CN104569416B

CN104569416B - 检测稻曲菌素b的方法及其专用酶联免疫试剂盒

Info

Publication number: CN104569416B
Application number: CN201510032949.4A
Authority: CN
Inventors: 周立刚; 王保民; 傅小香; 王晓晗; 赖道万; 孙伟波; 王阿利
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2015-01-22
Filing date: 2015-01-22
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2035-01-22
Also published as: CN104569416A

Abstract

本发明公开了一种检测稻曲菌素B的方法及其专用酶联免疫试剂盒。该方法及试剂盒所使用的抗稻曲菌素B的单克隆抗体是由杂交瘤细胞系1B5A10分泌产生的，该杂交瘤细胞株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC？No.10113。本发明所提供单克隆抗体是以稻曲菌素B-BSA溶液为包被抗原，通过间接竞争ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选得到的，特异性强，与稻曲菌素A的交叉反应率为13.91％；利用该单克隆抗体制备得到的间接竞争酶联免疫试剂盒，用于定性或定量检测样品中稻曲菌素B，线性检测范围在2.49ng/mL–107.35ng/mL，具有快速、灵敏的优点。

Description

检测稻曲菌素B的方法及其专用酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测稻曲菌素B的方法及其专用酶联免疫试剂盒。

背景技术

稻曲病(Ricefalsesmut)也叫丰收病、伪黑穗病、绿黑穗病等，是由稻绿核菌(Villosiclavavirens(Nakata)Tanaka&Tanaka)(无性态为：UstilaginoideavirensTakahashi)侵染水稻形成的一种世界性水稻真菌病害。自20世纪80年代以来，由于水稻耕作制度的改变，氮肥的大量施用，以及高产杂交水稻品种的大规模推广等因素，稻曲病的发生及危害呈加重趋势，现已成为中国及世界上多稻区的主要病害之一。稻绿核菌侵染水稻的花丝并在穗部形成稻曲球，造成水稻产量减少和品质的降低。更值得人们关注的是稻绿核菌能产生为害人畜和水稻的毒素，直接影响水稻的生长和食用安全性。迄今，从稻绿核菌(稻曲球)中已阐明的毒素有两类，第一类为稻绿核菌素(Ustilaginoidins)，属于二萘并-γ-吡喃酮类(Bis-naphtho-γ-pyrones)，为脂溶性物质；另一类为稻曲菌素(Ustiloxins)，属于环肽类，为水溶性物质。稻曲菌素具有广泛的毒性，对水稻种子萌发、幼苗以及愈伤组织生长都具有毒害作用；可造成畜禽生长和生殖能力的下降和内脏器官病变；对真核生物微管蛋白组装和细胞骨架的形成具有抑制作用。

基于稻曲菌素广泛的毒性，快速、准确了解稻曲球、稻绿核菌，以及稻草、稻谷、稻米及其制品中稻曲菌素的种类和含量就显得尤为重要。在稻曲菌毒素中，稻曲菌素A(UstiloxinA)的含量和毒性最高，其次就是稻曲菌素B(UstiloxinB)。目前针对稻曲菌素的检测分析主要是关于稻曲菌素A，对于含量和毒性同样比较高的稻曲菌素B的检测分析报道则非常少见。对于稻曲菌素B，可采用高效液相色谱(HPLC)法和液相色谱-质谱联用(LC-MS)法进行分析。由于免疫测定技术具有高通量、快速及灵敏度高等特点，在真菌毒素的检测方面虽已经得到了广泛的应用，但关于稻曲菌素B的免疫检测方法还未见报道，所以建立一种稻曲菌素B的免疫检测方法，进而开发一种基于稻曲菌素B的单克隆抗体的酶联免疫检测方法及其专用酶联免疫试剂盒具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测稻曲菌素B的方法及其专用酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的检测稻曲菌素B的方法及其专用酶联免疫试剂盒所用到的抗稻曲菌素B的单克隆抗体是由小鼠杂交瘤细胞系1B5A10分泌产生的，该小鼠杂交瘤细胞系在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.10113。

由小鼠杂交瘤细胞系1B5A10CGMCCNo.10113分泌产生的抗稻曲菌素B的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。

上述抗稻曲菌素B的单克隆抗体可用于检测或辅助检测稻曲菌素B，尤其适合于检测或辅助检测植物样品中的稻曲菌素B。

本发明所提供的小鼠杂交瘤细胞系1B5A10CGMCCNo.10113或抗稻曲菌素B的单克隆抗体可用于制备检测或辅助检测稻曲菌素B的试剂或试剂盒，特别是用于制备检测或辅助检测植物样品中的稻曲菌素B的试剂或试剂盒。

本发明所提供的检测或辅助检测稻曲菌素B的试剂盒中，含有所述稻曲菌素B的单克隆抗体。

本发明所提供的检测或辅助检测稻曲菌素B的试剂盒中，还可含有稻曲菌素B标准品。

所述稻曲菌素B标准品可为稻曲菌素B或由所述稻曲菌素B配制成的一系列不同浓度的稻曲菌素B溶液；所述一系列不同浓度的稻曲菌素B溶液的浓度具体可为：1.171875ng/mL、2.34375ng/mL、4.6875ng/mL、9.375ng/mL、18.75ng/mL、37.5ng/mL、75ng/mL、150ng/mL和300ng/mL，所述稻曲菌素B溶液的溶剂具体可为水，稀释可用样品稀释液；所述样品稀释液溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄、KH₂PO₄和NaCl、吐温-20和明胶；溶质Na₂HPO₄、KH₂PO₄和NaCl在所述样品稀释液中的浓度分别为0.02M、0.0015M和0.14M；所述吐温-20在所述样品稀释液中的体积百分含量为0.1％；所述明胶在所述样品稀释液中的含量为5g/L。

在本发明所提供的试剂盒中，还可含有独立包装的标记酶；所述标记酶可为辣根过氧化酶或碱性磷酸酶。在本发明的一个实施例中，所述标记酶具体为羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP(购自Jackson公司，商品目录号为79556)。

在所述试剂盒中，还可含有如下1)-5)试剂中的至少一种：

1)包被缓冲液：溶剂为水，溶质为Na₂CO₃和NaHCO₃；所述Na₂CO₃和所述NaHCO₃在所述包被缓冲液中的浓度分别为0.01M和0.04M；pH9.6。

2)样品稀释液：溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄、KH₂PO₄和NaCl、吐温-20和明胶；所述Na₂HPO₄、所述KH₂PO₄和所述NaCl在所述样品稀释液中的浓度分别为0.02M、0.0015M和0.14M；所述吐温-20在所述样品稀释液中的体积百分含量为0.1％；所述明胶在所述样品稀释液中的含量为5g/L；pH7.5。

3)洗涤液：溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和吐温-20；所述Na₂HPO₄、所述KH₂PO₄和所述NaCl在所述洗涤液中的浓度分别为0.02M、0.0015M和0.14M；所述吐温-20在所述洗涤液中的体积百分含量为0.1％；pH7.5。

4)底物缓冲液：溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na₂HPO₄；所述柠檬酸三钠和所述Na₂HPO₄在所述底物缓冲液中的浓度分别为0.01M和0.03M；pH5.5。

5)终止液：2M的硫酸水溶液。

在本发明所提供的试剂盒中，还可含有独立包装的包被原。

所述包被原为稻曲菌素B与载体蛋白的偶联物。在所述包被原中，所述稻曲菌素B与所述载体蛋白的质量配比可为1.15:11.00。

在本发明中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白(BSA)，将相应的包被原命名为稻曲菌素B-BSA包被原。

具体的，所述稻曲菌素B-BSA包被原是按照如下步骤的方法制备得到的：

(a1)将稻曲菌素B溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶液A；

所述稻曲菌素B和所述二甲基甲酰胺(DMF)的比例为2.3mg:1.0mL；

(a2)将牛血清白蛋白(BSA)溶解于PBS溶液中，得到溶液B；

所述牛血清白蛋白(BSA)和所述PBS溶液的配比为11mg:1.0mL；

(a3)将所述溶液A和所述溶液B混合，使混合液中所述稻曲菌素B和所述牛血清白蛋白(BSA)的质量配比为1.15:11.00，得到溶液C；

(a4)向所述溶液C中加入体积分数5％的戊二醛水溶液，4℃过夜偶联，PBS中透析3天，得到所述稻曲菌素B-BSA包被原；

所述体积分数5％的戊二醛水溶液和所述溶液C的体积比为6.8μL:1.5mL。

本发明所提供的检测或辅助检测稻曲菌素B的方法，包括使用所述试剂盒对待测样品(如植物样品)进行检测的步骤。

所述的试剂盒在定性或定量检测稻曲菌素B中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护如下：将所述抗稻曲菌素B的单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂；以所述免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱；含有所述免疫亲和吸附剂或所述免疫亲和色谱柱的试剂盒。

所述免疫亲和吸附剂、所述免疫亲和色谱柱或所述试剂盒在分离纯化稻曲菌素B中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的抗稻曲菌素B的单克隆抗体是以稻曲菌素B-BSA(稻曲菌素B和牛血清白蛋白的偶联物)为包被抗原，通过间接竞争ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选得到的；利用该单克隆抗体制备得到的间接竞争酶联免疫试剂盒，用于定性或定量检测植物样品中的稻曲菌素B，线性检测范围在2.49–107.35ng/mL，具有快速、特异性强和灵敏度高的优点。

保藏说明

参据的生物材料(株)：1B5A10

科学描述：小鼠杂交瘤细胞系

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2014年12月05日

保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.10113

附图说明

图1为稻曲菌素B抗原合成过程示意图。

图2为间接竞争ELISA中稻曲菌素B的标准曲线。

图3为稻曲菌素B的HR-ESI-MS谱图。

图4为稻曲菌素B的¹HNMR谱图(D₂O,400MHz)。

图5为稻曲菌素B的¹³CNMR谱图(D₂O,400MHz)。

图6为稻曲菌素A的HR-ESI-MS谱图。

图7为稻曲菌素A的¹HNMR谱图(D₂O,400MHz)。

图8为稻曲菌素A的¹³CNMR谱图(D₂O,400MHz)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

弗氏完全佐剂：Sigma公司，产品目录编号为F5881。

弗氏不完全佐剂：Sigma公司，产品目录编号为F5506。

稻曲菌素B和稻曲菌素A(标准品)：由发明人所在实验室分离并纯化得到。可具体参考发明人所发表的如下论文：

ShanT,SunW,LiuH,GaoS,LuS,WangM,ChenZ,WangS,ZhouL.DeterminationandanalysisofustiloxinsAandBbyLC-ESI-MSandHPLCinfalsesmutballsofrice.InternationalJournalofMolecularSciences,2012,13(9):11275-11287.

ShanT,SunW,WangX,FuX,SunW,ZhouL.PurificationofustiloxinsAandBfromricefalsesmutballsbymacroporousresins.Molecules,2013,18(7):8181-8199.

包被缓冲液：溶剂为水，溶质为Na₂CO₃和NaHCO₃，pH值为9.6；溶质Na₂CO₃和NaHCO₃在包被缓冲液中的浓度分别为0.01M和0.04M。

洗涤液：溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和吐温-20，pH值为7.5；溶质Na₂HPO₄、KH₂PO₄和NaCl在洗涤液中的浓度分别为0.02M、0.0015M和0.14M；吐温-20在洗涤液中的体积百分含量为01％。

样品稀释液：溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄、KH₂PO₄和NaCl、吐温-20和明胶，pH值为7.5；溶质Na₂HPO₄、KH₂PO₄和NaCl在所述样品稀释液中的浓度分别为0.02M、0.0015M和0.14M；所述吐温-20和明胶在所述样品稀释液中的百分含量为0.1％(体积分数)和0.5％(0.5g/100mL)。

底物缓冲液：溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na₂HPO₄，pH值为5.5；溶质柠檬酸三钠和Na₂HPO₄在底物缓冲液中的浓度分别为0.01M和0.03M。

终止缓冲液：浓度为2M的硫酸水溶液。

实施例1、稻曲菌素B抗原的合成

按照如下方法合成稻曲菌素B-OVA免疫原和稻曲菌素B-BSA包被原：

称取2.3mg稻曲菌素B溶解在1mL二甲基甲酰胺(DMF)中，称取11mg牛血清白蛋白(BSA)和7.5mg卵白蛋白(OVA)分别用1mLPBS溶解，然后将稻曲菌素B溶液分成两等份(500μL/份)分别加入到BSA溶液和OVA溶液中，搅拌均匀，分别加入6.8μL5％(体积分数)戊二醛，4℃过夜交联，PBS中透析3天，每天换两次PBS，得到稻曲菌素B-BSA包被原和稻曲菌素B-OVA免疫原。稻曲菌素B抗原合成过程示意图如图1所示。

实施例2、杂交瘤细胞系的获得及抗稻曲菌素B单克隆抗体的制备

Balb/C小白鼠：6-8周龄雌性小鼠，购自军事医学科学院实验动物中心。

SP2/0骨髓瘤细胞：购自中国兽医药品监察所。

一、动物免疫

1、以6-8周龄的雌性Balb/C小白鼠作为实验动物。

2、基础免疫：取1mL实施例1制备的稻曲菌素B-OVA免疫原溶液(浓度为1mg/mL，溶剂为PBS)加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器4℃充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的免疫原采用腹腔及背部皮下多点注射Balb/C小白鼠，注射剂量为每只小鼠注射0.1mg稻曲菌素B-OVA免疫原，其中腹腔注射0.05mg，背部皮下注射两点，0.025mg/点。

3、加强免疫：基础免疫2周后，取1mL实施例1制备的稻曲菌素B-OVA免疫原溶液(浓度为1mg/mL，溶剂为PBS)，加入1mL弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器4℃充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的免疫原采用腹腔及背部皮下多点注射Balb/C小白鼠，注射剂量为每只小鼠注射0.1mg稻曲菌素B-OVA免疫原，其中腹腔注射0.05mg，背部皮下注射两点，0.025mg/点。

二、细胞融合和克隆化

加强免疫每隔2周1次，从第三次加强免疫开始，每次免疫后第3天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，效价的定义为OD值为1时的血清稀释倍数。待效价大于1:8000(即OD值为1，稀释倍数为8000)后，选择血清效价最佳的小鼠，取脾细胞，按9:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合；采用间接竞争ELISA的方法以实施例1制备得到的稻曲菌素B-BSA为包被抗原筛选分泌抗体效价高和特异性好的细胞株。

上述间接竞争ELISA方法的步骤具体如下：

1)包被：在96孔酶标板中加入100μL浓度为500ng/mL的稻曲菌素B-BSA溶液(溶剂为包被缓冲液)，37℃包被3小时，用洗涤液洗涤4次。

2)加样品：抑制孔加入预先配置好的稻曲菌素B标准品(浓度为500ng/mL，溶剂为样品稀释液)50μL，空白孔加入50μL样品稀释液。

3)加抗体：将50μL杂交瘤细胞培养液加至酶标板中，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

4)加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP(购自Jackson公司，商品目录号为79556)(浓度为1mg/mL)用样品稀释液稀释1000倍，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

5)显色：取20mg邻苯二胺(OPD)溶于10mL底物缓冲液中，再向其中加4μL30％(质量分数)H₂O₂，得到底物溶液。将底物溶液加入酶标板中，每孔100μL。显色10min。

6)终止：每孔加入50μL终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值，部分结果见表1。表1中，1D4、5F4、1B5、5C10、3G3、5B11、3G7和5D11分别代表筛选过程中加入的细胞培养板不同孔中的杂交瘤细胞，抑制率(％)＝[(空白孔OD值－抑制孔OD值)/空白孔OD值]×100。

表1间接竞争ELISA法筛选杂交瘤细胞的结果

吸光值越大，说明抗体对抗原的亲和力越高；抑制率越高，说明抗体的特异性越好。从表1的数据可以看出，5F4和1D4的抑制率最高，达84.8％和84.4％，但与包被抗原的亲和力一般；1B5与包被抗原的亲和力最高，抑制率也较好(69.1％)。因此选取5F4、1D4和1B5三株杂交瘤细胞采用有限稀释法筛选分泌单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系。使用间接竞争ELISA筛选分泌抗体效价高和特异性好的单克隆细胞株。最后得到分泌抗体特异性好、亲和力高的杂交瘤细胞系1B5A10。该小鼠杂交瘤细胞系已于2014年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)，保藏号为CGMCCNo.10113。

三、细胞冻存和复苏

用冻存液将杂交瘤细胞系1B5A10CGMCCNo.10113制成1×10⁶个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。

四、单克隆抗体的制备与纯化

1、增量培养

细胞培养基的制备方法：向DMEM培养基中添加小牛血清(购自GIBCOBRL，产品目录号为26170-043)和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20％(体积分数)，碳酸氢钠的终浓度为0.2％(质量百分含量)，pH为7.4。

将杂交瘤细胞系1B5A10CGMCCNo.10113置于上述细胞培养基中，37℃培养，期间每天观察，并及时扩增培养。

2、腹水制备

Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油(0.3mL/只)。7天后腹腔注射小鼠杂交瘤细胞系1B5A10CGMCCNo.10113(约10⁶个/只)。7天后采集腹水，用饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水(即小鼠杂交瘤细胞系1B5A10CGMCCNo.10113分泌的单克隆抗体溶液)冷冻干燥后-20℃保存。

五、单克隆抗体的鉴定

1、将步骤四的2得到的单克隆抗体溶液采用单克隆抗体类型检测试剂盒(购自Sigma，产品编号为ISO2-1KT)检测单克隆抗体的亚型，具体操作参见试剂盒说明书。

结果显示，小鼠杂交瘤细胞系1B5A10CGMCCNo.10113分泌的单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG1型。

2、利用间接竞争性ELISA法测定单克隆抗体的灵敏度和交叉反应

1)包被：取96孔酶标板，采用稻曲菌素B-BSA溶液进行包被，100μL/孔；稻曲菌素B-BSA溶液的浓度为500ng/mL；37℃包被3小时，用洗涤液洗涤4次。

2)加样品：每孔加入50μL待测化合物溶液，对照孔为50μL的样品稀释液。

其中，待测化合物溶液为稻曲菌素B溶液或稻曲菌素A溶液(溶剂均为样品稀释液)。稻曲菌素B溶液浓度依次为：3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL；稻曲菌素A溶液浓度为：15.625ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL。

3)加抗体：每孔加入50μL步骤四的2得到的单克隆抗体溶液的稀释液(用样品稀释液稀释成500ng/mL)；每种稀释液设置三个复孔；置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

4)加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP(1mg/mL，购自Jackson公司，商品目录号为79556)用样品稀释液稀释1000倍，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

5)显色：取20mg邻苯二胺(OPD)溶于10mL底物稀释液中，再向其中加4μL30％(质量分数)H₂O₂，得到底物溶液。将底物溶液加入酶标板中，每孔100μL。避光显色10min。

6)终止：每孔加入50μL终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。

以待测化合物溶液浓度为横坐标，B/B₀(B值表示含有待测化合物时的吸光值，B₀表示不含有待测化合物时的吸光值，即对照孔吸光值)为纵坐标，运用OriginPro8软件分别计算稻曲菌素B和稻曲菌素A的IC₅₀值(标准曲线纵坐标数值等于50％对应的待测化合物浓度(ng/mL)，即IC₅₀值)，按下列公式计算交叉反应率：

交叉反应率(％)＝[IC₅₀(稻曲菌素B)/IC₅₀(稻曲菌素A)]×100

结果显示，得到的单克隆抗体对稻曲菌素A的交叉反应率为13.91％，说明所得单克隆抗体特异性较强，所建立的间接竞争ELISA检测方法检测的为稻曲菌素B的含量。

表2单克隆抗体与稻曲菌素B和稻曲菌素A的交叉反应

注：^a3次测定平均值±SD。

实施例3、检测稻曲菌素B的酶联免疫试剂盒的制备及应用

一、试剂盒的制备

本申请的检测稻曲菌素B的酶联免疫试剂盒由稻曲菌素B-BSA溶液(包被原)、小鼠杂交瘤细胞系1B5A10CGMCCNo.10113分泌的抗稻曲菌素B的单克隆抗体、羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP、包被缓冲液、样品稀释液、洗涤液、稻曲菌素B标准品溶液、底物缓冲液和终止液组成。

稻曲菌素B-BSA：由实施例1制备得到。

小鼠杂交瘤细胞系1B5A10CGMCCNo.10113分泌的抗稻曲菌素B的单克隆抗体：由实施例2步骤四2制备得到。

羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP：购自Jackson公司，商品目录号为79556。

洗涤液：溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和吐温-20，pH值为7.5；溶质Na₂HPO₄、KH₂PO₄和NaCl在洗涤液中的浓度分别为0.02M、0.0015M和0.14M；吐温-20在洗涤液中的体积百分含量为0.1％。

终止缓冲液：浓度为2M的硫酸水溶液。

稻曲菌素B标准品溶液：为系列不同浓度的稻曲菌素B溶液，浓度具体为：1.171875ng/mL、2.34375ng/mL、4.6875ng/mL、9.375ng/mL、18.75ng/mL、37.5ng/mL、75ng/mL、150ng/mL和300ng/mL，溶于样品稀释液中。

二、试剂盒的应用

1、制作标准曲线

1)包被：取96孔酶标板，采用稻曲菌素B-BSA溶液进行包被，100μL/孔；稻曲菌素B-BSA溶液的浓度为500ng/mL，溶剂为包被缓冲液；37℃包被3小时，用洗涤液洗涤4次。

2)加标准品溶液：将作为标准品的系列不同浓度的稻曲菌素B溶液分别加入到不同的实验孔，每孔加入50μL；每个浓度设置三个复孔。对照孔为50μL的样品稀释液。

3)加抗体：每孔加入50μL小鼠杂交瘤细胞系1B5A10CGMCCNo.10113分泌的单克隆抗体溶液的稀释液(用样品稀释液稀释成500ng/mL)；每种稀释液设置3个复孔；置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

5)显色：取20mg邻苯二胺(OPD)溶于10mL底物稀释液中，加4μL30％(质量分数)H₂O₂，将底物溶液加入酶标板中，每孔100μL。避光显色10min。

7)绘制标准抑制曲线：以不同浓度的稻曲菌素B溶液为横坐标，B/B₀(B表示含有稻曲菌素B时的OD值，B₀表示不含有稻曲菌素B时的OD值，即对照孔的OD值)为纵坐标，运用OriginPro8软件绘制标准抑制曲线。

实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的抑制曲线如图2所示。标准抑制曲线方程为Y＝0.96858/[1+(X/20.8145)^0.77541]-0.01203(R2＝0.9986)，Y表示B/B₀，X表示稻曲菌素B在溶液中的浓度(ng/mL)。(B₀-B)/B₀为20％-80％时稻曲菌素B的浓度范围即为检测范围。线性检测范围在2.49-107.35ng/mL。检测限为0.6ng/mL((B₀-B)/B₀为10％时稻曲菌素B的浓度)。

在计算样品浓度时，以不同浓度的稻曲菌素B溶液为横坐标，相应的OD值为纵坐标，运用OriginPro8软件绘制标准曲线。每次检测样品时均需要在同一块酶标板上建立相应的标准曲线。

2、步骤一中试剂盒的使用方法

1)待测样品经水提取，提取液直接检测或加适量样品稀释液稀释成样品液。

2)包被：取96孔酶标板，采用稻曲菌素B-BSA溶液进行包被，100μL/孔；稻曲菌素B-BSA溶液的浓度为500ng/mL；37℃包被3小时，用洗涤液洗涤4次。

3)加样品：每孔加入50μL样品溶液

4)加抗体：每孔加入50μL小鼠杂交瘤细胞系1B5A10CGMCCNo.10113分泌的单克隆抗体溶液的稀释液(用样品稀释液稀释成500ng/mL)；置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

5)加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP(1mg/mL，购自Jackson公司，商品目录号为79556)用样品稀释液稀释1000倍，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

6)显色：取20mg邻苯二胺(OPD)溶于10mL底物稀释液中，加4μL30％(质量分数)H₂O₂，将底物溶液加入酶标板中，每孔100μL。避光显色15min。

7)终止：每孔加入50μL终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。

在同一块板上同时做标准曲线(参见步骤一)，根据标准曲线计算得到样品中稻曲菌素B的含量。

3、稻曲球样品添加回收实验和抗稻曲菌素B单克隆抗体在检测稻曲球样品中稻曲菌素B含量上的应用实例

1)称取0.1g湖南汉寿地区稻曲球(2013年10月采集)粉末6份编号分别为1-6，每份设置3个重复，分别添加0μg/g、0.2μg/g、0.4μg/g、0.8μg/g、1.6μg/g和3.2μg/g稻曲菌素B标准品。

2)分别向样品中加1.5mL蒸馏水超声提取30min，离心收集提取液，重复提取三次，合并3次提取液，定容至5mL。提取液稀释800倍得到稻曲球样品提取稀释液。各稻曲球样品提取稀释液分别取50μL进行间接竞争ELISA分析，按照上述步骤2中的步骤2)-7)进行。

3)用样品稀释液配制的稻曲菌素B标准品溶液做标准曲线(参见步骤1)。根据标准曲线计算得到各稻曲球样品提取稀释液中稻曲菌素B的含量。

4)计算回收率。

回收率计算公式为：回收率(％)＝(稻曲菌素B的检测含量-不添加稻曲菌素B标准品时稻曲菌素B的检测含量)/稻曲菌素B的添加含量×100。其中，“稻曲菌素B的检测含量”为编号为2-6的5份待测样品中测得的稻曲菌素B的含量，“不添加稻曲菌素B标准品时稻曲菌素B的检测含量”为编号为1(稻曲菌素B标准品添加含量为0)的待测样品中测得的稻曲菌素B的含量。

结果如表3所示，回收率范围在91.27％-105.13％。检测到的2013年10月采集自湖南汉寿地区的稻曲球样品中稻曲菌素B的含量为0.37mg/g。

表3稻曲球样品的稻曲菌素B添加回收实验

注：^a每个样品3次重复；^b3次检测平均值±SD。

4、仪器验证实验

步骤3的1)和2)所得的稻曲球样品提取液，过滤(0.22μm滤膜)，用HPLC进行检测。HPLC分析系统(Shimadzu，Japan)由LC-20AT二元高压输送泵，SIL-20AC自动进样器，SPD-M20A光电二极管阵列检测器，DGU-20A3自动脱气机，CTO-10AS柱温箱，CBM-20Alite系统控制器和菲罗门Hydro-C18(250mm×4.6mm，5μm)反相色谱柱构成。色谱条件为：流动相：甲醇-水＝15:85(体积比)+0.02％TFA(v/v)；流速：1mL/min；紫外检测波长：220nm；柱温：30℃；样品进样量：30μL；总分析时间：22min。

用稻曲菌素B标准品配制稻曲菌素B标准溶液(溶剂为超纯水)：3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL。和待测样品同时用HPLC进行检测建立标准曲线：Y＝42664.8264X+28190.5747(R²＝1.0000)，Y表示峰面积，X表示检测浓度。

结果如表4所示，用建立的icELISA和HPLC法同时检测添加稻曲球B标准品的稻曲球样品提取液结果相关性较好，Y＝1.1425X-0.0883(R²＝0.9987)，Y表示HPLC检测浓度(mg/g)，X表示icELISA检测浓度(mg/g)。说明本发明所建立的icELISA方法准确可靠。

表4仪器验证实验

注：^a每个样品3次重复；^b3次测定平均值±SD。

上述实施例中所涉及的稻曲菌素B和稻曲菌素A是本发明的发明人自己制备得到的，具体可参考发明人所发表的如下论文：

上述实施例中所涉及的稻曲菌素B和稻曲菌素A的制备方法大致如下：

1、稻曲菌素B的制备

将一定量的稻曲球用水冷浸提取得到水提取物，然后分别用离子交换树脂PA308、大孔吸附树脂HP-20、透析袋透析以及各种柱层析方法对粗提物进行处理，通过TLC和HPLC分析后合并相同的组分，对得到的单体化合物进行波谱学鉴定，最终得到稻曲菌素B的单体化合物。具体操作如下：

取稻曲球(1000g)，晾干，粉碎，按干重(g)和水体积(mL)的配比的1:30(g/mL)冷浸提取7次，每次12小时，将7次提取液合并，减压浓缩得到稻曲球水提取物。将提取物用水混悬，用滤纸过滤，滤液过大孔吸附树脂HP-20，用水洗脱，合并水洗脱液，过透析袋(3500Da)，收集透析液，浓缩后依次过SephadexLH-20和SephadexG-15，可获得20mg纯的稻曲菌B。

取上述稻曲菌素B单体化合物，对其进行波谱鉴定。其高分辨质谱(HR-ESI-MS)谱图如图3所示；核磁共振氢谱(¹HNMR,D₂O,400MHz)谱图如图4所示；核磁共振碳谱(¹³CNMR,D₂O,400MHz)谱图如图5所示。由此，确定上述所得稻曲菌素B单体化合物的结构式如式I所示，与已知的稻曲菌素B结构式相同。

制备出的稻曲菌素B的理化性质和波谱数据如下：纯品为白色粉末(MeOH)。通过高分辨质谱(HR-ESI-MS,m/z646.23751[M+H]⁺)确定分子式为：C₂₆H₃₉N₅O₁₂S。核磁共振氢谱(D₂O,400MHz)化学位移(δ,ppm)：7.57(1H,s,H-13),7.39(1H,s,H-16),4.98(1H,d,J_10,9＝10.0Hz,H-10),4.71(1H,s,H-3),4.46(1H,q,J_6,24＝7.0Hz,H-6),4.33-4.38(1H,m,H-3'),4.21(1H,d,J_9,10＝10.0Hz,H-9),3.97(1H,dd,J_5',4'＝4.0Hz,8.0Hz,H-5'),3.81(1H,d,J_19,19＝17.0Hz,H-19),3.75(1H,d,J_19,19＝17.0),3.37(1H,dd,J_2',2'＝13.4Hz,J_2',3'＝10.0Hz,H-2'),3.03(1H,dd,J_2',2'＝13.4Hz,J_2',3'＝2.4Hz,H-2'),2.76(3H,s,NCH₃-9),2.04-2.19(3H,m,H₂-4',H-22),1.74(3H,s,H-21),1.65-1.70(1H,m,H-22),1.19(3H,d,J_24,6＝7.0Hz,H-24),0.97(3H,t,J_23,22＝7.2Hz,7.2Hz,H-23)。核磁共振碳谱(D₂O,100MHz)化学位移(δ,ppm)：176.2(C-20),174.1(6'-C),171.8(C-5),169.8(C-17),165.6(C-8),152.0(C-14),145.6(C-15),136.5(C-12),127.8(C-11),123.9(C-16),113.7(C-13),87.0(C-2),73.3(C-10),66.1(C-9),64.5(2'-C),63.5(3'-C),59.6(3-C),52.4(5'-C),49.4(6-C),43.5(19-C),36.4(4'-C),31.7(NCH₃-C),30.9(22-C),21.6(21-C),15.2(24-C),7.7(23-C)。上述制备出的稻曲菌素B的理化性质和波谱数据与文献(KoisoY,LiY,IwasakiS,HanaokaK,KobayashiT,SonodaR,FujitaY,YaegashiH,SatoZ.Ustiloxins,antimitoticcyclicpeptidesfromfalsesmutballsonricepaniclescausedbyUstilaginoideavirens.TheJournalofAntibiotics,1994,47(7):765-773.)报道的相一致。

2、稻曲菌素A的制备

将一定量的稻曲球用水冷浸提取得水提取物，然后分别用离子交换树脂PA308、大孔吸附树脂HP-20、透析袋透析以及各种柱层析方法对粗提物进行处理，通过TLC和HPLC分析后合并相同的组分，对得到的单体化合物进行波谱学鉴定，最终得到稻曲菌素A的单体化合物。具体操作如下：

取稻曲球(1000g)，晾干，粉碎，按干重(g)和水体积(mL)的配比的1:30(g/mL)冷浸提取7次，每次12小时，将7次提取液合并，减压浓缩得到稻曲球水提取物。将提取物用水混悬，用滤纸过滤，滤液过大孔吸附树脂HP-20，用水洗脱后，再用30％乙醇洗脱，合并30％乙醇洗脱液，过透析袋(3500Da)，收集透析液，浓缩后依次过ODS-AQ、SephadexLH-20和SephadexG-15，可获得80mg纯的稻曲菌A。

取上述分离纯化的稻曲菌素A单体化合物，对其进行波谱鉴定。其高分辨质谱(HR-ESI-MS)谱图如图6所示；核磁共振氢谱(¹HNMR,D₂O,400MHz)谱图如图7所示；核磁共振碳谱(¹³CNMR,D₂O,400MHz)谱图如图8所示。由此，确定上述所得稻曲菌素A单体化合物的结构式如式II所示，与已知的稻曲菌素A结构式相同。

制备出的稻曲菌素A的理化性质和波谱数据如下：纯品为白色粉末(MeOH)。通过高分辨质谱(HR-ESI-MS,m/z674.26859[M+H]⁺)确定分子式为：C₂₈H₄₃N₅O₁₂S。核磁共振氢谱(D₂O,400MHz)化学位移(δ,ppm)：7.60(1H,s,H-13),7.08(1H,s,H-16),4.93(1H,d,J_10,9＝10.0Hz,H-10),4.84(1H,s,H-3),4.35-4.40(1H,m,H-3'),4.28(1H,d,J_9,10＝10.0Hz,H-9),4.14(1H,d,J_6,24＝10.2Hz,H-6),3.99(1H,dd,J_5',4'＝4.0Hz,7.6Hz,H-5'),3.77(2H,s,H-19),3.33(1H,dd,J_2',2'＝13.2Hz,J_2',3'＝9.6Hz,H-2'),3.04(1H,dd,J_2',2'＝13.2Hz,J_2',3'＝2.8Hz,H-2'),2.77(3H,s,NCH₃-9),2.17-2.25(2H,m,H-22,H-4'),2.12(1H,ddd,J_4',3'＝2.8Hz,J_4',4'＝14.2Hz,J_4',5'＝7.6Hz,H-4'),1.86-1.92(1H,m,H-24),1.76(1H,s,H-21),1.68-1.73(1H,m,H-22),1.09(3H,t,J＝7.2Hz,H-23),0.88(3H,d,J_26, ₂₄＝7.0Hz,H-26),0.78(3H,d,J_25,24＝7.0Hz,H-25)。核磁共振碳谱(D₂O,100MHz)化学位移(δ,ppm)：176.0(C-20),174.1(6'-C),170.7(C-5),170.0(C-17),166.0(C-8),151.9(C-14),145.7(C-15),136.1(C-12),127.7(C-11),123.9(C-16),113.7(C-13),86.9(C-2),73.7(C-10),66.4(C-9),64.5(2'-C),63.5(3'-C),59.8(6-C),59.3(3-C),52.5(5'-C),43.5(19-C),36.4(4'-C),32.0(NCH₃-C),31.8(22-C),28.4(24-C),20.9(21-C),18.0(26-C),17.7(25-C),7.5(23-C)。上述制备出的稻曲菌素A的理化性质和波谱数据与文献(KoisoY,LiY,IwasakiS,HanaokaK,KobayashiT,SonodaR,FujitaY,YaegashiH,SatoZ.Ustiloxins,antimitoticcyclicpeptidesfromfalsesmutballsonricepaniclescausedbyUstilaginoideavirens.TheJournalofAntibiotics,1994,47(7):765-773.)报道的相一致。

Claims

1.小鼠杂交瘤细胞系1B5A10，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.10113。

2.抗稻曲菌素B的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由权利要求1所述的小鼠杂交瘤细胞系1B5A10CGMCCNo.10113分泌产生的。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测或辅助检测稻曲菌素B中的应用。

4.权利要求1所述的小鼠杂交瘤细胞系1B5A10CGMCCNo.10113或权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测或辅助检测稻曲菌素B的试剂或试剂盒中的应用。

5.一种检测或辅助检测稻曲菌素B的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求2所述的稻曲菌素B的单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有稻曲菌素B标准品。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有如下1)-5)试剂中的至少一种：

1)包被缓冲液：溶剂为水，溶质为Na₂CO₃和NaHCO₃；所述Na₂CO₃和所述NaHCO₃在所述包被缓冲液中的浓度分别为0.01M和0.04M；所述包被缓冲液的pH值为9.6；

2)样品稀释液：溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄、KH₂PO₄和NaCl、吐温-20和明胶；所述Na₂HPO₄、所述KH₂PO₄和所述NaCl在所述样品稀释液中的浓度分别为0.02M、0.0015M和0.14M；所述吐温-20在所述样品稀释液中的体积百分含量为0.1％；所述明胶在所述样品稀释液中的含量为5g/L；所述样品稀释液的pH值为7.5；

3)洗涤液：溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和吐温-20；所述Na₂HPO₄、所述KH₂PO₄和所述NaCl在所述洗涤液中的浓度分别为0.02M、0.0015M和0.14M；所述吐温-20在所述洗涤液中的体积百分含量为0.1％；所述洗涤液的pH为7.5；

4)底物缓冲液：溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na₂HPO₄；所述柠檬酸三钠和所述Na₂HPO₄在所述底物缓冲液中的浓度分别为0.01M和0.03M；所述底物缓冲液的pH值为5.5；

5)终止液：2M的硫酸水溶液。

8.一种检测或辅助检测稻曲菌素B的方法，包括使用权利要求5-7中任一所述的试剂盒对待测样品进行检测的步骤。

9.权利要求5-7中任一所述的试剂盒在定性或定量检测稻曲菌素B中的应用。

10.将权利要求2所述抗稻曲菌素B的单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂。

11.以权利要求10所述的免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱。

12.含有权利要求10所述的免疫亲和吸附剂或权利要求11所述的免疫亲和色谱柱的试剂盒。

13.权利要求10所述的免疫亲和吸附剂或权利要求11所述的免疫亲和色谱柱或权利要求12所述的试剂盒在分离纯化稻曲菌素B中的应用。