LGLYILESER 12240
ILEHISTHRC YSASPGLNAR GGLHISHISG LLEALAILEA LASERLYSGL ILEPRVALGL 12300
YTYRSERALA ALAASPILEA SPTHRASNAR GGLLEASPTH RGLNHISILE HISPRPRASP 12360
SERTYRPHEV ALSERPRLET HRARGGLPRG LYILECYSGL THRTHRPRGL YVALLYSGLP 12420
RSERASNASP PRASNPRPRG LTHRTYRSER LYSGLSERLE GLASPILEAR GLYSGLTYRL 12480
EVALALAASN GLYVALGLNA LAGLNALALE VALPRLYSPH EGLPRPRALA VALTYRASNA 12540
SPGLLELYSP HEGLYALATH RGLYASPGLT YRARGPHEGL YLYSPRVALG LYALAVALGL 12600
YSERALAALA THRALALELY SPHELEASPG LALALETHRT YRPRPRPRLY SPHEASNVAL 12660
ASPGLTHRAL APHETHRGLY ALATRPGLYA RGPHEARGGL NASPLEILES ERGLILELYS 12720
PRCYSCYSGL GLLYSPHETH RALAVALPHE THRPRSERIL EVALGLARGP HETHRASPTH 12780
RPRVALLETY RGLYPRLYSP HEVALTHRAS PASNGLYASP SERLYSPHEV ALTHRASNME 12840
TGLNALAALA LELELYSGLY PHEPRASPVA LALAALAHIS SERLETHRPR ARGGLYGLYS 12900
ERILELEPRM ETGLNGLVAL ALALETHRTH RARGGLYILE ASPVALALAL YSPRTHRGLY 12960
ARGGLYILEM ETLEASPTHR GLYARGGLYL YSGLSERCYS LYSGLYLETY RALAGLYHIS 13020
ARGGLYMETV ALPHESERIL EASPALAGLN GLYGLLYSGL YPRALAARGA RGARGGLYGL 13080
NLEGLYPHET RPGLYASNLY SGLYSERILE VALGLYPRAR GTRPLYSLEP RPHEMETGLY 13140
PRPHELEGLN SERVALASNP RLYSGLYTHR VALPHEPRSE RGLTHRGLGL YGLSERMETA 13200
LASERARGGL YVALASPPHE THRGLASPPR LELEGLNGLY ARGGLYVALL YSILESERGL 13260
YTRPASPVAL GLTHRLEGLY ASPGLILETH RHISVALGLY GLLYSPHETH RLYSGLYTYR 13320
LYSPRSERAL ASERSERGLY SERLYSHISA LAGLYGLNCY SGLYGLTYRH ISGLASNLYS 13380
HISPHETHRS ERLEGLGLLY SHISPHEVAL ASPTHRPHEG LYLEHISGLY HISLYSHISG 13440
LYGLYPRASN PHEGLGLNLE PRILEASNGL NPRARGHISG LYILEPRGLY GLYGLYILEA 13500
LATHRGLYAL AGLGLYILEL YSHISMETPH EGLYLEVALA LASERGLASP ALAGLYARGH 13560
ISPRVALGLV ALALAGLGLG LALASERLYS PRLYSHISVA LASPGLYPHE GLYILEHIST 13620
HRPHEARGHI SVALGLNLEL EGLNLEASNM ETGLTYRASP ASPASPILEL ECYSARGLYS 13680
SERLYSHISV ALTYRASPAL AVALGLNASP LYSILEALAP HEALASERTY RLEGLGLTYR 13740
ALAARGILEA SPALATHRTH RASNPRGLYM ETARGILEAS PTYRILEGLY GLYGLYASPL 13800
EPHEARGILE GLILEGLASN SERILEARGI LEGLASNGLN SERASPALAA SPGLYTYRSE 13860
RSERCYSSER THRLELYSIL EPHEGLGLNL EGLGLYMETS ERLESERLYS ILEPHESERT 13920
YRLYSMETAS NSERTHRLEA RGTYRLEPRP HEARGILEGL YLEHISPHEA RGTHRARGIL 13980
EHISLETHRV ALPRGLASPL EARGILEGLN ASPGLYSERG LNVALLYSIL EGLNGLYILE 14040
SERASNPRSE RGLYALALES ERSERGLYGL YLEGLYGLPR LYSILEGLNS ERLYSLEARG 14100
GLYLEVALGL NARGILEARG ASPALAMETA RGGLNARGIL EARGLEHISL EGLARGTHRG 14160
LYGLNLEGLY VALGLYSERA SPGLYASNPR VALVALALAG LYARGILESE RALATYRVAL 14220
GLGLYSERSE RARGILEVAL PRGLGLTYRV ALPRILETHR LYSILETYRS ERPHEPHEVA 14280
LGLYGLYALA VALPRGLASN LEARGILETY RVALTHRGLY GLSERTYRAL AGLYARGLYS 14340
ASPILEARGH ISGLYHISLY SLYSGLHISA SPLYSSERLY SPHETHRASP THRPRVALLE 14400
TYRGLYPRLY SLYSGLYASP ALAPRTHRIL EASPTHRSER ASNTYRPHEL EPHEGLYLYS 14460
LYSMETGLAS PASPLEARGL YSTYRTHRVA LPRSERTHRC YSGLYVALLY SLEGLMETTY 14520
RGLNGLYGLY ILEGLLESER ALALELEGLN METILEGLNA SPALAILEAR GLEPHESERT 14580
YRLEASPTHR GLNLEASNAR GLEGLYILET HRTYRTHRTH RTYRSERLYS LELYSASPLE 14640
VALLESERLE LEASNALALE GLNGLYGLYA RGLEASNTHR GLYALAVALI LEPRVALLEV 14700
ALARGLEASN VALILEASPP HEPRLYSLEG LNVALARGAL AALAALAARG ARGLESERAL 14760
AGLYSERARG LESERGLLEG LTRPILEARG LESERGLNLE GLSERGLYLY SLESERSERI 14820
LEALALEPRA RGLETHRASP LEGLILEASN ARGLEVALAL AHISSERVAL ALATHRTYRA 14880
LAARGLEVAL CYSPHEPHEP RTHRLYSLEV ALGLNASNAS PPHEASNTHR LELEARGMET 14940
ALAPRMETSE RGLGLASPLE ALATRPPHEA RGSERTHRPH EHISPRILEP RLYSMETGLY 15000
SERLESERAS PVALARGMET LYSSERILEG LGLLYSGLYG LGLYMETTHR ASNASPTYRI 15060
LESERALALE THRLYSASNA LAPHEILETH RASNTYRPRS ERGLGLNARG ASNALAGLYI 15120
LEGLNTHRSE RARGASNPHE SERARGPRLY SASNHISGLY THRSERTHRV ALALAPRGLN 15180
VALGLNALAS ERVALTYRAR GASNHISASN VALLESERAL AILEPRGLNG LPRTYRARGA 15240
SNILEASNME TLELETYRGL YTHRASPASP CYSSERGLYL YSASNLEASP GLLETRPILE 15300
VALGLYHISG LYALAVALAL AARGASNLEV ALGLYTHRSE RGLYPHETHR SERALAARGA 15360
SNMETHISAS PVALILEGLY ASNASPGLYT HRVALPRSER GLPHEARGAS NASNVALILE 15420
ILEGLNLEAS NARGASNSER METTHRASPC YSCYSILEGL THRTYRLEME TLYSSERGLA 15480
RGASNTHRLE ALAPHEPHES ERGLYASNGL VALILEASNA SPGLYPRSER SERLYSASNT 15540
HRPRVALPRS ERCYSPHEHI SPHEPHEILE TYRLYSGLYC YSTRPMETPH ELETYRARGA 15600
SNTYRPHEAL AGLTHRGLGL NVALMETPHE GLNPRGLYHI SILEVALARG PRASPGLYTH 15660
RGLYPHEARG LYSPRLETRP ARGHISTYRP HEGLNASNTH RGLNGLYILE ILEPHEVALV 15720
ALASPSERAS NASPARGPRV ALVALGLNVA LLEMETPRGL GLYMETASPS ERASPGLSER 15780
GLNALAILEL EASNASNILE GLYALAASPG LYGLNSERAL AGLNGLYALA SERPRGLYVA 15840
LVALILEALA SERPRSERLY SGLNASPLEP HEGLALAILE GLALAGLYAR GGLNTHRTYR 15900
ALASERCYST RPGLYGLYVA LGLYGLNGLY GLCYSARGGL YSERSERASN CYSLYSARGC 15960
YSTRPSERGL YVALPHETYR SERASNTRPI LEGLNGLLEL EARGARGSER METGLYLEGL 16020
SERARGSERA LAALAASPGL YLEALASERA LAILETHRSE RLYSSERALA ILESERGLNT 16080
YRGLYASPSE RPHEALALYS SERALAMETT HRLEPRARGS ERALAVALGL NSERASPVAL 16140
TRPARGSERA SPGLYGLNCY SSERASPLEL ELYSSERASP LYSLEASNVA LILEASPPHE 16200
PRLYSSERAS PTYRASPALA PHEILEARGS ERASPTYRGL NGLCYSALAA SPALAPRGLY 16260
GLNLYSSERA SPTYRSERAL ALEGLNSERG LNGLYLEILE LESERLEARG SERGLMETLE 16320
ALAGLGLNAS PLYSSERGLS ERASNPRGLY VALMETSERT HRARGSERGL YALAASPTHR 16380
HISLYSSERI LEVALILEAR GSERILETYR ALAILEASNS ERGLYARGSE RLEPRLEILE 16440
VALGLYASNS ERASPGLNGL GLYLYSSERG LNSERASPPH EGLSERGLPH ESERTHRALA 16500
LYSSERSERG LYALAVALTH RGLYGLNSER THRARGSERS ERSERALATY RGLSERLETH 16560
RSERALAVAL LYSSERTHRA SPTHRSERIL EASNVALARG SERVALVALG LASNASNASN 16620
ASPGLYLETH RALAALATYR ARGTHRALAL EPHEASPSER HISGLTYRAR GTHRALASER 16680
ASNPHEASPG LNPRHISSER ASPGLSERAL ALEGLNHISL EARGTHRCYS HISARGCYSC 16740
YSTHRTHRPH EALAPRASPA LATHRGLCYS GLASNCYSLY SHISTHRARG THRASPTYRS 16800
ERVALCYSGL YGLTHRTHRI LEPHELYSTH RGLYGLTHRT HRGLNILEHI SALAARGTHR 16860
GLYPRSERIL EGLNASPARG THRILESERA SNVALVALAS PASNGLLEAL AARGTHRLYS 16920
SERLEPRARG THRLEPRPRL EGLNTYRARG ASPLEASPLE LEPRLEHISG LNASNLEILE 16980
LYSTHRLEVA LSERTHRGLY ARGTHRPRAL AALAHISARG ALAARGTHRS ERGLYSERGL 17040
YSERSERSER PRGLPRARGT HRTHRASPVA LGLYTHRPHE GLYGLNLYST HRTHRGLMET 17100
THRGLNARGT HRTHRSERAS NPRGLTHRAR GTHRVALGLY SERSERCYSP RTYRCYSASP 17160
SERGLNALAP RGLNVALARG THRVALASNG LYGLYPHEGL NILEALAARG THRVALASNV 17220
ALASNASNLE LYSTHRVALT YRALAPHEAS PVALSERGLA SPGLYSERTY RLELYSTHRT 17280
YRGLVALVAL GLYASNVALT YRLYSVALAL ALEVALTYRG LYASPARGVA LALAPRASNS 17340
ERGLYALATY RLEASNGLAL AASPPHEARG VALALASERL ELEGLNARGV ALALATHRIL 17400
EGLYSERALA THRPHEALAA RGVALCYSAS NLEILEGLYL EMETGLYLEA RGVALASPAS 17460
NVALVALALA SERPHELYSV ALGLTYRSER ASPALAALAL YSVALPHEGL ALAGLYHISG 17520
LVALPRALAT YRGLNPRGLT HRALATYRGL ILEPHEHISA RGVALGLYSE RILEGLPHET 17580
HRALALEPRG LNLEGLNSER LEASPPHETH RLYSVALILE PRGLILEASP METPRSERHI 17640
SSERSERSER GLYTRPLYSV ALLEASPARG ASPPRASNHI SALALYSVAL LEPHELEGLY 17700
ARGVALLEIL EALAASPMET CYSARGARGV ALLEPRGLNV ALILEGLALA THRASNARGV 17760
ALGLNASNGL YALAVALTHR TRPGLSERAS PPRASNARGV ALGLNASNGL YALAVALTHR 17820
TRPGLSERAS PPRASNARGL YSVALSERAS NASPLEALAA RGVALTHRAL AMETARGTYR 17880
TRPTRPLECY SGLILEALAT YRCYSPHEAL ASERVALGLY GLYLYSVALV ALTHRASPSE 17940
RPHEARGVAL TYRSERVALA SPASNSERLY STRPASPASN LEASPSERAL AALALEASNT 18000
HRLYSTRPPH EALAGLASPP RSERARGTYR CYSALASERA LAGLNGLASP ASNALATHRL 18060
EGLNALALEL EARGTYRCYS GLYVALGLYV ALASNILELE TYRGLARGTY RGLALAALAI 18120
LEGLNGLYVA LALAALATHR ASPLYSTYRP HETYRGLYAS PASNTYRALA THRLEARGTY 18180
RGLYALATYR SERVALCYSS ERPRLYSTYR GLYGLTHRGL LYSSERGLYL EGLSERILEA 18240
LAALAALAAR GTYRILEALA ARGPRASPIL EMETLYSTYR LEASPGLNGL NILETHRALA 18300
GLTHRLYSTY RLEVALASPG LNLEASNPRG LGLYLYSTYR GLNPHEPRGL NTHRPRSERA 18360
RGTYRARGHI SLEPRPRGLT HRVALTHRGL YILELEGLYA RGALATHRPH ETRPTRPILE 18420
ASNSERILEL ELYSTYRTHR ALAGLGLYTY RGLALAALAT HRLYSTYRVA LASPALAGLY 18480
GLYPHEGLPR SERILELYS 18499

Claims (10)

1.一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008，其特征在于：指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.鉴别体系黄曲霉毒素产毒菌产毒力的用途，基于指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的含量检测，进行体系黄曲霉毒素产毒菌产毒力的鉴别，指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力的方法，其特征在于：具体鉴别方法包括：
(1)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体：
(2)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体；
(3)待鉴别菌株的待测液的制备：待鉴别菌株培养，稀释，获得待鉴别菌株的待测液；
(4)待鉴别菌株产黄曲霉毒素能力的测定：
采用间接非竞争双抗体夹心法鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力，步骤包括：a酶标板中包被AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体，洗板；加入封闭液封闭，洗板；b加入待测液反应，洗板；c加入AFT-YJFZP008多克隆抗体反应，洗板；d加入与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的特异性多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；e加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果；
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的步骤(3)为：将待鉴别菌株在常规察氏培养基或者其他适宜菌株生长的培养基培养，培养的环境温度为15～35℃，培养时间不少于12h后，取培养基与培养物的混合体充分匀浆，再用无菌水稀释1-10倍，获得待鉴别菌株的待测液。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的步骤(4)为：
a将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体用ELISA包被缓冲液配制0.2-8.0μg/mL的包被液，再加入至酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
b然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将待测液适当稀释，加入到酶标板孔中，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
c然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的多克隆抗体适当稀释，加入到酶标板孔中，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
d然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记抗体根据需要稀释，加入到酶标板孔中，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
e然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算AFT-YJFZP008含量结果。
6.鉴别样品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株的用途，其特征在于：具体鉴别方法步骤如下：
(1)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体：
(2)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体；
(3)待鉴别样品的制备：待鉴别样品培养，稀释，获得待鉴别样品的待测液；
(4)用于鉴别样品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株：采用间接非竞争双抗体夹心法鉴别样品，步骤包括：a酶标板中包被AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体，洗板；加入封闭液封闭，洗板；b加入待鉴别样品液反应，洗板；c加入AFT-YJFZP008多克隆抗体反应，洗板；d加入与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记的抗体，反应，洗板；e加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果；
(5)鉴别结果评判：
待鉴别菌株中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量越高，则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强，根据上述酶标仪计算结果，获得单位体积待检测样品液中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的含量，判定待鉴别样品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株；
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的步骤(3)为：称量待鉴别样品，转移至无菌水中，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液，取10-1000μL样品均匀分散液加在含6-600mL常规察氏培养基或者其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基中，置于15-35℃下200±50rpm震荡培养，培养6-24h后取样，形成待鉴别样品的待测液；所述的待鉴别样品为土壤、中药材、农产品或者饲料。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的步骤(4)具体步骤为：
a将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体用ELISA包被缓冲液配制0.2-8.0μg/mL的包被液，再加入至酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
b然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将待鉴别样品液适当稀释，加入到酶标板孔中，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
c然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的多克隆抗体适当稀释，加入到酶标板孔中，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
d然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记抗体根据需要稀释，加入到酶标板孔中，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
e然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算AFT-YJFZP008含量结果。
9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的动物源不同。
10.根据权利要求3或6所述的应用，其特征在于：步骤(b)中采用系列浓度梯度的产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液替换待测液或待鉴别样品液，制作标准曲线。
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