CN104774256B - 儿茶酚胺免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法 - Google Patents
儿茶酚胺免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104774256B CN104774256B CN201510236349.XA CN201510236349A CN104774256B CN 104774256 B CN104774256 B CN 104774256B CN 201510236349 A CN201510236349 A CN 201510236349A CN 104774256 B CN104774256 B CN 104774256B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- catecholamine
- preparation
- specific antibody
- solution
- immunogene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 title claims abstract description 123
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 title abstract description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 46
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 32
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 32
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 claims description 24
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 claims description 24
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 24
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 19
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 15
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 13
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical class CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 6
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 5
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical class CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 4
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N tributylamine Chemical class CCCCN(CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 239000012264 purified product Substances 0.000 claims description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 2
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 claims 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 claims 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 claims 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 claims 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 claims 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 claims 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 33
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 12
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 9
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 8
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 6
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 6
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 5
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- GRHQDJDRGZFIPO-UHFFFAOYSA-N 4-bromobutanoic acid Chemical class OC(=O)CCCBr GRHQDJDRGZFIPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 3
- 229960001760 dimethyl sulfoxide Drugs 0.000 description 3
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- CCMKPCBRNXKTKV-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-5-sulfanylidenepyrrolidin-2-one Chemical class ON1C(=O)CCC1=S CCMKPCBRNXKTKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M Lithium hydroxide Chemical compound [Li+].[OH-] WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 aminopropyl Chemical group 0.000 description 2
- KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N bromoacetic acid Chemical class OC(=O)CBr KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 2
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000013062 quality control Sample Substances 0.000 description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 description 1
- 0 **Oc(cc(CCN)cc1)c1O Chemical compound **Oc(cc(CCN)cc1)c1O 0.000 description 1
- PWWIBLJDJCLRSC-UHFFFAOYSA-N 1-aminocyclohexa-3,5-diene-1,2-diol Chemical compound NC1(O)C=CC=CC1O PWWIBLJDJCLRSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WDBQJSCPCGTAFG-QHCPKHFHSA-N 4,4-difluoro-N-[(1S)-3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-pyridin-3-ylpropyl]cyclohexane-1-carboxamide Chemical compound FC1(CCC(CC1)C(=O)N[C@@H](CCN1CCC(CC1)N1C(=NN=C1C)C(C)C)C=1C=NC=CC=1)F WDBQJSCPCGTAFG-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- BWGRDBSNKQABCB-UHFFFAOYSA-N 4,4-difluoro-N-[3-[3-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)-8-azabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]-1-thiophen-2-ylpropyl]cyclohexane-1-carboxamide Chemical compound CC(C)C1=NN=C(C)N1C1CC2CCC(C1)N2CCC(NC(=O)C1CCC(F)(F)CC1)C1=CC=CS1 BWGRDBSNKQABCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001131796 Botaurus stellaris Species 0.000 description 1
- DENZZXVFNYTHNQ-UHFFFAOYSA-N C1(O)=C(O)C(=CC=C1)N.C1(O)=C(O)C(=CC=C1)N Chemical compound C1(O)=C(O)C(=CC=C1)N.C1(O)=C(O)C(=CC=C1)N DENZZXVFNYTHNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JSHLOPGSDZTEGQ-UHFFFAOYSA-N COc1cc(C=O)ccc1OCc1ccccc1 Chemical compound COc1cc(C=O)ccc1OCc1ccccc1 JSHLOPGSDZTEGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WJUFSDZVCOTFON-UHFFFAOYSA-N COc1ccc(C=O)cc1OC Chemical compound COc1ccc(C=O)cc1OC WJUFSDZVCOTFON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000628997 Flos Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 206010027304 Menopausal symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012359 Methanesulfonyl chloride Substances 0.000 description 1
- NUGPIZCTELGDOS-QHCPKHFHSA-N N-[(1S)-3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-pyridin-3-ylpropyl]cyclopentanecarboxamide Chemical compound C(C)(C)C1=NN=C(N1C1CCN(CC1)CC[C@@H](C=1C=NC=CC=1)NC(=O)C1CCCC1)C NUGPIZCTELGDOS-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- LFZAGIJXANFPFN-UHFFFAOYSA-N N-[3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-thiophen-2-ylpropyl]acetamide Chemical compound C(C)(C)C1=NN=C(N1C1CCN(CC1)CCC(C=1SC=CC=1)NC(C)=O)C LFZAGIJXANFPFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 208000026564 adrenal medullary hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N benzyl bromide Chemical compound BrCC1=CC=CC=C1 AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000003737 chromaffin cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 1
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004193 electrokinetic chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 description 1
- DXBULVYHTICWKT-UHFFFAOYSA-N ethyl 6-bromohexanoate Chemical class CCOC(=O)CCCCCBr DXBULVYHTICWKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000009940 knitting Methods 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000005226 mechanical processes and functions Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N methanesulfonyl chloride Chemical compound CS(Cl)(=O)=O QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000028591 pheochromocytoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- MNWBNISUBARLIT-UHFFFAOYSA-N sodium cyanide Chemical compound [Na+].N#[C-] MNWBNISUBARLIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C213/00—Preparation of compounds containing amino and hydroxy, amino and etherified hydroxy or amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
- C07C213/08—Preparation of compounds containing amino and hydroxy, amino and etherified hydroxy or amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton by reactions not involving the formation of amino groups, hydroxy groups or etherified or esterified hydroxy groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C217/00—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
- C07C217/54—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and amino groups bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
- C07C217/56—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and amino groups bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton with amino groups linked to the six-membered aromatic ring, or to the condensed ring system containing that ring, by carbon chains not further substituted by singly-bound oxygen atoms
- C07C217/60—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and amino groups bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton with amino groups linked to the six-membered aromatic ring, or to the condensed ring system containing that ring, by carbon chains not further substituted by singly-bound oxygen atoms linked by carbon chains having two carbon atoms between the amino groups and the six-membered aromatic ring or the condensed ring system containing that ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种儿茶酚胺免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法。本发明制备的儿茶酚胺免疫原,免疫原性高,可以诱导得到高效价的抗儿茶酚胺特异性抗体,并且与常见的62种药物无任何交叉反应;由该抗体制备得到的儿茶酚胺检测试剂,可以精确快速地确定样品中的儿茶酚胺含量。与市场上现有的检测试剂比较,本发明检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点,还能有效降低儿茶酚胺检测成本,有利于临床大规模推广使用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及儿茶酚胺免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法。
背景技术
儿茶酚胺(catecholamine)是一类由酪氨酸衍生而来,含有儿茶酚和胺基的小分子物质的统称,常见的儿茶酚胺类物质主要包括肾上腺素(epinephrine,E)、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)和多巴胺(dopamine,DA)等(结构式如式1所示)。在人体内,儿茶酚胺类物质主要由肾上腺髓质和交感神经元的嗜铬细胞所分泌,作为一类重要的神经递质和激素,在人体中具有重要的生理作用,对心血管系统、神经系统、内分泌腺、肾脏、平滑肌等组织器官具有广泛的调节作用。其中多巴胺在大脑和神经信号传导中起着十分重要的作用,可以提高神经系统反应速度,增强机体适应环境的能力。
多种疾病会导致儿茶酚胺类物质的分泌和代谢异常,如嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、神经母细胞瘤和肾上腺髓质增生等疾病。这些疾病患者体内儿茶酚胺的浓度会发生异常变化,进而影响与儿茶酚胺相关生理功能的正常实现。此外,体液中儿茶酚胺水平还与高血压、更年期综合征等有着密切的关系。因此,检测血浆和尿液中儿茶酚胺类物质的浓度对于这些疾病的临床诊断和治疗以及药物药理作用的研究均具有重要意义。
目前,国内外用于生物样品中儿茶酚胺类物质的分析方法主要有:高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、毛细管电泳-激光诱导荧光法(CE-LIF)、荧光光度法(FL)、质谱法(MS)、气相色谱法(GC)、电化学分析法(ECD)及化学发光 法(CL)等。这些方法各有其优劣之处,但是在临床大规模应用上都有一定的局限性。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的儿茶酚胺检测试剂,尤其是质量好的自动化检验试剂,因此,研发生产质量达到临床要求、实用性强、性价比高,可应用于全自动生化分析仪的儿茶酚胺测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
发明内容
本发明为了克服现有技术存在的缺陷,采用全新的儿茶酚胺衍生物制备免疫原性强的儿茶酚胺免疫原及其抗体,用该抗体制备的儿茶酚胺均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对儿茶酚胺高通量、快速化的检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点,还能有效降低儿茶酚胺检测成本,有利于临床推广使用。
本发明的一个目的在于提供一种儿茶酚胺衍生物。
本发明的另一个目的在于提供一种免疫原性强的儿茶酚胺免疫原。
本发明的另一个目的在于提供一种儿茶酚胺免疫原的制备方法。
本发明的又一个目的在于提供使用本发明儿茶酚胺免疫原制备得到的特异性强的抗儿茶酚胺特异性抗体。
本发明的再一个目的在于提供一种儿茶酚胺检测试剂。
免疫原性与所合成的儿茶酚胺衍生物分子结构及所选载体种类有关,现有技术中儿茶酚胺免疫原的免疫原性较弱,所得到抗体的特异性、与儿茶酚胺的结合力,敏感度都不如本发明。本发明的儿茶酚胺免疫原,免疫原性高,可以诱导得到高效价的抗儿茶酚胺特异性抗体。该抗体特异性高,与儿茶酚胺的结合力强。由该抗体制备得到的儿茶酚胺检测试剂,可以快速、准确地确定样品中的儿茶酚胺含量。本发明是通过以下技术方案实现的:
一种儿茶酚胺免疫原,其结构式如式(Ⅰ)所示:
式中,R为连接基团-(CH2)n-COO-,n是1至20之间的整数,优选R为 -(CH2)3-COO-。
载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽,优选为血清蛋白、血蓝蛋白和甲状腺球蛋白,更优选为血清白蛋白,进一步优选为牛血清白蛋白。
当R为-(CH2)n-COO-时,该儿茶酚胺免疫原的合成途径和方法如下:
1.儿茶酚胺衍生物的制备方法:
一种儿茶酚胺衍生物,其结构式如式(Ⅱ)所示:
式中,R为连接基团-(CH2)n-COO-,n是1至20之间的整数。
取n=3时,该儿茶酚胺衍生物的合成步骤如下:
当n为3以外的其余整数时,儿茶酚胺衍生物的合成步骤的区别仅在于:由 化合物2合成化合物3的步骤中,采用的原料4-溴丁酸乙酯替换为2-溴乙酸乙酯、3-溴丙酸乙酯或其余类似物。
2.儿茶酚胺免疫原的制备步骤:
(1)将载体蛋白200mg溶解于50ml 0.2M,pH 8.5的磷酸缓冲液中;
(2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解:200mg本发明合成的儿茶酚胺衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺、3.5ml乙醇、7.0ml 10mM,pH 5.0的磷酸钾缓冲液、200mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺,将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min;
(3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中,并在2~8℃下搅拌过夜,得到抗原;将合成好的抗原经过透析进行纯化,得到儿茶酚胺免疫原。
本发明中当n取1~20范围内的其他整数时,用上述方法可以制备出如式(Ⅰ)所示的儿茶酚胺免疫原。载体仍为具有免疫原性的蛋白质,可以是血清蛋白,血蓝蛋白和甲状腺球蛋白。优选的,载体为血清蛋白。更优选的,载体为牛血清白蛋白。
由于连接基团主要起小分子衍生物与载体的连接作用,免疫原性强弱与所合成的儿茶酚胺衍生物分子结构及所选载体种类有关,因此理论上n取1至20之间的任意整数时,儿茶酚胺衍生物制备的儿茶酚胺免疫原无显著差异,均具备强免疫原性,都能制备高效价的特异性抗体。
一种抗儿茶酚胺特异性抗体,由上述的儿茶酚胺免疫原免疫动物后生产得到。
所述的抗儿茶酚胺特异性抗体由上述制得的儿茶酚胺免疫原采用常规方法接种实验动物,加强免疫后取抗血清,具体步骤如下:
(1)用PBS将上述合成的连接BSA的儿茶酚胺免疫原稀释至1.0mg/ml,得到抗原溶液,然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
(2)2~3周后,再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一次,之后每隔四周注射一次,共计注射4次;
(3)对上述实验动物取血,分离纯化得到效价为1:30000-1:50000的抗儿茶酚胺特异性抗体。
本发明的抗儿茶酚胺特异性抗体为完整的抗体分子,也包括保留与儿茶酚胺 特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。
本发明的抗体为采用单一的儿茶酚胺免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体,或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体;所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马的一种,优选为兔。
本发明提供一种儿茶酚胺检测试剂,含有上述抗儿茶酚胺特异性抗体和指示试剂。
本发明指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂。优选的,指示试剂为酶试剂,由儿茶酚胺酶标偶联物和酶的底物所组成。
上述酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物;上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
儿茶酚胺均相酶免疫检测试剂在使用之前,为了避免指示试剂中的酶标偶联物和酶的底物发生反应,酶标偶联物和酶的底物是不混合的且分开放置,所以将酶的底物与上述抗儿茶酚胺特异性抗体混合在一起。因此,儿茶酚胺均相酶免疫检测试剂包括两类试剂:
(1)试剂A由抗儿茶酚胺特异性抗体和均相酶底物混合而成,具体制备步骤如下:
1)将4.036g(11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)用1L 55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物;
2)将制备的抗儿茶酚胺特异性抗体加到上述均相酶底物中,抗体与均相酶底物的体积比为1:100~1:10000;
(2)试剂B由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成,制备方法如下:
1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备:
a.称取15mg规格为100KU的G6PDH,室温溶解于12mL含有72.6mg(0.05M)Tris、8mgMgCl2(3.3mM)和100mg NaCl的溶液中,该溶液pH=9.0;
b.加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),135mg葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)以及0.75mL卡必醇;
c.逐滴加入2mL二甲基亚砜;
2)儿茶酚胺衍生物的激活:
a.在无水状态下称取10mg儿茶酚胺衍生物,溶解于600μL DMF中;
b.使上述溶液温度降到-2~-8℃;
c.加入3μL三丁胺;
d.加入1.5μL氯甲酸异丁酯;
e.-2~-8℃搅拌30分钟;
3)G6PDH与儿茶酚胺衍生物的连接:
a.将上述激活的儿茶酚胺衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中;
b.2-8℃搅拌过夜;
4)纯化产物:
通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物,获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物,于2-8℃下储存。
5)将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中,上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100~1:10000。
所述的抗儿茶酚胺特异性抗体与均相酶底物的体积比优选为1:400;
所述的儿茶酚胺酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比优选为1:1500。
本发明的儿茶酚胺免疫原特异性强、免疫原性高,制备出的抗儿茶酚胺特异性抗体特异性强、效价高,并且与常见的62种药物无任何交叉反应;含有上述抗儿茶酚胺特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的儿茶酚胺含量,并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品,实现儿茶酚胺的高通量快速化测定,准确度高,特异性强,精确度和检测效率相比之前都有了较大的提高,同时实现了检测过程的全自动化,对检测人员的要求不高,易于实现和推广使用。
附图说明
图1是儿茶酚胺的ELISA检测反应曲线;
图2是儿茶酚胺的均相酶免疫反应曲线。
具体实施方式
实施例一儿茶酚胺衍生物的合成及其定量检测
儿茶酚胺衍生物的化学结构如式(Ⅲ)所示:
上述儿茶酚胺衍生物的合成路线及制备步骤如下:
具体的合成步骤如下:
化合物2的合成
1)称取20.41g(147.9mmol)化合物1、25.29g(147.9mmol)苄基溴以及30.62g(221.9mmol)K2CO3,共同溶解于200mL丙酮中,室温下搅拌过夜。薄层色谱(TLC)检测显示反应物已反应完全。将反应后的合成溶液进行过滤,将滤液在真空中进行浓缩,浓缩后得到的残留物用300mL的EA稀释。用200mL纯化水与200mL卤水冲洗有机层,通过Na2SO4进行干燥,然后在真空中进行浓缩得到最终产物的粗制品,最后将此粗制品通过硅胶柱进行纯化制得17g白色固体化合物2,产率50.4%。
2)利用Bruker Avance III plus 400MHz和VARIAN MERCURY plus 300M对上述白色固体化合物进行核磁共振光谱扫描,采用TMS作为内标。结果如下: 1H NMR(CDCl3,400MHz):δ5.19(s,2H),5.87(s,1H),7.02-7.04(d,1H),7.38-7.45(t,7H),9.82(s,1H)。表征为上所示的化合物2。
化合物3的合成
1)称取17g(74.56mmol)化合物2、43.39g(223.68mmol)4-溴丁酸乙酯以及20.58g(149.12mmol)K2CO3,共同溶解与200mL乙腈中,80℃下搅拌过夜。TLC检测显示反应物已反应完全。将反应后的合成溶液进行过滤,将滤液在真空中进行浓缩得到最终产物的粗制品,最后将此粗制品通过硅胶柱进行纯化制得21g黄色油状化合物3,产率82.3%。
2)利用Bruker Avance III plus 400MHz和VARIAN MERCURY plus 300M对上述黄色油状化合物进行核磁共振光谱扫描,采用TMS作为内标。结果如下: 1H NMR(CDCl3,400MHz):δ1.23-1.27(t,3H),2.16-2.20(t,2H),2.53-2.57(t,2H), 4.11-4.16(m,4H),5.22(s,2H),6.98-7.00(d,1H),7.32-7.44(m,7H),9.82(s,1H)。表征为上所示的化合物3。
化合物4的合成
1)称取21g(61.4mmol)化合物3溶解于150mL乙醇中,然后在0℃下分批加入(3.5g,92.1mmol)NaBH4,将此混合物在室温下搅拌0.5小时。将上述反应混合物在0℃下加入300mL纯化水终止反应,然后使用3×300mL DCM进行萃取。最后将结合的有机层在真空中进行浓缩制得21g白色油状化合物4,产率99.9%。
2)利用Bruker Avance III plus 400MHz和VARIAN MERCURY plus 300M对上述白色油状化合物进行核磁共振光谱扫描,采用TMS作为内标。结果如下: 1H NMR(CDCl3,400MHz):δ1.23-1.26(t,3H),2.12-2.16(t,2H),2.52-2.53(t,2H),4.07-4.16(m,4H),4.58-4.59(d,2H),5.11(s,2H),6.82-6.89(q,2H),6.95(s,1H),7.29-7.44(m,5H)。表征为上所示的化合物4。
化合物5的合成
1)称取21g(61mmol)化合物4和12.33g(122mmol)三乙胺,共同溶解于200mL的DCM中,制成混合溶液。将10.5g(91.5mmol)甲磺酰氯溶解于20mL的DCM中,得到的溶液在0℃下逐滴加入上述混合溶液中。将此混合物在室温下搅拌2小时,在上述反应混合物中加入300mL纯化水终止反应,然后使用3×300mL的DCM进行萃取。将结合的有机层在真空中进行浓缩制得21g黄色油状化合物5粗品,产率81.5%。
化合物6的合成
1)称取21g(49.7mmol)化合物5和3.7g(74.6mmol)NaCN,共同溶解于200mL的DMF中,然后在60℃下搅拌过夜。在上述反应混合物中加入300mL纯化水终止反应,然后使用3×300mL的EA进行萃取。将结合的有机层在真空中进行浓缩得到最终产物的粗制品,最后将此粗制品通过硅胶柱进行纯化制得12.8g白色固体化合物6,产率73.1%。
2)利用Bruker Avance III plus 400MHz和VARIAN MERCURY plus 300M对上述白色固体化合物进行核磁共振光谱扫描,采用TMS作为内标。结果如下: 1H NMR(CDCl3,400MHz):δ1.23-1.27(t,3H),2.13-2.16(t,2H),2.52-2.55(t,2H),3.65(s,2H),4.06-4.16(m,4H),5.11(s,2H),6.79-6.89(m,3H),7.30-7.43(m,5H)。表征为上所示的化合物6。
化合物7的合成
1)称取8g(22.66mmol)化合物6和10g(45.3mmol)Boc2O,共同溶解于100mL乙醇中,然后加入8g雷尼镍(Rany Ni)。将此混合物在50Psi的氢气(H2)保护下于室温下搅拌5小时。将反应后的合成溶液进行过滤,将得到的滤液在真空中进行浓缩得到最终产物的粗制品,最后将此粗制品通过硅胶柱进行纯化制得8.4g白色固体化合物7,产率81.2%。
化合物8的合成
1)称取8.4g(18.4mmol)化合物7和2g Pd/C催化剂,共同溶解于100mL乙醇中,然后在室温下搅拌2小时。将反应后的合成溶液进行过滤,将得到的滤液在真空中进行浓缩得到最终产物的粗制品,最后将此粗制品通过硅胶柱进行纯化制得6.1g白色固体化合物8,产率91%。
2)利用Bruker Avance III plus 400MHz和VARIAN MERCURY plus 300M对上述白色固体化合物进行核磁共振光谱扫描,采用TMS作为内标。结果如下: 1H NMR(CDCl3,400MHz):δ1.23-1.27(t,3H),1.43(s,9H),2.07-2.11(t,2H),2.48-2.52(t,2H),2.74-2.77(t,2H),3.34-3.36(t,2H),4.02-4.05(t,2H),4.11-4.16(m,2H),6.73-6.77(m,2H),7.02-7.04(d,1H)。表征为上所示的化合物8。
化合物9的合成
1)称取6.1g(16.6mmol)化合物8和3.5g(83mmol)LiOH,共同溶解于60mL甲醇中,然后在50℃下搅拌2小时。将此反应混合物在0℃下用100mL纯化水稀释,然后用HCl(2N)调节至PH=3。将反应后的混合物用3×100mL的DCM进行萃取。将结合的有机层在真空中进行浓缩得到最终产物的粗制品,最后将此粗制品通过硅胶柱进行纯化制得5.2g白色固体化合物9,产率92.9%。
2)利用Bruker Avance III plus 400MHz和VARIAN MERCURY plus 300M对上述白色固体化合物进行核磁共振光谱扫描,采用TMS作为内标。结果如下: 1H NMR(CDCl3,400MHz):δ1.43(s,9H),2.16(s,2H),2.54-2.56(d,2H),2.69(s,2H),3.32-3.33(d,2H),4.08-4.11(t,2H),6.66-6.69(m,2H),6.82-6.54(d,1H)。表征为上所示的化合物9。
儿茶酚胺衍生物的合成
1)称取2.2g(16.6mmol)化合物9,溶解于25mL HCl/EA中,然后在室温下搅拌2小时。将搅拌后得到的沉淀物进行过滤,过滤后得到的滤饼用EA进行冲洗,最终得到1.4g白色固体化合物(compound 1),即儿茶酚胺衍生物,产率78.65%。
2)利用Bruker Avance III plus 400MHz和VARIAN MERCURY plus 300M对上述白色固体化合物进行核磁共振光谱扫描,采用TMS作为内标。结果如下: 1H NMR(DMSO,400MHz):δ1.93(s,2H),2.44-2.45(d,2H),2.75(s,2H),2.95(s,2H),3.95(s,2H),6.61-6.63(d,1H),6.69-6.74(t,1H),6.80(s,1H),7.99(s,3H),8.77-8.78(s,1H)。表征为上所示的化合物(compound 1),即儿茶酚胺衍生物。
3)利用色谱/质谱技术(LC/MS)对得到的衍生物进行分析鉴定,确定该最终所得化合物(compound 1)为式(Ⅲ)所示的儿茶酚胺衍生物。
本实施例中,儿茶酚胺衍生物的制备过程中,化合物3的合成步骤选用了4-溴丁酸乙酯为合成原料,故所得的最终产物儿茶酚胺衍生物的链接基团R为-(CH2)3-COO-。当n取其他数值时,选用其他4-溴丁酸乙酯类似物进行实验,合成方法完全一致。4-溴丁酸乙酯类似物包括2-溴乙酸乙酯、3-溴丙酸乙酯、5-溴戊酸乙酯、6-溴己酸乙酯等等。
实施例二儿茶酚胺免疫原的合成
儿茶酚胺免疫原由牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)与式(Ⅱ)所示的儿茶酚胺衍生物的-(CH2)n-COO-基团连接而成,在本实施例中,以n=3为例详细说明该免疫原的合成方法,具体步骤如下:
1.将牛血清白蛋白200mg溶解于50ml 0.2M,pH 8.5的磷酸缓冲液中;
2.将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解:200mg合成的儿茶酚胺衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺、3.5ml乙醇、7.0ml 10mM,pH 5.0的磷酸钾缓冲液、 200mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺,将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min;
3.将溶解好的溶液滴加至BSA溶液中,并在2~8℃下搅拌过夜,得到抗原;将合成好的抗原经过透析进行纯化,得到儿茶酚胺免疫原。
实施例三:抗儿茶酚胺特异性抗体的制备
将实施例二制备得到的儿茶酚胺免疫原采用常规方法接种实验动物兔,加强免疫后取抗血清,具体步骤如下:
1.用PBS将上述合成的儿茶酚胺免疫原稀释至1.0mg/ml,得到抗原溶液,然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合,对实验动物兔进行注射。
2.2~3周后,再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次,之后每隔四周注射一次,共计注射4次。
3.对步骤2的实验动物兔取血,分离纯化得到效价为1:30000-1:50000的抗儿茶酚胺特异性抗体。
实施例四:儿茶酚胺ELISA检验
1.儿茶酚胺ELISA检测标准曲线的建立
(1)标准品的制备
将儿茶酚胺粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液,制备成1mg/ml的储存液。用ELISA缓冲液将储存液依次稀释为1600.00pg/mL、800.00pg/mL、400.00pg/mL、200.00pg/mL、100.00pg/mL和0.00pg/mL的标准溶液。其中,ELISA缓冲液含有50.0mM Tris,145mMNaCl和0.25%的BSA。
(2)利用儿茶酚胺的ELISA检验方法制备标准曲线
用PBS将实施例三中所制备的抗儿茶酚胺抗体稀释成1:8000的终浓度溶液,100μL/孔包被在96孔酶联板上,4℃放置12-24h;用PBS将上述包被有抗儿茶酚胺抗体的96孔酶联板洗涤3次后,加入200μL/孔的0.5%的BSA溶液,4℃封闭放置8-16h。然后用PBS洗涤3次,加入20μL/孔的标准品。再加入100μL/孔工作浓度的HRP-儿茶酚胺偶联物;室温下孵育30min后PBS洗板5次;然后每孔加入100μL TMB底物,室温孵育30min。再每孔加入100μ L终止液(2M硫酸)。测定450nm的吸光值。根据各标准品所对应的450nm的吸光值定标,制作标准曲线,结果如附图1所示。
2.待测样品中儿茶酚胺含量的检测
(1)制作待测样品
制备方法:将儿茶酚胺粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液制成1μg/mL的储存液,并将此储存液稀释于空白血浆中,至终浓度分别为0.00,50.00,500.00,1500.00pg/mL,形成空白、低、中、高浓度的血浆样本。该空白血浆为不含儿茶酚胺的健康人血浆。
(2)测试方法
利用上述儿茶酚胺的ELISA检验方法,将上述空白、低、中、高浓度的血浆样本代替标准品,测试上述空白、低、中、高浓度的血浆样本在450nm的吸光值。
(3)测试结果
对照图1中所示的儿茶酚胺ELISA检验的标准曲线,计算每个样本中儿茶酚胺含量,并对每个样本进行3个复孔测定,根据上述样本中儿茶酚胺的实际含量计算回收率,结果如表1所示。
表1儿茶酚胺的ELISA检测回收实验
由表1中结果可知:采用本发明儿茶酚胺ELISA检测试剂测定不同浓度样品中的儿茶酚胺回收率都较高,均>90%,说明本发明所述的抗儿茶酚胺特异性抗体可以用于样本中儿茶酚胺的检测,并且结果准确度高。
实施例五:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备
1.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备:
(1)准确称取15mg规格为100KU的G6PDH,室温溶解于12mL含有72.6 mg(0.05M)Tris、8mg MgCl2(3.3mM)和100mg NaCl的溶液中,该溶液pH=9.0,本步骤在烧杯C中进行。
(2)在上述烧杯C中加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),135mg葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)以及0.75mL卡必醇(Carbitol)。
(3)在上述烧杯C中再逐滴加入2mL二甲基亚砜(dimethy sulfoxide,DMSO)。
2.儿茶酚胺衍生物的激活:
(1)在无水状态下称取10mg上述儿茶酚胺衍生物,溶解于600μL DMF中。
(2)使上述溶液温度降到-2~-8℃。
(3)加入3μL三丁胺(tributylamine)。
(4)加入1.5μL氯甲酸异丁酯(isobutylchloroformate)。
(5)-2~-8℃搅拌30分钟。
3.G6PDH与儿茶酚胺衍生物的连接:
(1)将上述激活的儿茶酚胺衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中。
(2)2-8℃搅拌过夜。
4.纯化产物:
通过G-25凝胶层析柱纯化步骤3中的溶液,获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物,于2-8℃下储存。
实施例六:儿茶酚胺均相酶免疫检测试剂的制备
1.试剂A的制备:将4.036g(11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)置于烧杯D中,用1L 55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物;将上述制备的抗儿茶酚胺特异性抗体加到上述均相酶底物中,抗体与均相酶底物的体积比可以为1:100~1:10000,在本实施例中的比例为1:400。
2.试剂B的制备:将实施例五制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中,上述偶联物与Tris缓冲液的体积比可以为 1:100~1:10000,在本实施例中的比例为1:1500。
实施例七:儿茶酚胺均相酶免疫检验及结果
1.获得标准曲线:
(1)设置迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数(见表2)。
(2)操作步骤为:先加试剂A,再加入标准品,最后加入试剂B。加入试剂B后,测定不同时间点的OD340吸光值,算出不同标准品浓度时的反应速率,实际操作过程中需不断调整试剂A和试剂B的体积比例,同时调整测光点,最后得出较理想的反应标准曲线图,如图2所示。
表2迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数
2.样本检测:通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线,重复测定低、中、高浓度质控样本10次,上述质控样本为:将儿茶酚胺标准品溶解于人血浆中,至浓度分别为50.00,300.00,800.00ng/ml。检测数据及数据分析见表3。
表3样品测定及精密度和回收率评估
检测结果:本发明的均相酶免疫检测试剂测定的准确度高,回收率达到95%-105%,精密度高,CV均低于5%。
实施例八:药物干扰试验
选取62种常见药物进行干扰检测,调整浓度至1.00μg/ml,采用实施例七的均相酶免疫方法进行测定:
1.将待测干扰药物与实施例六制备的试剂A接触反应,再加入试剂B;
2.检测上述混合溶液的OD340吸光值,根据实施例七的标准曲线得到相应物质的浓度。
常见的62种药物名称以及测定结果具体参见表4。
表4常见干扰药物测定结果
测定结果显示:上述62种常见药物等价于儿茶酚胺的浓度均小于0.01μg/ml。由此可见,本发明的抗体是抗儿茶酚胺的特异性抗体,与其它药物无交叉反应。
需要说明的是,以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种儿茶酚胺免疫原,其结构式如式(Ⅰ)所示:
式中,R为连接基团-(CH2)n-COO-,n是3;载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽,选自血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种。
2.一种儿茶酚胺衍生物,结构式如式(Ⅱ)所示:
上述R为连接基团-(CH2)n-COO-,n为3。
3.根据权利要求2所述的儿茶酚胺衍生物的制备方法,其特征在于,儿茶酚胺衍生物的合成步骤如下:
4.一种抗儿茶酚胺特异性抗体,由权利要求1所述的儿茶酚胺免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子。
5.根据权利要求4所述的一种抗儿茶酚胺特异性抗体,其特征在于所述的完整的抗体分子,为采用单一的儿茶酚胺免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体,或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体;所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马的一种。
6.一种如权利要求4或5所述的抗儿茶酚胺特异性抗体的制备方法,其特征在于包含以下步骤:
(1)用PBS将连接有牛血清白蛋白的儿茶酚胺免疫原稀释至1.0mg/ml,得到抗原溶液,然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
(2)2~3周后,再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一次,之后每隔四周注射一次,共计注射4次;
(3)对步骤(2)的实验动物取血,分离纯化得到效价为1:30000-1:50000的抗儿茶酚胺特异性抗体。
7.一种儿茶酚胺检测试剂,含有权利要求4或5所述的抗儿茶酚胺特异性抗体和指示试剂,所述的指示试剂选自酶试剂;所述的酶试剂由儿茶酚胺酶标偶联物和酶的底物组成,酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物,酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
8.一种如权利要求7所述的儿茶酚胺检测试剂的制备方法,其特征在于包含以下步骤:
(1)试剂A:将4.036g、11.25mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和1.711g、11.25mM葡萄糖-6-磷酸用1L 55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物;将权利要求4-5中任一项所述的抗儿茶酚胺特异性抗体加到上述均相酶底物中,抗儿茶酚胺特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:100~1:10000;
(2)试剂B:将儿茶酚胺酶标偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中,儿茶酚胺酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100~1:10000。
9.根据权利要求7所述的儿茶酚胺检测试剂的制备方法,其特征在于所述的儿茶酚胺酶标偶联物的制备方法包含以下步骤:
(1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备:称取15mg规格为100KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,室温溶解于12mL含有72.6mg 0.05M Tris、8mg 3.3mM MgCl2和100mg NaCl的溶液中,pH=9.0;在溶液中加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、135mg葡萄糖-6-磷酸以及0.75mL卡必醇;再逐滴加入2mL二甲基亚砜;
(2)儿茶酚胺衍生物的激活:在无水状态下称取10mg的权利要求2所述的儿茶酚胺衍生物,溶解于600μL二甲基甲酰胺中;使上述溶液温度降到-2~-8℃;加入3μL三丁胺;加入1.5μL氯甲酸异丁酯;-2~-8℃搅拌30分钟;
(3)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与儿茶酚胺衍生物的连接:将步骤(2)激活的儿茶酚胺衍生物溶液逐滴加入到步骤(1)溶解的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中;2-8℃搅拌过夜;
(4)纯化产物:通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物,获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物,于2-8℃下储存。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510236349.XA CN104774256B (zh) | 2015-05-11 | 2015-05-11 | 儿茶酚胺免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510236349.XA CN104774256B (zh) | 2015-05-11 | 2015-05-11 | 儿茶酚胺免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104774256A CN104774256A (zh) | 2015-07-15 |
CN104774256B true CN104774256B (zh) | 2018-04-20 |
Family
ID=53616051
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510236349.XA Active CN104774256B (zh) | 2015-05-11 | 2015-05-11 | 儿茶酚胺免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104774256B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105175530A (zh) * | 2015-08-14 | 2015-12-23 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 一种香草扁桃酸免疫检测试剂及其制备方法 |
CN108181460B (zh) * | 2017-12-22 | 2020-08-07 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 用于血管紧张素ⅰ检测的二肽衍生物及其制备方法和应用 |
CN108120838B (zh) * | 2017-12-22 | 2020-06-30 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 用于血管紧张素ⅱ检测的二肽衍生物及其制备方法和应用 |
CN108680755B (zh) * | 2018-05-11 | 2020-10-16 | 中国农业大学 | 磺胺增效剂半抗原和全抗原及其制备方法与应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103804491A (zh) * | 2014-02-11 | 2014-05-21 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 1,5-脱水山梨醇免疫原及其特异性抗体及检测试剂 |
CN104535763A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-04-22 | 爱斯杰科环球有限责任公司 | β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法 |
CN104530222A (zh) * | 2014-12-20 | 2015-04-22 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 紫杉醇免疫原、抗紫杉醇特异性抗体和紫杉醇检测试剂 |
CN104557722A (zh) * | 2014-12-20 | 2015-04-29 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 肌酐衍生物、肌酐免疫原及其特异性抗体与肌酐检测试剂盒 |
-
2015
- 2015-05-11 CN CN201510236349.XA patent/CN104774256B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103804491A (zh) * | 2014-02-11 | 2014-05-21 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 1,5-脱水山梨醇免疫原及其特异性抗体及检测试剂 |
CN104530222A (zh) * | 2014-12-20 | 2015-04-22 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 紫杉醇免疫原、抗紫杉醇特异性抗体和紫杉醇检测试剂 |
CN104557722A (zh) * | 2014-12-20 | 2015-04-29 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 肌酐衍生物、肌酐免疫原及其特异性抗体与肌酐检测试剂盒 |
CN104535763A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-04-22 | 爱斯杰科环球有限责任公司 | β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
儿茶酚胺人工抗原的合成;吴乾虎等;《中国免疫学杂志》;19881027;第4卷(第5期);第293页左栏第1-2段 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104774256A (zh) | 2015-07-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102768284B (zh) | 一种卡马西平均相酶免疫检测试剂的制备方法 | |
CN104774256B (zh) | 儿茶酚胺免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法 | |
CN107365342B (zh) | 醛固酮衍生物、免疫原、及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法、试剂盒 | |
CN104447984B (zh) | 多西紫杉醇免疫原、抗多西紫杉醇特异性抗体和多西紫杉醇检测试剂 | |
CN104788560B (zh) | 环孢霉素a免疫原、抗环孢霉素a特异性抗体和环孢霉素a检测试剂 | |
CN104530222A (zh) | 紫杉醇免疫原、抗紫杉醇特异性抗体和紫杉醇检测试剂 | |
CN104804079B (zh) | 伊马替尼免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法 | |
CN107353200A (zh) | 一种香草扁桃酸衍生物、其合成方法及一种香草扁桃酸免疫原、其制备方法及其应用 | |
CN104569373B (zh) | 一种甲氨蝶呤均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法 | |
CN105131106A (zh) | 5-羟基吲哚乙酸免疫原、抗体和检测试剂及制备方法 | |
CN102757391B (zh) | 一种苯巴比妥衍生物及其制备方法和应用 | |
CN106596917B (zh) | 高香草酸均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法 | |
CN107973836B (zh) | 醛固酮衍生物及其制备方法、醛固酮均相酶免疫检测试剂 | |
CN103170309B (zh) | 一种莱克多巴胺抗体免疫亲和层析柱及其应用 | |
CN105175531A (zh) | 羟脯氨酸免疫原、特异性抗体、检测试剂及其制备方法 | |
CN104597238B (zh) | 一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法 | |
EP0569490A1 (en) | Haptens, tracers, immunogens and antibodies for immunoassays for cotinine | |
CN111233876A (zh) | 一种快速检测硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用 | |
CN107132349A (zh) | 一种同型半胱氨酸自动化检测试剂、制备方法及检测方法 | |
CN102295698B (zh) | 环孢霉素a免疫原、特异性抗体、检测试剂及检测试剂盒 | |
CN109884322A (zh) | 一种髓过氧化物酶检测试剂及其制备和使用方法 | |
CN104987392A (zh) | 脱氢表雄酮免疫原、衍生物、抗体和检测试剂及制备方法 | |
CN104557722B (zh) | 肌酐衍生物、肌酐免疫原及其特异性抗体与肌酐检测试剂盒 | |
CN110967481B (zh) | 一种拉莫三嗪衍生物、其制备方法及其在均相酶免疫检测试剂中的应用 | |
CN108120838B (zh) | 用于血管紧张素ⅱ检测的二肽衍生物及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |