CN104535763A - β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法 - Google Patents

β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法 Download PDF

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CN104535763A CN201510042129.3A CN201510042129A CN104535763A CN 104535763 A CN104535763 A CN 104535763A CN 201510042129 A CN201510042129 A CN 201510042129A CN 104535763 A CN104535763 A CN 104535763A
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Abstract

本发明涉及一种β-受体阻断剂检测试剂及其制备和检测方法，具体涉及一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法，包括：抗β-受体阻断剂特异性抗体、用于检测抗β-受体阻断剂特异性抗体-β-受体阻断剂复合物的指示试剂；上述抗β-受体阻断剂特异性抗体由吲哚洛尔免疫原免疫动物得到。本发明的有益之处在于：本发明的吲哚洛尔免疫原特异性强、免疫原性高，制备出的抗体是能与吲哚洛尔、比索洛尔、阿替洛尔、美托洛尔和普萘洛尔等各种常用的β-受体阻断剂特异性结合的抗β-受体阻断剂特异性抗体，且特异性强、效价高，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；含有上述抗β-受体阻断剂特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中上述各种β-受体阻断剂的含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现β-受体阻断剂的高通量、快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率较其它方法有了较大的提高。

Description

β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法
技术领域
本发明涉及一种β-受体阻断剂检测试剂及其制备和检测方法，具体涉及一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法。
背景技术
β-受体阻断剂(Beta Blockers)全称为β-肾上腺素能受体阻断剂，主要通过阻断β-受体(β1-受体或β2-受体)与儿茶酚胺类物质的结合，从而对心血管系统、代谢系统、支气管平滑肌等施予调节作用。β-受体阻断剂的出现是近代药理学的一项重大进展。1962年第一种β-受体阻断剂普萘洛尔(心得安)问世并应用于临床实践。至今，全世界已合成的β-受体阻断剂数以千计，被批准用于人类疾病治疗并已生产上市者也已有几十种。目前，最常用的β-受体阻断剂包括：普萘洛尔、阿替洛尔、美托洛尔、吲哚洛尔以及比索洛尔等数十种。β-受体阻断剂主要用于治疗慢性心力衰竭、心绞痛、心肌梗死、高血压、心律失常、高动力心脏综合征、肥厚型心肌病、冠状动脉疾病、二尖瓣狭窄以及β-受体功能亢进症等多种心血管疾病。此外，β-受体阻断剂还可用于马凡综合征、甲状腺机能亢进症、青光眼等其它疾病的防治。β-受体阻断剂问世50多年来，其应用经久不衰，临床适应症范围不断拓宽，疗效更好的新品种不断涌现，使其在人类心血管疾病及其它多种疾病的治疗中起到十分重要的作用，正因为如此，β-受体阻断剂(心得安)的发明者James Black获得了1988年的诺贝尔生理或医学奖。
由于β-受体阻断剂可用来提高运动成绩，因此国际奥委会将此类药物列为禁用药物。对β-受体阻断剂的检测分析不仅在临床药物浓度监测、生物利用度分析、药代动力学研究等方面有重要意义，而且在体育比赛的赛后尿检中也具有重要价值。β-受体阻断剂的分析测定多是针对生物样本中的原型药和代谢物进行的，目前国内外常用的测定方法有：气-液色谱法、高效液相色谱法、反相液相色谱法、气相色谱法、质谱法、气质联用法、液相串联质谱法、荧光分光光度法、薄层色谱法、毛细管电泳法、碳糊电极法、放射免疫分析法等，这些方法各有其特点及优劣，但是都不适用于大批量临床样本的快速检测，并且常用的检测方法只能针对单一的一种β-受体阻断剂进行测定。目前市场上还没有一款能同时测定多种常见的β-受体阻断剂，且稳定性好、灵敏度高、特异性强的β-受体阻断剂检测试剂，尤其是质量好的自动化检测试剂，因此，研发生产质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的β-受体阻断剂测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
吲哚洛尔是一种具有β-受体阻断剂类药物典型结构的常用药物，其结构式如式(Ⅳ)所示：
本发明中以吲哚洛尔衍生物制备的免疫原免疫原性强，以此免疫原诱导动物所产生的特异性抗体可以与吲哚洛尔、比索洛尔、阿替洛尔、美托洛尔和普萘洛尔等各种常用的β-受体阻断剂特异性结合，且结合能力强。本发明制备的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上同时测定同一样本中各种常用的β-受体阻断剂的含量，且具有高通量、检测速度快、操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低β-受体阻断剂检测成本，有利于临床推广使用。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种既安全又可快速、高效、灵敏、准确检测出待测样本中β-受体阻断剂含量的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂及其制备方法，以及可以与各种类型的自动生化分析仪联用、对检测人员要求不高的β-受体阻断剂均相酶免疫检测方法。
为了实现上述目标，本发明采用的技术方案是：
一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗β-受体阻断剂特异性抗体、用于检测抗β-受体阻断剂特异性抗体-β-受体阻断剂复合物的指示试剂；上述β-受体阻断剂具体包括吲哚洛尔、比索洛尔、阿替洛尔、美托洛尔和普萘洛尔中的一种或多种；上述抗β-受体阻断剂特异性抗体由吲哚洛尔免疫原免疫动物得到，吲哚洛尔免疫原的结构式如式(Ⅰ)所示：
式中，R为连接基团-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的任意整数，载体具有免疫原性的蛋白质，载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白；上述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或化学发光试剂。
前述的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，R为-(CH2)3-COO-。
前述的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，上述由吲哚洛尔免疫原免疫动物得到的抗β-受体阻断剂特异性抗体能识别并结合各种β-受体阻断剂的核心结构，所述各种β-受体阻断剂的核心结构，其结构式如式(Ⅱ)所示：
前述的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，上述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
前述的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与吲哚洛尔衍生物偶联形成，上述吲哚洛尔衍生物的结构式如式(Ⅲ)所示：
上述R为-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数。
n＝3时，上述的吲哚洛尔衍生物的合成路线为：
前述的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，上述R为-(CH2)3-COO-。
一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)吲哚洛尔衍生物的合成与纯化，并进行结构鉴定；
(2)吲哚洛尔免疫原的合成：使吲哚洛尔衍生物的-(CH2)n-COO-基团与具有免疫原性的蛋白质载体连接，n为1至20之间的整数；
(3)用吲哚洛尔免疫原免疫动物，制备并纯化抗β-受体阻断剂特异性抗体；
(4)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备：制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液，激活吲哚洛尔衍生物，使G6PDH与吲哚洛尔衍生物连接，纯化连接产物；
(5)β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备：
试剂A的制备：由抗β-受体阻断剂特异性抗体和均相酶底物混合而成；
试剂B的制备：由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成。
前述的一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备方法，所述的步骤(2)中，蛋白质载体为BSA，n＝3，具体合成步骤如下：
1)将20mg BSA溶解于5ml 0.2M、pH 8.5的PBS中，上述溶液置于烧杯A中；
2)将如下化学品加入到烧杯B中搅拌溶解：20mg吲哚洛尔衍生物、0.35ml二甲基甲酰胺DMF、0.35ml乙醇、0.7ml 10mM pH 5.0的磷酸钾缓冲液、40mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，于室温下搅拌溶解，反应30分钟；
3)将烧杯B中的溶液滴加至烧杯A中，得到混合溶液，在2～8℃下搅拌过夜；将上述搅拌后的混合溶液经过中性磷酸盐缓冲液透析纯化，得到BSA-吲哚洛尔免疫原，储存于-20℃。
前述的一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备方法，所述的步骤(4)具体过程为：
1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备：
a.称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg(0.05M)Tris、8mg MgCl2(3.3mM)和100mg NaCl的溶液中，该溶液pH＝9.0；
b.加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，135mg葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)以及0.75mL卡必醇；
c.逐滴加入2mL二甲基亚砜；
2)β-受体阻断剂衍生物的激活：
a.在无水状态下称取10mgβ-受体阻断剂衍生物，溶解于600μLDMF中；
b.使上述溶液温度降到-2～-8℃；
c.加入3μL三丁胺；
d.加入1.5μL氯甲酸异丁酯；
e.-2～-8℃搅拌30分钟；
3)G6PDH与β-受体阻断剂衍生物的连接：
a.将上述激活的β-受体阻断剂衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中；
b.2-8℃搅拌过夜；
4)纯化产物：
通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
前述的一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备方法，步骤(5)的具体过程如下：
试剂A的制备：将4.036g(11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)用1L 55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将制备的抗β-受体阻断剂特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；
试剂B的制备：将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100～1:10000。
利用β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将待测样本与抗β-受体阻断剂特异性抗体接触；
2)根据待测样本中β-受体阻断剂与抗β-受体阻断剂特异性抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中β-受体阻断剂的含量；所述待测样本为各种生理样本，例如尿液、血清、血浆、唾液等。优选的，待测样本为尿液。
上述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸；上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与吲哚洛尔衍生物偶联形成；
上述吲哚洛尔衍生物的结构式如式(Ⅲ)所示：
上述R为-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数。
本发明的有益之处在于：本发明的吲哚洛尔免疫原特异性强、免疫原性高，制备出的抗体是能与吲哚洛尔、比索洛尔、阿替洛尔、美托洛尔和普萘洛尔等各种常用的β-受体阻断剂特异性结合的抗β-受体阻断剂特异性抗体，且特异性强、效价高，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；含有上述抗β-受体阻断剂特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中上述各种β-受体阻断剂的含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现β-受体阻断剂的高通量、快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率相比其它方法都有了较大的提高，同时实现了检测过程的全自动化，对检测人员的要求不高，易于实现和推广使用。
附图说明
图1是β-受体阻断剂均相酶免疫反应标准曲线图；
图2是β-受体阻断剂均相酶免疫相关性分析图。
具体实施方式
本发明所采取的技术方案是：
吲哚洛尔免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：
式中，R为连接基团，可以是-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数，特别的，R为-(CH2)3-COO-；载体具有免疫原性，优选的，载体为具有免疫原性的蛋白质。虽然其他足够大的具备免疫原性的物质也可以作为载体，但通常情况下选用蛋白质作为载体。最常用的免疫原性载体包括血清蛋白，血蓝蛋白(KLH)和甲状腺球蛋白。本发明中的载体优选为血清蛋白。
一种抗β-受体阻断剂特异性抗体，由式(Ⅰ)所示的吲哚洛尔免疫原免疫动物得到。
本发明中所指的“抗体”不仅仅指完整的抗体分子，也包括保留完整抗体特异性结合能力的抗体片断或者衍生物。本发明的抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，优选为多克隆抗体。
获得多克隆抗体的方法是使用式(Ⅰ)所示的吲哚洛尔免疫原，在加或者不加佐剂后，在动物的一个或者多个部位进行免疫，宿主动物包括：兔，山羊，小鼠，绵羊，豚鼠或马。持续免疫一直进行，直至抗体效价达到最高。动物定时采血得到适量的特异抗血清，抗血清可以纯化。
单克隆抗体可通过体细胞杂交技术来制作。
一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，包括：上述抗β-受体阻断剂特异性抗体、用于检测抗β-受体阻断剂特异性抗体-β-受体阻断剂复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。优选的，指示试剂为酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物。其中，酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，其可通过化学合成方法得到。
上述β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的使用方法，包括以下步骤：
1)将待测样本与上述抗β-受体阻断剂特异性抗体接触；
2)根据待测样本中β-受体阻断剂与上述抗β-受体阻断剂特异性抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中β-受体阻断剂的含量。
所述待测样本为尿液、血清、血浆或唾液，优选的，待测样本为尿液。
下面结合具体的实施例，进一步说明本发明。
实施例一：吲哚洛尔衍生物的合成及其结构确认
以下实施例中使用的吲哚洛尔衍生物化学结构如式(Ⅴ)所示：
该吲哚洛尔衍生物的合成路线如下：
具体的合成步骤如下：
化合物2的合成
1)称取20.0g(150mmol)化合物1和15.3g(225mmol)的咪唑，共同溶解于200mL二甲基甲酰胺(DMF)中，称取27.0g(180mmol)的叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)溶解于200mL DMF中，在0℃下将TBSCl溶液逐滴加入上述化合物1与咪唑的混合溶液中，将得到的混合溶液在室温下搅拌过夜。薄层色谱(TLC)检测显示上述混合溶液已反应完全。将反应后的合成溶液用200mL水淬火终止反应，然后用3x300mL的丙烯酸乙酯(EA)进行萃取。用200mL水和200mL卤水冲洗相互结合的有机层，然后在真空中进行干燥和浓缩。将得到的残渣通过硅胶干燥柱进行干燥，然后用乙酸乙酯/石油醚(1:20～1:15-1:10)进行洗脱，得到23g淡黄色油状的化合物2，产率62.1％。
2)利用Bruker Avance III plus 400 MHz和VARIAN MERCURYplus 300M对上述淡黄色油状化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H NMR(CDCl3,400MHz):δ1.05(s,9H),6.51-6.52(m,1H),6.53-6.58(m,1H),7.02-7.10(m,3H),8.05(m,1H)。表征为上图所示的化合物2。
化合物3的合成
1)称取24.7g(100mmol)的化合物2搅拌溶解于400mL DMF中，加入16g(400mmol)NaH，然后在室温下搅拌30mins。称取78.0g(400mmol)4-溴丁酸乙酯溶解于80mL DMF中，然后将此溶液加入到上述化合物2与NaH的混合溶液中。将得到的混合物溶液在室温下搅拌过夜，TLC检测显示溶液中的起始原料已全部消耗完。将上述反应液用800mL水淬火终止反应，然后用3x300mL的EA进行萃取。将相互结合的有机层通过色谱柱进行浓缩与纯化，得到6.1g黄色油状的化合物3，产率24.7％。
2)利用Bruker Avance III plus 400 MHz和VARIAN MERCURYplus 300M对上述黄色油状化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H NMR(CDCl3,400MHz):δ1.24-1.27(t,3H),2.20-2.22(m,2H),2.57-2.60(t,2H),4.14-4.18(m,4H),6.49-6.51(d,1H),6.65(s,1H),7.02-7.10(m,3H),8.01(m,1H)。表征为上图所示的化合物3。
化合物4的合成
1)称取2.48g(10mmol)的化合物3和3.68g(40mmol)的2-(氯甲基)环氧乙烷溶解于15mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后在室温下加入0.56g(10mmol)KOH。将此混合物溶液在室温下搅拌1hrs。TLC检测显示溶液中的起始原料已全部消耗完。将上述反应液在0℃下用100mL水淬火终止反应，然后用3x30mL的EA进行萃取。将相互结合的有机层通过色谱柱进行浓缩与纯化，得到1.5g黄色油状的化合物4，产率50％。
2)利用Bruker Avance III plus 400 MHz和VARIAN MERCURYplus 300M对上述黄色油状化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H NMR(CDCl3,400MHz):δ1.23-1.27(t,3H),2.17-2.21(m,2H),2.45(s,1H),2.56-2.60(t,2H),2.79(t,1H),3.22(s,1H),4.13-4.17(m,5H),4.19-4.20(m,1H),6.50-6.52(d,1H),6.62(m,1H),6.97-7.12(m,3H)。表征为上图所示的化合物4。
化合物5的合成
1)称取3.03g(10mmol)的化合物4和2.36g(40mmol)的2-丙胺，溶解于30mL乙醇中并回流过夜。TLC检测显示上述混合溶液已反应完全。将上述反应物在真空中进行浓缩，得到1.81g无色固体化合物5，产率50％。
吲哚洛尔衍生物的合成
1)称取3.62g(10mmol)化合物5和NaOH 1.6g(40mmol)溶解于120mL四氢呋喃(THF)/H2O(1/1)的混合溶剂中，然后将此溶液在室温下搅拌1hr。TLC检测显示上述混合溶液已反应完全。用HCl(1M)将上述反应物的PH值调节至PH＝7。将此反应物在真空中进行浓缩得到最终产物的粗品，将此粗品通过制备级HPLC纯化，最终得到1g黄色固体化合物6，即吲哚洛尔衍生物，产率30％。
2)利用Bruker Avance III plus 400 MHz和VARIAN MERCURYplus 300M对上述黄色固体化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H NMR(DMSO,400MHz):δ0.97-0.99(d,6H),1.97-2.00(m,2H),2.38-2.56(m,2H),2.57-2.71(m,2H),2.72-2.71(m,1H),3.84-3.85(m,1H),3.87-4.19(m,3H),4.22-4.23(m,1H),6.40-6.50(m,2H),7.00-7.20(m,3H)。表征为上图所示的化合物6，即吲哚洛尔衍生物。
3)利用色谱/质谱技术(LCMS)对得到的衍生物进行分析鉴定，确定该最终所得化合物为式(Ⅴ)所示的吲哚洛尔衍生物。
本实施例中，n＝3时，吲哚洛尔衍生物的制备在合成化合物3时选用了4-溴丁酸乙酯为合成原料，故所得的最终产物吲哚洛尔衍生物的链接基团R为-(CH2)3-COO-，选用其它4-溴丁酸乙酯类似物进行实验时，除n取值不同外，合成方法完全一致。
实施例二：BSA-吲哚洛尔免疫原的合成
BSA-吲哚洛尔免疫原由牛血清白蛋白(BSA)与式(Ⅲ)所示的吲哚洛尔衍生物的-(CH2)n-COO-基团连接而成，在本实施例中，以n＝3为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：
(1)将20mg BSA溶解于5ml 0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液(Phosphate buffer solution，PBS)中，上述溶液置于烧杯A中；
(2)将如下化学品加入到烧杯B中搅拌溶解：20mg吲哚洛尔衍生物，0.35ml二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)，0.35ml乙醇，0.7ml 10mM pH 5.0的磷酸钾缓冲液。40mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS)，于室温下搅拌溶解，反应30分钟；
(3)将烧杯B中的溶液滴加至烧杯A中，得到混合溶液，在2～8℃下搅拌过夜；将上述搅拌后的混合溶液经过中性磷酸盐缓冲液透析(4×4L)纯化，得到BSA-吲哚洛尔免疫原，储存于-20℃。
类似的，n取1～20范围内的其他整数时，用同样的方法可以制备出如式(Ⅰ)所示的吲哚洛尔免疫原。当然，载体仍为具有免疫原性的蛋白质，可以是血清蛋白，血蓝蛋白(KLH)和甲状腺球蛋白。优选的，载体为牛血清白蛋白。
本发明仅公开了连接基团R为-(CH2)n-COO-，且n＝3的吲哚洛尔衍生物的合成实施例并进行了相关后续实验，由于连接基团主要起小分子衍生物与载体的连接作用，免疫原性强弱与所合成的吲哚洛尔衍生物分子结构及所选载体种类有关，因此理论上n取1至20之间的任意整数时，实验结果并无显著差异，使用不同n值的吲哚洛尔衍生物制备的吲哚洛尔免疫原均具备强免疫原性，相应制备的特异性抗体均具有优异性能。
实施例三：抗β-受体阻断剂特异性抗体的制备
将上述制得的BSA-吲哚洛尔免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
用PBS将上述合成的BSA-吲哚洛尔免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射。
2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。
对上述实验动物兔取血，分离纯化得到效价为1∶30000-1∶50000的抗β-受体阻断剂特异性抗体。
实施例四：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备
(1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备：
1)准确称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg(0.05M)Tris、8mg MgCl2(3.3mM)和100mg NaCl的溶液中,该溶液pH＝9.0，本步骤在烧杯C中进行。
2)在上述烧杯C中加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，135mg葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)以及0.75mL卡必醇(Carbitol)。
3)在上述烧杯C中再逐滴加入2mL二甲基亚砜(dimethysulfoxide，DMSO)。
(2)吲哚洛尔衍生物的激活：
1)在无水状态下称取10mg上述吲哚洛尔衍生物，溶解于600μLDMF中。
2)使上述溶液温度降到-2～-8℃。
3)加入3μL三丁胺(tributylamine)。
4)加入1.5μL氯甲酸异丁酯(isobutylchloroformate)。
5)-2～-8℃搅拌30分钟。
(3)G6PDH与吲哚洛尔衍生物的连接：
1)将上述激活的吲哚洛尔衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中。
2)2-8℃搅拌过夜。
(4)纯化产物：
通过G-25凝胶层析柱纯化步骤3)中的溶液，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
实施例五：β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备
β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，包括：上述抗β-受体阻断剂特异性抗体，用于检测抗β-受体阻断剂特异性抗体-β-受体阻断剂复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。优选的，指示试剂为酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物。其中，酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，其通过上述化学合成方法得到。
β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免指示试剂中的酶标偶联物和酶的底物发生反应，酶标偶联物和酶的底物是分开放置的，不混合，所以将酶的底物与上述抗β-受体阻断剂特异性抗体混合在一起。也就是说，β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂包括两种分开设置的试剂，具体如下：
1.试剂A的制备：将4.036g(11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)置于烧杯D中，用1L 55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将上述制备的抗β-受体阻断剂特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比可以为1:100～1:10000，在本实施例中具体的比例为1:400。
2.试剂B的制备：将上述制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比可以为1:100～1:10000，在本实施例中具体的比例为1:1500。
上述β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的使用方法，包括以下步
骤：
1)将待测样本与上述抗β-受体阻断剂特异性抗体接触；
2)根据待测样本中β-受体阻断剂与上述抗β-受体阻断剂特异性抗体的结合情况，利用指示试剂判断待测样本中β-受体阻断剂的含量。
具体的，检测时，将待测样本加到试剂A中，待测样本中的β-受体阻断剂与试剂A中的抗β-受体阻断剂特异性抗体发生特异性结合，生成抗β-受体阻断剂特异性抗体-β-受体阻断剂复合物；再加入试剂B，此时试剂B中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与试剂A中的酶的底物混合、接触，发生酶促反应，构成检测抗β-受体阻断剂特异性抗体-β-受体阻断剂复合物的指示试剂，指示试剂根据待测样本中β-受体阻断剂与上述抗β-受体阻断剂特异性抗体的结合情况判断待测样本中β-受体阻断剂的含量。
由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与待测样本中的β-受体阻断剂竞争性结合抗β-受体阻断剂特异性抗体，所以，待测样本中β-受体阻断剂的量越多，均相酶溶液中游离的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的量越多，酶促反应越快，导致OD340上升。
上述待测样本为生理样本，例如尿液、血清、血浆、唾液等。
作为一种优选的方案，上述待测样本为尿液。
实施例六：β-受体阻断剂均相酶免疫检验
1、获得标准曲线：设置迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数(见表1)，操作过程为：先加试剂A，再加入标准品，最后加入试剂B。加入试剂B后，测定不同时间点的OD340吸光值，算出不同标准品浓度时的反应速率，实际操作过程中需不断调整试剂A和试剂B的体积比例，同时调整测光点，最后得出较理想的反应标准曲线图，如图1所示。
表1 迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数
通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线，重复测定低、中、高浓度质控样本10次，上述质控样本为：将吲哚洛尔标准品溶解于人尿液中，至浓度分别为1.20，5.00，10.00μg/ml。检测数据及数据分析见表2。
表2 样品测定及精密度和回收率评估
尿液样品 低 中 高
样品浓度(μg/ml) 1.20 5.00 10.00
1 1.23 5.05 10.30
2 1.19 5.10 10.41
3 1.25 4.96 10.26
4 1.17 5.10 10.39
5 1.18 4.89 9.77
6 1.24 5.12 9.62
7 1.26 5.20 10.25
8 1.18 5.14 9.88
9 1.22 4.90 10.33
10 1.19 5.16 9.71
平均值(μg/ml) 1.21 5.06 10.09
标准差(SD) 0.0328 0.1092 0.3092
精密度(CV％) 2.71 2.16 3.06
回收率％ 100.8 101.2 100.9
检测结果：本发明的均相酶免疫检测试剂测定的准确度高，回收率达到95％-105％，精密度高，CV均低于4％。
实施例七：药物干扰试验
选取62种常见药物，调整浓度至10.0μg/ml，进行干扰试验测定。常见的62种药物以及测定结果具体参见表3。
表3 常见干扰药物
测定结果：上述62种常见药物等价于β-受体阻断剂的浓度均小于0.1μg/ml。可见，本发明的抗体是抗β-受体阻断剂的特异性抗体。
实施例八：相关性分析
对100例临床标本分别使用高效液相色谱-离子阱质谱(HPLC-IT-MS)测定法和本发明的均相酶免疫试剂进行相关性分析，测定的数据参见表4。
表4 临床样本测定值
对上述数据作图，参见图2，得到的线性方程为：y＝1.0279x﹣0.0284，相关系数R2＝0.9928，表明本发明的检测试剂测定β-受体阻断剂临床标本的准确度高。
由于本发明的检测过程是由仪器全自动化完成，所以对检测人员的要求不高，易于实现和推广使用。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗β-受体阻断剂特异性抗体、用于检测抗β-受体阻断剂特异性抗体-β-受体阻断剂复合物的指示试剂；上述β-受体阻断剂包括吲哚洛尔、比索洛尔、阿替洛尔、美托洛尔和普萘洛尔中的一种或多种；上述抗β-受体阻断剂特异性抗体由吲哚洛尔免疫原免疫动物得到，吲哚洛尔免疫原的结构式如式(Ⅰ)所示：
式中，R为连接基团-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的任意整数，载体为具有免疫原性的蛋白质，载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白；上述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或化学发光试剂。
2.根据权利要求1所述的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，其特征在于，R为-(CH2)3-COO-。
3.根据权利要求1所述的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，其特征在于，上述由吲哚洛尔免疫原免疫动物得到的抗β-受体阻断剂特异性抗体能识别并结合各种β-受体阻断剂的核心结构，所述各种β-受体阻断剂的核心结构，其结构式如式(Ⅱ)所示：
4.根据权利要求1所述的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，其特征在于，上述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸；上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与吲哚洛尔衍生物偶联形成，上述吲哚洛尔衍生物的结构式如式(Ⅲ)所示：
上述R为-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数。
5.根据权利要求4所述的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，其特征在于，n＝3时，上述的吲哚洛尔衍生物的合成路线为：
6.一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)权利要求4或5所述的吲哚洛尔衍生物的合成与纯化，并进行结构鉴定；
(2)吲哚洛尔免疫原的合成：使吲哚洛尔衍生物的-(CH2)n-COO-基团与具有免疫原性的蛋白质载体连接，n为1至20之间的整数；
(3)用吲哚洛尔免疫原免疫动物，制备并纯化抗β-受体阻断剂特异性抗体；
(4)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备：制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液，激活吲哚洛尔衍生物，使G6PDH与吲哚洛尔衍生物连接，纯化连接产物；
(5)β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备：
试剂A的制备：由抗β-受体阻断剂特异性抗体和均相酶底物混合而成；
试剂B的制备：由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成。
7.根据权利要求6所述的一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，蛋白质载体为BSA，n＝3，具体合成步骤如下：
(1)将20mg BSA溶解于5ml 0.2M、pH 8.5的PBS中，上述溶液置于烧杯A中；
(2)将如下化学品加入到烧杯B中搅拌溶解：20mg吲哚洛尔衍生物、0.35ml二甲基甲酰胺DMF、0.35ml乙醇、0.7ml 10mM pH5.0的磷酸钾缓冲液、40mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，于室温下搅拌溶解，反应30分钟；
(3)将烧杯B中的溶液滴加至烧杯A中，得到混合溶液，在2～8℃下搅拌过夜；将上述搅拌后的混合溶液经过中性磷酸盐缓冲液透析纯化，得到BSA-吲哚洛尔免疫原，储存于-20℃。
8.根据权利要求6所述的一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)具体过程为：
(1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PDH溶液的制备：
a.称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg 0.05M的Tris、8mg 3.3mM的MgCl2和100mg NaCl的溶液中,该溶液pH＝9.0；
b.加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，135mg葡萄糖-6-磷酸G-6-P以及0.75mL卡必醇；
c.逐滴加入2mL二甲基亚砜；
(2)吲哚洛尔衍生物的激活：
a.在无水状态下称取10mg吲哚洛尔衍生物，溶解于600μL DMF中；
b.使上述溶液温度降到-2～-8℃；
c.加入3μL三丁胺；
d.加入1.5μL氯甲酸异丁酯；
e.-2～-8℃搅拌30分钟；
(3)G6PDH与吲哚洛尔衍生物的连接：
a.将上述激活的吲哚洛尔衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中；
b.2-8℃搅拌过夜；
(4)纯化产物：
通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
9.根据权利要求6所述的一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤(5)的具体过程如下：
试剂A的制备：将4.036g 11.25mM的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.711g 11.25mM的葡萄糖-6-磷酸用1L 55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将制备的抗β-受体阻断剂特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；
试剂B的制备：将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100～1:10000。
10.利用权利要求1至4任意一项所述的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测样本与抗β-受体阻断剂特异性抗体接触；
(2)根据待测样本中β-受体阻断剂与抗β-受体阻断剂特异性抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中β-受体阻断剂的含量；
所述待测样本为尿液、血清、血浆或唾液；
上述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸；上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与吲哚洛尔衍生物偶联形成；
上述吲哚洛尔衍生物的结构式如式(Ⅲ)所示：
上述R为-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数。
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