CN103242446A - 茶碱免疫原及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了茶碱免疫原及其制备方法和应用，以及由该免疫原获得的一种抗茶碱特异性抗体和茶碱均相酶免疫检测试剂。本发明中的茶碱免疫原保存了茶碱完整的功能基团，免疫原性高，可以获得高效价的茶碱特异性抗体，所研制免疫试剂可以精确地测定血清和血浆样本中茶碱的含量。与传统方法相比，本发明提供的免疫检测试剂灵敏度高、特异性强，结合自动化分析仪使用具有操作简便、高通量、检测结果准确等优点，对指导临床合理用药具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂，具体涉及的是茶碱免疫原及其制备方法和应用。
背景技术
茶碱（Theophylline），其结构式如式（Ⅲ）所示。
式（Ⅲ）
茶碱是一种甲基黄嘌呤类的衍生物，临床用途极其广泛。主要用于治疗支气管哮喘、哮喘型慢性支气管炎和心源性哮喘等。但茶碱高于有效血药浓度时也会产生很多毒副作用，包括：恶心，头痛，腹泻，呕吐，肠胃出血，癫痫以及心律失常等。由于茶碱的临床有效治疗窗窄（治疗血药浓度参考范围为10-20μ g/ml），且毒副反应发生率与其血药浓度密切相关，因此在治疗期间对病人的茶碱血药浓度水平进行监测非常重要。
现有检测茶碱的方法主要有荧光偏振法、微粒子化学发光法和免疫比浊法。高度自动化的荧光偏振法和微粒子化学发光法因其简便快速的优点成为临床茶碱血药浓度监测最常用的方法，但其试剂盒全部依赖进口，价格昂贵和有效期较短是其不可回避的缺点，造成临床使用难以普及。
发明内容
为解决上述问题，本发明提出了茶碱免疫原及其制备方法和应用，研制出一种抗茶碱特异性抗体和茶碱均相酶免疫检测试剂。
为达到上述技术目的，实现上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
茶碱免疫原，结构式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）
其中：
R为连接基团，是-(CH2)n-COO- 、O-(CH2)n-COO-、-S-(CH2)n-COO-、-NH-(CH2)n-COO-的一种，所述n为1至20之间的整数;优选的，R为-(CH2)n-COO-，n是1至10之间的整数，更优选的R为-(CH2)5-COO-；
载体为具有免疫原性的蛋白质，常用的免疫原性载体包括血清蛋白，血蓝蛋白（KLH）和甲状腺球蛋白等。
进一步的，茶碱免疫原的制备方法，包括以下步骤：
（1）、制备具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物；
式（Ⅱ）
（2）、将具有免疫原性的载体溶解形成具有免疫原性的载体溶液；
（3）、将具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物加入到所述具有免疫原性的载体溶液中，使具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物中连接基团所在部分和具有免疫原性的载体发生缩聚反应，形成所述茶碱免疫原。
进一步的，当R为-(CH2)5-COO-时，所述茶碱免疫原的制备方法，包括以下步骤：
（1）、 具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物的合成
1、制备化合物2：
用有机溶剂A溶解10-50 g的化合物1，其结构式见式（Ⅳ），10-30 g的6-氨基己酸，得到第一反应溶液，其中有机溶剂A的使用量根据需要在100-300 mL左右，使其在第一催化剂的作用下进行加热反应，此时第一催化剂的使用量在1-20 g左右，加热反应得到的生成物抽真空浓缩，重结晶得到化合物2，即如下结构式（Ⅴ）中的化合物。
其中，具有式（Ⅳ）中结构的化合物和具有式（Ⅴ）中结构的化合物结构如下：
式（Ⅳ） 式（Ⅴ）
利用化合物1制备具有化合物2的化学反应式如下：
2、制备化合物3
用蒸馏水溶解5-30 g的化合物2和1-10 g NaNO2，得到第二反应溶液，其中蒸馏水的使用量根据需要在50-300 mL左右。加热反应后得到黄色固体物质，经过滤、干燥、浓缩得到具有式（Ⅵ）中结构的化合物3。
式（Ⅵ）
利用化合物2制备化合物3的化学反应式如下：
3、制备化合物4
用有机溶剂B溶解5-20 g的化合物3，并向反应体系中持续通入H2，得到第三反应溶液，有机溶剂B的使用量根据需要在70-300 ml左右。使其在第二催化剂的作用下进行加热反应，此时第二催化剂的使用量根据实际需要在50-200 mg左右，反应产物经稀释、加热回流、冷却、重结晶反应后得到具有式（Ⅶ）中结构的化合物4。
式（Ⅶ）
利用化合物3制备化合物4的化学反应式如下：
4、制备茶碱衍生物
用100-300 ml邻二氯苯溶解1.0-5.0 g化合物4，形成第四反应溶液，并向反应体系中通入N2，加热反应后得到的溶液经减压浓缩得到固体，将该固体经萃取、洗涤、无机酸溶液C调节pH至4.0、重结晶和纯化步骤后得到具有式（Ⅱ）结构的茶碱衍生物。
利用化合物4制备茶碱衍生物的化学反应式如下：
（2）、载体溶液的制备：将具有免疫原性的蛋白质100 - 300 mg溶于10-100 ml的0.2 M，pH 8.5磷酸盐缓冲液中。
（3）、茶碱衍生物的活化及免疫原的合成：用有机溶剂D溶解50 - 500 mg的具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物，此处有机溶剂D的使用量根据需要为5-50ml左右，通过1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺（EDAC）的方法或EDAC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺联合使用的方法进行活化并与载体溶液进行交联反应，经透析纯化后得到具有免疫原性的茶碱免疫原。
进一步的，所述有机溶剂A包括但不限于二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇或乙醇，优选乙醇；所述有机溶剂B包括但不限于甲醇、乙醇、乙醚或氯仿，优选甲醇；所述无机酸溶液C包括但不限于盐酸溶液或硫酸溶液，优选盐酸溶液；所述的有机溶剂D包括但不限于二甲基亚砜、二甲基甲酰胺，优选二甲基甲酰胺；所述第一催化剂包括但不限于三乙基铝、三氯化钛，优选为三乙基铝；所述第二催化剂包括但不限于氧化铂、氧化钯，优选为氧化铂。
进一步的，一种抗茶碱特异性抗体，由所述茶碱免疫原免疫动物后生产得到。
进一步的，所述抗茶碱特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）用磷酸盐缓冲液将合成的茶碱免疫原稀释至0.5 - 10.0 mg/mL；
（2）经常规弗氏佐剂法对动物进行注射，注射后抽取动物特异性抗血清，得到有效的抗体。
进一步的，一种茶碱均相酶免疫检测试剂，含有所述抗茶碱特异性抗体和指示试剂；所述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂，优选地，所述指示试剂是酶试剂和底物，所述酶试剂主要含有酶标偶联物，底物为对应酶的底物。
酶标偶联物的酶选自β-半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等，优选酶为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
进一步的，所述酶标偶联物的制备方法，包括以下步骤：
（1）酶溶液制备
称取选自β-半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，在室温条件下溶解于磷酸缓冲液中，终浓度为1-10 mg/mL；
（2）使具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物活化及偶联物的合成
用有机溶剂溶解所述具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物，使其终浓度为10 - 50 mg/mL，通过三丁胺法进行活化，并与酶溶液进行交联反应，经纯化和透析后得到茶碱衍生物酶标偶联物。
所述步骤（2）中所使用的有机溶剂为：二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇或乙醇。
在本发明中，优选采用如下制备方法获取酶标偶联物：
（1）酶溶液制备：称取葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在室温条件下溶解于磷酸缓冲液中，终浓度为3 - 5 mg/mL；
（2）茶碱衍生物的活化及偶联物的合成：用二甲基甲酰胺溶解茶碱衍生物，浓度为1-20 mg/mL，通过三丁胺法进行活化，并与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液进行交联反应，经纯化和透析后得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-茶碱偶联物。所述的有机溶剂选自二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇或乙醇，优选地，有机溶剂为二甲基甲酰胺。
本发明的有益效果是：
本发明制备的茶碱免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗茶碱的特异性抗体。高效价的茶碱特异性抗体研制的免疫试剂可以准确测定样本中茶碱的浓度，具有灵敏度高，特异性强，可以达到操作简便、周期短、成本低的要求。
附图说明
图1是茶碱均相酶免疫检验标准曲线；
图2 是80例样本的均相酶免疫法测定值与荧光偏振法测定值相关性分析。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
茶碱免疫原，其特征在于：结构式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）
其中：
R为连接基团，是-(CH2)n-COO- 、O-(CH2)n-COO-、-S-(CH2)n-COO-、-NH-(CH2)n-COO-的一种，所述n为1至20之间的整数;优选的，R为-(CH2)n-COO-，n是1至10之间的整数，更优选的R为-(CH2)5-COO-；
载体为具有免疫原性的蛋白质，常用的免疫原性载体包括血清蛋白，血蓝蛋白（KLH）和甲状腺球蛋白等。
进一步的，茶碱免疫原的制备方法，包括以下步骤：
（1）、制备具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物；
式（Ⅱ）
（2）、将具有免疫原性的载体溶解形成具有免疫原性的载体溶液；
（3）、将具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物加入到所述具有免疫原性的载体溶液中，使具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物中连接基团所在部分和具有免疫原性的载体发生缩聚反应，形成所述茶碱免疫原。
进一步的，当R为-(CH2)5-COO时，所述步骤（3）包括：用所述有机溶剂A溶解上述具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物，通过1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺的方法(EDAC)的方法或EDAC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺联合使用的方法进行活化并与载体溶液进行交联反应，反应获取物经透析纯化后得到具有免疫原性的茶碱免疫原。
进一步的，一种抗茶碱特异性抗体，由茶碱免疫原免疫动物后生产得到。
进一步的，一种茶碱均相酶免疫检测试剂，含有所述抗茶碱特异性抗体和指示试剂；所述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂，优选地，所述指示试剂是酶试剂和底物，所述酶试剂主要含有酶标偶联物，底物为对应酶的底物。
实施例1
茶碱免疫原，其中R为-(CH2)5-COO-，载体为牛血清白蛋白。
制备方法如下：
步骤一、 具有式（Ⅱ）结构的茶碱衍生物的合成
（1）制备具有式（Ⅴ）结构的化合物2：
先用150 mL无水乙醇溶解25.0 g，143 mmol化合物1和18.7g，143 mmol 6-氨基己酸，再加入14.0 g，143 mmol三乙基铝得到第一反应溶液，将第一反应溶液加热回流反应16小时，冷却后将产物抽真空浓缩、重结晶得到23.2g，产率为58%的白色化合物2。利用Bruker Avance III plus 400 MHz对该白色化合物2进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1HNMR(DMSO-d6, 400MHz): 12.01 (s, 1H), 6.73 (t, 1H, J = 4.8 Hz), 4.66 (s, 1H), 3.27 (s, 3H), 3.09 (s, 3H), 3.02-3.06 (m, 2H), 2.21 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 1.49-1.56 (m, 4H), 1.30-1.33 (m, 2H)。表征为式（Ⅴ）所示的化合物质。
（2）制备化合物3
用150 mL蒸馏水溶解18.5 g，68.8 mmol的化合物2，并向其中加入6.6 g，96.3 mmol 亚硝酸钠，得到第二反应溶液，加热至55℃，搅拌反应1小时后，将反应液冷却至0℃，用10% 盐酸溶液调节pH至5，经过滤收集黄色固体状物质并经真空干燥得到12.0 g，产率58.5%的白色固体化合物3。利用Bruker Avance III plus 400 MHz对该白色化合物3进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1HNMR(DMSO-d6, 400MHz): 12.03 (s, 1H), 3.42 (s, 3H), 3.23 (s, 3H), 3.13-3.16 (m, 2H), 2.70 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 2.24 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 1.70 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 1.51 (t, 2H, J = 7.2 Hz)。表征为式（Ⅵ）所示的化合物。
（3）制备化合物4
用150ml甲醇溶液溶解10.0 g，33.5 mmol化合物3，再加入100 mg催化剂氧化铂，形成第三反应溶液，并向反应体系中通入H2，在50℃下加热反应10小时。经过滤法除去催化剂，并将滤液经减压浓缩得到红色油状物质。用200 ml甲酸甲酯将此红色油状物质稀释，并将该溶液在通入N2的情况下进行回流反应20小时，冷却后经过滤得到白色固体状物质，将此物质经重结晶得到5.2g，产率为49.8%的白色固体化合物4。利用Bruker Avance III plus 400 MHz对该白色固体化合物4进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1HNMR(DMSO-d6, 400MHz): 12.01 (s, 1H), 8.12 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 3.13-3.15 (m, 6H), 2.20 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 1.47-1.50 (m, 4H), 1.23-1.28 (m, 4H)。表征为式（Ⅶ）所示的化合物。
（4）利用化合物4制备含有-(CH2)5-COO-基团的茶碱衍生物
茶碱衍生物的制备方法如下：用250 ml邻二氯苯溶液溶解4.0 g，12.8 mmol化合物4，形成第四反应溶液，并通入N2回流反应4小时。冷却后经减压浓缩得到的固体用200 ml乙醚和100 ml 5% NaHCO3溶液进行萃取分离，将水相用100ml乙醚洗涤后用5N HCl调节水相溶液pH = 4，收集沉淀物并经甲醇重结晶后得到的固体用快速硅胶色谱纯化得到1.1g，产率为30.8%白色固体状茶碱衍生物。
利用Bruker Avance III plus 400 MHz对上述所获取的1.1g白色物质进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1HNMR(DMSO-d6, 400MHz): 12.02(s,1H) ,7.75 (s,1H), 4.28 (t, 2H, J=7.2 ), 3.65 (s, 3H), 3.24 (s, 3H), 2.22 (t, 2H, J=7.2), 1.71-1.78 (m, 2H), 1.50-1.56 (m, 2H), 1.26-1.32(m, 2H)。其表征为式（Ⅱ）所示的化合物，即具有式（Ⅱ）结构的茶碱衍生物。
（5）利用色谱/质谱技术对得到的具有式（Ⅱ）结构的茶碱衍生物进行分析鉴定
仪器：安捷伦公司的串联四级杆质谱仪LC/MSD1200系列，离子源采用正离子或负离子化模式。色谱柱规格为：Welchrom XB-C18 (50 * 4.6 mm, 5 μm)，柱温为30℃，流速为1.5 mL/min，流动相为乙腈-水，比例为5%-95% ~ 60%-40%。
鉴定结果：该具有式（Ⅱ）结构的茶碱衍生物纯度为99.4%，分子量为294，保留时间为2.65 min，分子离子为295（M+1）。
步骤二、将具有免疫原性的载体溶解形成具有免疫原性的载体溶液：
将牛血清白蛋白（200 mg）溶解于50 ml 0.2 M，pH 8.5的磷酸缓冲液中，得到牛血清蛋白溶液；
步骤三、将牛血清蛋白与茶碱衍生物通过-(CH2)5-COO-基团连接形成所述的茶碱免疫原：
茶碱免疫原的合成方法如下：将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100 mg合成的茶碱衍生物、3.5 ml 二甲基甲酰胺、3.5 ml 乙醇、7.0 ml 10mM， pH 5.0 的磷酸钾缓冲液、200 mg1-乙基-3-碳二亚胺、50 mg Sulfo-NHS，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30 min，得到混合溶液；将溶解好的混合溶液滴加至牛血清蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌8-16小时，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到茶碱免疫原。
抗茶碱特异性抗体的制备方法包括以下步骤：
（1）用磷酸盐缓冲液将由实施例1合成的茶碱免疫原稀释至1.5 mg/ml，得到抗原溶液，然后用抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射；
（2）2～3周后，再用1.0 ml 相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂混合后对家兔注射一次，之后每隔四周一次，共四次，抽取家兔的抗血清，获得有效的抗体。
茶碱均相酶免疫检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
（1） R1试剂的制备
将制备好的抗体稀释到R1缓冲液中，得到R1试剂。均相R1缓冲液含50 mM Tris，0.25% BSA，50 mM 葡萄糖六磷酸（G-6-P）和50mM氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），抗体与R1缓冲液的体积比为1:1000。
（2）R2试剂的制备
1）G6PDH-茶碱的制备
a) 称取15 mg G6PDH，溶解于12 ml，0.05M Tris缓冲液中，依次加入100 mg 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.5 ml卡必醇和1 ml的DMF混匀；
b)将10 mg的茶碱衍生物溶解于420 μl DMSO和180μl DMF中， 加入6μl 三丁胺和3 μl 氯甲酸异丁酯， 在2～8℃条件下搅拌反应30 min；
c)在2~8℃条件下搅拌过夜，并将得到的G6PDH-茶碱用透析的方法进行纯化。
2）将制备好的G6PDH-茶碱稀释到R2缓冲液中，得到R2试剂。R2缓冲液为100 mM Tris，0.25% BSA。抗体与R2缓冲液的体积比为1:2000。
茶碱均相酶免疫检验定标结果及相关试验结果
（1）标准品的制备：
将茶碱粉末溶解于1N NaOH溶液，制备成10 mg/ml的储存液。用标准品稀释缓冲液将储存液依次稀释为40 μg/ml、20 μg/ml 、10 μg/ml 、5 μg/ml 、2.5 μg/ml和0 μg/ml的标准溶液。其中，标准品稀释缓冲液含有50.0 mM Tris，145 mM NaCl和0.25%的BSA。
（2）利用茶碱的均相酶免疫检验方法制作标准曲线：
表1 迈瑞BS-200分析仪茶碱均相酶免疫检验参数表
利用迈瑞BS-200全自动生化分析仪，按照表1数据进行参数设置。首先加入R1试剂（抗体与R1缓冲液的混合液），再加入样品，最后加入R2试剂（G6PDH-茶碱偶联物与R2缓冲液的混合液），测定不同时间点的吸光值，计算不同浓度标准品的反应幅度，得到理想的反应标准曲线，结果如图1所示。
（3）应用实施例1中所制备的茶碱检测试剂进行样本中茶碱的回收试验，以确定实施例1中所制备的茶碱检测试剂可以用于血清和血浆样本中茶碱的检测。步骤如下：
制作血清样本，制备方法为：将茶碱粉末（购于Sigma公司）溶解于1N 氢氧化钠溶液制成10 mg/ml的储存液，并将此储存液稀释于空白血清中，至终浓度分别为0.0，3.75，15.0，30.0 μg/ml，形成空白、低、中、高浓度的血清样本。上述空白血清为不含茶碱的健康人血清。
测试方法：利用上述茶碱的均相酶免疫检测方法，将上述空白、低、中、高浓度的血清样本代替标准品，测试上述空白、低、中、高浓度的血清样本在相应条件下的反应幅度。对照图1中所示的茶碱的均相酶免疫检测的标准曲线，计算每个样本中茶碱含量，并对每个样本进行3个复孔测定，根据上述样本中茶碱的实际含量计算回收率，结果如表2所示。
表2 茶碱的均相酶免疫检验回收率实验
由表2中结果可知：采用本发明茶碱检测试剂测定不同浓度的样品中的茶碱回收率大于95%，小于105%，说明本发明所述的茶碱检测试剂可以用于样本中茶碱的检测，并且结果准确，可信。
（4）药物干扰试验
试验方法：选取52种常用化合物和药物进行药物干扰检测，调整其浓度为10.0 μg/ml，利用均相酶免疫方法进行测定，根据标准曲线得到相应物质的浓度，结果显示浓度均小于0.1 μg/ml，说明所有检测药物与茶碱无任何交叉反应，可见，本发明所获得的茶碱抗体具有很强的特异性。
表3 药物干扰试验
| 化合物名称 | 化合物名称 | 化合物名称 | 化合物名称 |
| 阿司匹林 | 烟酰胺 | 甲基二乙醇胺 | 氢氯噻嗪 |
| 异戊巴比妥 | 青霉素 | 二亚甲基双氧苯丙胺 | 二氨基二苯砜 |
| 氨苄青霉素 | 苯丙醇胺 | 甲撑二氧苯丙胺 | 甲胺呋硫 |
| β-苯基乙胺 | 普鲁卡因酰胺 | 琥珀酸多西拉敏 | 柳丁氨醇 |
| 甲氨二氮卓 | 普鲁卡因 | 四氢大麻酚 | 纳布啡 |
| 氯丙嗪 | 奎尼丁 | 羟吗啡酮 | 大麻酚 |
| 氯拉卓酸 | 佐美酸 | 制霉菌素 | 洛派丁胺 |
| 甲基苯丙胺 | 桂皮酰艾克宁 | 去甲吗啡 | 异克舒令 |
| 非诺洛芬 | 芽子碱 | 乙酰吗啡 | 苯基丙氨酸 |
| 二甲苯氧庚酸 | 地西泮 | 羟考酮 | 盐酸氟西汀 |
| 龙胆酸 | 可替宁 | 苄非他明 | 克他命 |
| 氢可酮 | 阿替洛尔 | 异丙嗪 | 苯海拉明 |
| 布洛芬 | 心得安 | 阿司帕坦 | 苯丁胺 |
（5）与荧光偏振法相关性分析
选取80例临床血清样本（包括60例阳性和20例阴性）分别使用雅培的荧光偏振法和本发明中的均相酶免疫法进行测定，并进行相关性分析，结果如图2所示。图中显示R2>0.98，说明两种方法具有很好的相关性，进一步证明了本研究的茶碱均相酶免疫检测试剂测定临床样本的准确性。
Claims (5)
1.茶碱免疫原，其特征在于：结构式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）
其中：
R为连接基团，是-(CH2)n-COO- 、O-(CH2)n-COO-、-S-(CH2)n-COO-、-NH-(CH2)n-COO-一种，所述n为1至20之间的整数；
载体为具有免疫原性的蛋白质。
2. 茶碱免疫原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）、制备具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物；
式（Ⅱ）
（2）、将具有免疫原性的载体溶解形成具有免疫原性的载体溶液；
（3）、将具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物加入到所述具有免疫原性的载体溶液中，使具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物中连接基团所在部分和具有免疫原性的载体发生缩聚反应，形成所述茶碱免疫原。
3.根据权利要求2所述的茶碱免疫原的制备方法，其特征在于：当R为-(CH2)5-COO-时，所述步骤（3）包括：用所述有机溶剂A溶解上述具有式（Ⅱ）中结构的茶碱衍生物，通过1-乙基-3-碳二亚胺的方法或EDAC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺联合使用的方法进行活化并与载体溶液进行交联反应，反应获取物经透析纯化后得到具有免疫原性的茶碱免疫原。
4. 一种抗茶碱特异性抗体，其特征在于：由权利要求1所述的茶碱免疫原免疫动物后生产得到。
5. 一种茶碱均相酶免疫检测试剂，其特征在于：含有权利要求4所述的抗茶碱特异性抗体和指示试剂；所述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。
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