CN104557722B - 肌酐衍生物、肌酐免疫原及其特异性抗体与肌酐检测试剂盒 - Google Patents

肌酐衍生物、肌酐免疫原及其特异性抗体与肌酐检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肌酐衍生物、肌酐免疫原及其抗体与肌酐检测试剂盒。本发明的肌酐衍生物具有式(Ⅰ)所示的结构：其中，R为‑(CH2)n‑COO‑，n为1至20之间的整数。将特定位点上的H取代为R的具有上述结构式的肌酐衍生物与特定载体连接而得到的肌酐免疫原，具有高免疫原性，且免疫诱导动物所产生的抗体特异性高，与肌酐的特异结合能力强，通过使用均相酶免疫检测技术能够实现在全自动生化分析仪上对肌酐的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低肌酐检测成本，有利于临床推广使用。

Description

肌酐衍生物、肌酐免疫原及其特异性抗体与肌酐检测试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种肌酐衍生物、肌酐免疫原及其特异性抗体与肌酐检测试剂盒。
背景技术
肌酐(Creatinine)，其结构式如式(Ⅲ)所示：
肌酐是一种低分子量的含氮化合物，是人体内肌酸代谢的终产物。肌酐是临床常规肾功能指标之一，临床上主要用于严重肾小球病变引起的肾功能不全、肾炎、尿毒症等肾脏疾病的诊断和疗效观察等。血清肌酐升高意味着肾功能的损害，是了解肾脏功能的重要指标，同时对冠状动脉病变程度、高血压、糖尿病等有可靠的诊断价值；尿肌酐排出量可作为肌肉量的指标，肌酐的产生量比较恒定，当肾功能损伤不严重时，尿中肌酐的排泄量少受尿液浓缩和稀释的影响，故尿中肌酐浓度的测定常用作尿中其他物质排泄浓度的参照物。肌酐作为重要的肾功能指标，其含量检测为体外诊断，与供体无接触，无不良、致死报告，操作简单、快速，可广泛应用于临床，其临床应用的安全性和可靠性已得到验证。
肌酐测定的方法较多，目前国内外检测肌酐含量主要使用化学测定法(碱性苦味酸法)、高效液相色谱法、酶法等方法。碱性苦味酸法非特异的色素原干扰因素较多，需要与阳离子交换树脂法结合使用；高效液相色谱法不适用于大批量临床样本的检测，通常只能作为肌酐测定的参考方法；酶法虽然特异性较高、准确性较好，但是酶试剂价格昂贵、且不易保存。因此，这些方法都不适合临床广泛应用。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的肌酐检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂，因此，仍需要对现有的肌酐测定方法进行改进，以提供一种达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的肌酐 测定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肌酐衍生物、肌酐免疫原及其特异性抗体与肌酐检测试剂盒，以改善现有技术中肌酐测定方法稳定性差、灵敏度低，无法进行自动化分析的缺陷。
根据本发明的一个方面，提供了一种肌酐衍生物，其具有式(Ⅰ)所示的结构式：
其中，R为连接基团-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数。本发明的肌酐衍生物具备制备成具有免疫原性的肌酐免疫原的基本结构，为制备新的肌酐检测试剂提供了结构基础。
根据本发明的另一方面，还提供了一种肌酐免疫原，其具有式(Ⅱ)所示的结构式：
其中，R为连接基团-(CH2)n-COO-，n是1至20之间的整数，载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽。本发明的肌酐免疫原免疫原性高，能够刺激动物机体产生免疫应答，产生高效价的抗肌酐特异性抗体，且具有很强的反应原性，适合作为体外检测肌酐含量的竞争性试剂。
当n＝1时，上述肌酐免疫原中的R为-CH2-COO-。适用于上述肌酐免疫原的载体通常情况下选用蛋白质作为载体，不过其他足够大的具备免疫原性的物质也可以作为载体。最常用的免疫原性载体包括血清蛋白，血蓝蛋白(KLH)和甲状腺球蛋白。本发明中的载体优选为血清蛋白。血清蛋白来源广泛、简单易得且免疫原性高。
根据本发明的又一方面，还提供了一种抗肌酐特异性抗体，由免疫原免疫动物后生产得 到，抗体由上述任一种肌酐免疫原免疫动物后生产得到。本发明中所指的“抗体”不仅仅指完整的蛋白分子抗体，也包括保留完整抗体特异性结合能力的多肽片断抗体或者多肽片段抗体的衍生物。本发明的抗体可以是为多克隆抗体也可以是单克隆抗体，优选为多克隆抗体。
本发明的抗体可以通过现有技术制备得到。获得多克隆抗体的典型方法是使用单一的免疫原，在加或者不加佐剂后，在动物的一个或者多个部位进行免疫，宿主动物包括：兔，山羊，小鼠，绵羊，豚鼠或马。持续免疫一直进行，直至抗体效价达到最高。动物定时采血得到适量的特异抗血清，抗血清可以纯化。单克隆抗体可通过体细胞杂交技术来制备。
根据本发明的再一方面，还提供了一种肌酐免疫原的制备方法，该制备方法包括制备上述肌酐衍生物的步骤和将上述肌酐衍生物与载体进行连接，得到肌酐免疫原的步骤。通过上述方法制备得到的肌酐衍生物与具有免疫原性的蛋白质或多肽连接在一起，即可得到本发明的具有强免疫原性的肌酐免疫原，且该制备方法操作简单。
在本发明的上述肌酐免疫原的制备方法中，还提供了一种上述肌酐衍生物的制备方法，该制备方法包括以下：步骤S1，将肌酐与卤代-(CH2)n-COO-叔丁酯在二甲基甲酰胺环境下进行取代反应，得到2-(CH2)n-COO-叔丁酯肌酐；步骤S2，将2-(CH2)n-COO-叔丁酯肌酐溶于强酸溶液中，得到肌酐衍生物。该制备方法通过卤代-(CH2)n-COO-叔丁酯将肌酐2位上的氢进行取代，生成2-(CH2)n-COO-叔丁酯肌酐，然后在酸性环境下，将2-(CH2)n-COO-叔丁酯肌酐上的2-(CH2)n-COO-叔丁酯键打开形成肌酐2位上具有-(CH2)n-COOH的肌酐衍生物。该制备方法操作简单，且反应条件温和，稳定性高，重复性好。
在上述肌酐衍生物的制备步骤S1中，还包括以下步骤：步骤S11，将肌酐与卤代-(CH2)n-COO-叔丁酯溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，得到混合溶液；步骤S12，向混合溶液中加入丙烯酸乙酯，得到固液混合物；步骤S13，对固液混合物进行过滤，得到2-(CH2)n-COO-叔丁酯肌酐。肌酐与卤代-(CH2)n-COO-叔丁酯在DMF有机溶剂中的溶解性好。加入丙烯酸乙酯的目的是为了让2-(CH2)n-COO-叔丁酯肌酐沉淀，从而通过过滤得到。
在上述步骤S11中，得到混合溶液之后，还包括对混合溶液进行加热至恒温的步骤，优选加热至恒温的温度为80～90℃，恒温的时间大于等于24h。将混合溶液进行加热至恒温并持续24h以上，一方面使反应原料溶解更彻底，另一方面使两者反应更充分。
在本发明中，在上述步骤S12中，将反应混合物在0～4℃下进行低温搅拌固，促进反应以 得到更多的沉淀固体物质。
在本发明的上述肌酐衍生物的制备方法中，对固液混合物进行过滤，得到2-(CH2)n-COO-叔丁酯肌酐的具体操作无特殊要求，只要能够从固液混合物中分离得到所需的目标产物即可。在本发明中，上述步骤S13包括对固液混合物进行过滤，得到固体物质；用丙酮对固体物质进行洗涤纯化，得到纯化物；对纯化物进行真空干燥，得到2-(CH2)n-COO-叔丁酯肌酐。通过过滤、丙酮洗涤纯化以及真空干燥的步骤后，使得到的2-(CH2)n-COO-叔丁酯肌酐纯度和收率都相对较高。
在本发明的上述肌酐衍生物的制备方法中，将2-(CH2)n-COO-叔丁酯肌酐溶于强酸溶液中，得到肌酐衍生物的步骤的具体操作过程，可根据2-(CH2)n-COO-叔丁酯肌酐和酸溶液的不同，进行适当调整。在本发明中，优选上述步骤S2包括：将2-(CH2)n-COO-叔丁酯肌酐溶于强酸溶液中，得到反应液；将反应液在45～55℃下搅拌1.5～2.5h，得到搅拌液；将搅拌液干燥，得到干燥物；用丙酮对干燥物进行洗涤纯化，得到肌酐衍生物。通过在50℃左右的高温下搅拌能够促进目标肌酐衍生物的生成，通过蒸发干燥的方法得到含有目标肌酐衍生物的干燥物，通过丙酮洗涤后，将干燥物上的有机残留物去除，得到纯度更高的目标肌酐衍生物。
在本发明的上述肌酐衍生物的制备方法中，当n＝1时，上述肌酐衍生物的制备步骤如下：
n＝1时，与上述反应步骤相同，只是采用溴乙酸叔丁酯为合成原料，故所得的最终产物肌酐衍生物的链接基团R为-CH2-COO-。
在本发明的上述肌酐免疫原的制备方法中，载体与肌酐衍生物的连接步骤，在实际操作中，可根据载体的不同而进行合理改进。在本发明中，上述连接的步骤包括：步骤S21，制备载体溶液和肌酐衍生物溶液；其中，所述载体与所述肌酐衍生物的质量比为1～1.2:1；优选所述载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白；步骤S22，将肌酐衍生物溶液滴加至载体溶液 中，得到肌酐免疫原粗品；步骤S23，对滴加混合液在2～8℃下搅拌过夜，得到肌酐免疫原粗品；步骤S24，对肌酐免疫原粗品进行纯化，得到肌酐免疫原。本发明的制备步骤通过简单的滴加、纯化步骤即可得到目标产物，制备方法简单、工艺稳定性高、可重复性好。
在本发明的上述肌酐免疫原的制备方法中，制备载体溶液和制备肌酐衍生物溶液的步骤的实际操作中，根据载体种类的不同选择进行合理选择适合的溶剂浓度和pH值。在本发明的上述步骤S21中，制备载体溶液的步骤是将载体溶解于0.18～0.25M，pH在8.3～8.8的磷酸缓冲液中，得到载体溶液；制备肌酐衍生物溶液是将肌酐衍生物与1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺置于二甲基甲酰胺、乙醇以及8～12mM，pH 4.8～5.2的磷酸钾缓冲液中进行室温搅拌，得到肌酐衍生物溶液。采用浓度为0.18～0.25M，pH在8.3～8.8的磷酸缓冲液中来溶解载体，能够使载体溶解的更加充分，且能保持载体的结构和性质稳定而具有免疫原性。采用浓度在8～12mM，pH在4.8～5.3范围内的磷酸钾缓冲液能够保持肌酐衍生物溶液的生物稳定性，又能够促进其溶解。
在本发明的上述肌酐免疫原的制备方法中，对上述滴加，得到肌酐免疫原粗品的步骤中，为了进一步提高肌酐免疫原粗品中的肌酐免疫原含量。在本发明上述步骤S22和S23中，通过滴加的步骤，能够使肌酐衍生物更充分地与载体反应；在2～8℃下搅拌过夜更能促进肌酐免疫原的生成，从而提高粗品中肌酐免疫原的含量。
在本发明的上述肌酐免疫原的制备方法中，任何能够从肌酐免疫原粗品中纯化得到肌酐免疫原的操作均适用于本发明。优选在上述步骤S24中，采用透析的方式对肌酐免疫原粗品进行纯化，得到肌酐免疫原。透析的方式简单且纯化效果好。
根据本发明的又一方面，还提供了一种肌酐检测试剂，包括抗肌酐特异性抗体、肌酐酶标偶联物和酶的底物，其中，抗肌酐特异性抗体为上述任一种抗肌酐特异性抗体；肌酐酶标偶联物含有上述肌酐衍生物。肌酐酶标偶联物由酶和半抗原偶联形成，其中的半抗原为上述肌酐衍生物。
本发明的上述肌酐检测试剂，由于抗肌酐特异性抗体的特异性强，与肌酐的结合力强，检测灵敏度远高于现有技术中的相应产品。优选的，上述酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。采用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物及葡萄糖-6-磷酸作为酶的底物的检测试剂可以方便、准确地确定样品中的肌酐含量，适用于高通量的自动化检测。
根据本发明的又一方面，还提供了一种肌酐检测试剂盒，含有上述抗肌酐特异性抗体和/或检测抗肌酐特异性抗体和肌酐复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂。优选的，指示试剂由肌酐酶标偶联物和酶的底物所组成，其中，肌酐酶标偶联物上可以偶联本发明的肌酐衍生物，能够方便、准确地确定样品中的肌酐含量，适用于高通量的自动化检测。
应用本发明的技术方案，通过特定的R基团取代特定的位点的氢所得到的肌酐衍生物，与特定载体连接而成的肌酐免疫原，具有高免疫原性，免疫诱导动物所产生的抗体特异性高，与肌酐的特异结合能力强。可以通过使用均相酶免疫检测技术实现在全自动生化分析仪上对肌酐的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低肌酐检测成本，有利于临床推广使用。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明的实施例中所提供的抗肌酐抗体检测的肌酐ELISA反应曲线；以及
图2示出了根据本发明的实施例中所提供的抗肌酐抗体检测的肌酐均相酶免疫反应曲线。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例一：肌酐衍生物的合成及其结构确认
以下实施例中使用的肌酐衍生物化学结构如式(Ⅳ)所示：
式(Ⅳ)所示的肌酐衍生物的合成路线如下：
式(Ⅳ)所示的肌酐衍生物的具体的合成步骤如下：
(1)化合物2的合成
1)称取10.0g(88.4mmol)化合物1和17.3g(88.4mmol)溴乙酸叔丁酯，共同溶解于100mL二甲基甲酰胺(DMF)中，然后将溶液加热至85℃，过夜。在此溶液中加入350mL丙烯酸乙酯(EA)，将反应混合物在0℃下搅拌15min。将溶液中的固体沉淀物过滤出来，用丙酮洗涤后进行真空干燥，最终获得5.00g白色固体状的化合物2，产率25％。
2)利用Varian III plus 300MHz对上述化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.44(s,9H),3.15(s,3H),4.44-4.46(m,4H),9.48(s,2H)。表征为如上式所示的化合物2。
(2)肌酐衍生物的合成
1)称取2.00g(8.8mmol)化合物2，溶解于20mL HCl(1M)中，将此溶液在50℃下搅拌2小时。将反应混合物蒸发干燥，将干燥后的残余物用丙酮洗涤，最终获得1.40g，白色固体状的肌酐衍生物，产率93％。
2)对上述所得纯化产物进行结构鉴定：
a.利用Varian III plus 300MHz对上述化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.16-3.19(d,3H),4.46-4.50(m,4H),9.69(s,2H)。表征为式(Ⅳ)所示的肌酐衍生物。
b.利用色谱/质谱技术(LCMS)对得到的衍生物进行分析鉴定，可以确定该最终所得化合物为式(Ⅳ)所示的肌酐衍生物。
实施例二：取n＝2时，肌酐衍生物的制备步骤：
(1)2-(CH2)2-COO-叔丁酯肌酐的合成
1)称取12.0g(106.8mmol)化合物1和18.5g(88.4mmol)溴丙酸叔丁酯，共同溶解于100mL二甲基甲酰胺(DMF)中，然后将溶液加热至80℃，过夜。在此溶液中加入350mL丙烯酸乙酯(EA)，将反应混合物在2℃下搅拌20min。将溶液中的固体沉淀物过滤出来，用丙酮洗涤后进行真空干燥，最终获得5.10g白色固体状的中间产物，产率25.5％。
2)利用Varian III plus 300MHz对上述化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果表征为2-(CH2)2-COO-叔丁酯肌酐。
(2)肌酐衍生物的合成
1)称取2.00g(8.8mmol)上述2-(CH2)2-COO-叔丁酯肌酐，溶解于20mL HCl(1M)中，将此溶液在55℃下搅拌1.5小时。将反应混合物蒸发干燥，将干燥后的残余物用丙酮洗涤，最终获得1.42g，白色固体状的肌酐衍生物，产率94.3％。
2)对上述所得纯化产物进行结构鉴定：
a.利用Varian III plus 300MHz对上述化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果表征为2-(CH2)2-COO-肌酐。
b.利用色谱/质谱技术(LCMS)对得到的衍生物进行分析鉴定，可以确定该最终所得化合物为2-(CH2)2-COO-肌酐。
实施例三：取n＝3时，肌酐衍生物的制备步骤：
(1)2-(CH2)3-COO-叔丁酯肌酐的合成
1)称取12.0g(88.4mmol)化合物1和19.7g(88.4mmol)溴丁酸叔丁酯，共同溶解于120mL二甲基甲酰胺(DMF)中，然后将溶液加热至90℃，过夜。在此溶液中加入350mL丙烯酸乙酯(EA)，将反应混合物在4℃下搅拌25min。将溶液中的固体沉淀物过滤出来，用丙酮洗涤后进行真空干燥，最终获得5.05g白色固体状的化合物2，产率24％。
2)利用Varian III plus 300MHz对上述化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果表征为2-(CH2)3-COO-叔丁酯肌酐所示的化合物。
(2)肌酐衍生物的合成
1)称取2.00g(8.8mmol)化合物2，溶解于20mL HCl(1M)中，将此溶液在45℃下搅拌2.5小时。将反应混合物蒸发干燥，将干燥后的残余物用丙酮洗涤，最终获得1.45g，白色固体状的肌酐衍生物，产率95.1％。
2)对上述所得纯化产物进行结构鉴定：
a.利用Varian III plus 300MHz对上述化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果表征为2-(CH2)3-COO-肌酐。
b.利用色谱/质谱技术(LCMS)对得到的衍生物进行分析鉴定，可以确定该最终所得化 合物为2-(CH2)3-COO-肌酐。
上述实施例中，取n＝1、2和3时，肌酐衍生物的制备在合成中间化合物时分别选用了溴乙酸叔丁酯、溴丙酸叔丁酯和溴丁酸叔丁酯为合成原料，故所得的最终产物肌酐衍生物的链接基团R分别为-CH2-COO-、-(CH2)2-COO-和-(CH2)3-COO-。当n为1至20中的其他整数时，选用其它与溴乙酸叔丁酯类似的溴代有机酸叔丁酯进行实验时，除n取值不同外，合成方法完全一致。
实施例四：BSA-肌酐衍生物免疫原的合成
BSA-肌酐免疫原由牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)与式(Ⅰ)所示的肌酐衍生物的-(CH2)n-COO-基团连接而成，在本实施例中，以n＝1为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：
将牛血清白蛋白(200mg)溶解于50ml 0.2M，pH 8.5的磷酸缓冲液中；
将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的肌酐衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)、3.5ml乙醇、7.0ml 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲液、200mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS)，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min；
将溶解好的溶液滴加至BSA溶液中，并在2℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到2-乙酸肌酐免疫原。
实施例五：KLH-肌酐衍生物免疫原的合成
KLH-肌酐免疫原由血蓝蛋白(KLH)与式(Ⅰ)所示的肌酐衍生物的-(CH2)n-COO-基团连接而成，在本实施例中，以n＝2为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：
将血蓝蛋白(200mg)溶解于50ml 0.18M，pH 8.3的磷酸缓冲液中；
将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的肌酐衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)、3.5ml乙醇、7.0ml 8mM，pH 4.8的磷酸钾缓冲液、200mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS)，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min；
将溶解好的溶液滴加至KLH溶液中，并在8℃下搅拌过夜，得到肌酐免疫原粗品；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到2-丙酸肌酐免疫原。
实施例六：甲状腺球蛋白-肌酐衍生物免疫原的合成
甲状腺球蛋白-肌酐免疫原由甲状腺球蛋白与式(Ⅰ)所示的肌酐衍生物的-(CH2)n-COO-基团连接而成，在本实施例中，以n＝3为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：
将甲状腺球蛋白(240mg)溶解于50ml 0.25M，pH 8.8的磷酸缓冲液中；
将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的肌酐衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)、3.5ml乙醇、7.0ml 12mM，pH 5.2的磷酸钾缓冲液、200mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS)，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应35min；
将溶解好的溶液滴加至甲状腺球蛋白溶液中，并在5℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到2-丁酸肌酐免疫原。
类似的，n取1～20范围内的其他整数时，用同样的方法可以制备出如式(Ⅱ)所示的肌酐免疫原，且实验结果并无显著差异，使用不同n值的肌酐衍生物所制备的肌酐免疫原均具备强免疫原性，相应制备的特异性抗体均具有优异性能。当然，载体仍为具有免疫原性的蛋白质，可以是血清蛋白，血蓝蛋白(KLH)和甲状腺球蛋白。优选的，载体为牛血清白蛋白。
实施例七：抗肌酐特异性抗体的制备
将上述实施例四制得的BSA-肌酐免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
用PBS将上述合成的BSA-肌酐免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射；
2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。
对上述实验动物兔取血，分离纯化得到抗血清。利用常规的抗体效价测定方法，以无抗体的空白血清作为对照，将抗血清稀释一定倍数后进行ELISA检测，最终检测得到本发明的抗 肌酐特异性抗体的效价为1:30000-1:50000，表明本发明所制备的抗体的特异性强、灵敏度高。
实施例八：肌酐ELISA检验
采用实施例七制得的抗体进行肌酐的ELISA检验。该检验是利用竞争性免疫分析法来测定液体样本中的肌酐含量。其原理是：样本中的肌酐与偶联的肌酐衍生物(HRP-肌酐衍生物酶偶联物)竞争结合包被在酶联板中抗体上的有限位点。如果液体样本中几乎没有或没有肌酐，HRP酶偶联的肌酐衍生物就会与酶标板中的抗体结合。相反的，如果液体样本中含有大量或一定数量的肌酐，那么酶-肌酐衍生物偶联物就会减少与抗体的结合，从而使显色信号减弱。因此，检验产生的吸光度与液体样本中的肌酐含量成反比。具体步骤如下：
1.肌酐ELISA检测标准曲线的建立
(1)标准品的制备
将肌酐粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液，制备成1mg/ml的储存液。用ELISA缓冲液将储存液依次稀释为8.00μmol/L、4.00μmol/L、2.00μmol/L、1.00μmol/L、0.50μmol/L和0μmol/L的标准溶液。其中，ELISA缓冲液含有50.0mM Tris，145mM NaCl和0.25％的BSA。
(2)利用肌酐的ELISA检验方法制备标准曲线
用PBS将实施例七中所制备的抗肌酐抗体稀释成1:8000的终浓度溶液，100μL/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置12-24h；用PBS将上述包被有抗肌酐抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入200μL/孔的0.5％的BSA溶液，4℃封闭放置8-16h。然后用PBS洗涤3次，加入20μL/孔的标准品。再加入100μL/孔工作浓度的HRP-肌酐偶联物；室温下孵育30min后PBS洗板5次；然后每孔加入100μL TMB底物，室温孵育30min。再每孔加入100μL终止液(2M硫酸)。测定450nm的吸光值。根据各标准品所对应的450nm的吸光值定标，制作标准曲线，结果如附图1所示。
2.待测样品中肌酐含量的检测
(1)制作待测样品
制备方法：将肌酐粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液制成1mmol/L的储存液，并将此储存液稀释于空白全血中，至终浓度分别为0.00，0.50，2.00，5.00μmol/L，形成空白、低、 中、高浓度的全血样本。该空白全血为不含肌酐的健康人血液。
(2)测试方法
利用上述肌酐的ELISA检验方法，将上述空白、低、中、高浓度的全血样本代替标准品，测试上述空白、低、中、高浓度的全血样本在450nm的吸光值。
(3)测试结果
对照图1中所示的肌酐ELISA检验的标准曲线，计算每个样本中肌酐含量，并对每个样本进行3个复孔测定，根据上述样本中肌酐的实际含量计算回收率，结果如表1所示。
表1:肌酐的ELISA检测回收实验
由表1中结果可知：采用本发明的肌酐ELISA检测试剂测定不同浓度样品中的肌酐回收率都较高，均＞90％，说明本发明所述的抗肌酐特异性抗体可以用于样本中肌酐的检测，并且结果准确度高。而且，从本发明的特异抗体的稀释倍数和检测样本的最低浓度可以看出，本发明的抗体特异性强，灵敏度高。
实施例九：肌酐均相酶免疫检验
采用实施例七制得的抗体进行肌酐的均相酶免疫检验(Homogeneous EnzymeImmunoassay)。
该检验是一种竞争性反应，反应体系中与抗体结合的肌酐和游离的肌酐不需要通过固相来分离。该检验的基本原理是，液体样本中游离的肌酐与偶联在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase，G6PDH)上的肌酐衍生物对特异性抗体的结合位点进行竞争。液体样本中的肌酐竞争性的取代与抗体结合的肌酐酶偶联物，并使其从抗体的结合位点上释放出来，从而使酶恢复活性。因此，液体样本中肌酐的含量越多，游离的肌酐衍生物-G6PDH酶偶联物就越多，从而能得到更强的信号。具体步骤如下：
1.获得标准曲线：设置迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数(见表2)，操作过程为：先加试剂A，再加入标准品，最后加入试剂B。加入试剂B后，测定不同时间点的OD340吸光值，算出不同标准品浓度时的反应速率，实际操作过程中需不断调整试剂A和试剂B的体积比例，同时调整测光点，最后得出较理想的反应标准曲线图，如图2所示。
表2：迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数
2.通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线，重复测定低、中、高浓度质控样本10次，上述质控样本为：将肌酐标准品溶解于人血清中，至浓度分别为1.20，35.00，150.00μmol/L。检测数据及数据分析见表3。
表3：样品测定及精密度和回收率评估
3.检测结果：本发明的均相酶免疫检测试剂测定的准确度高，回收率达到95％-105％，精密度高，CV均低于4％，表明本发明的抗肌酐特异性抗体具有特异性强和灵敏度高的优点。
实施例十：药物干扰试验
选取62种常见化合物和药物进行干扰检测，调整浓度至10.0μg/ml，利用均相酶免疫方法进行测定，根据标准曲线得到相应物质的浓度。常见的62种化合物与药物名称以及测定结果具体参见表4。
表4：常见干扰药物测定结果
测定结果：上述62种常见化合物和药物等价于肌酐的浓度均小于0.1μg/ml。可见，本发明的抗体是抗肌酐的特异性抗体。
从以上的描述中，可以看出，本发明所提供的肌酐衍生物所制备得到的肌酐免疫原，具有高免疫原性，所免疫诱导的动物所产生的抗体特异性高，与肌酐的特异结合能力强，在体外检测中，稳定性好且灵敏度高，使用均相酶免疫检测技术可以实现在全自动生化分析仪上对肌酐的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低肌酐检测成本，有利于临床推广使用。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种肌酐免疫原，其特征在于，具有式(Ⅱ)所示的结构式：
其中，R为连接基团-CH2COO-，载体为具有免疫原性的牛血清白蛋白。
2.一种抗肌酐特异性抗体，由免疫原免疫动物后生产得到，其特征在于，所述抗肌酐特异性抗体由权利要求1所述的肌酐免疫原免疫动物后得到。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体为完整的蛋白分子或具有与肌酐特异性结合的能力的多肽片段。
4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
5.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述抗体由所述肌酐免疫原免疫兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马后得到。
6.制备根据权利要求1所述的一种肌酐免疫原的方法，其特征在于，所述制备方法包括：
制备肌酐衍生物；以及将所述肌酐衍生物与载体连接，得到所述肌酐免疫原；
其中制备所述的肌酐衍生物的步骤包括：
步骤S1，将肌酐与溴乙酸叔丁酯在二甲基甲酰胺环境下进行取代反应，得到2-CH2COO-叔丁酯肌酐；以及
步骤S2，将所述2-CH2COO-叔丁酯肌酐溶于强酸溶液中得到反应液，对所述反应液在45～55℃下搅拌1.5～2.5h，得到所述肌酐衍生物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下步骤：
步骤S11，将肌酐与溴乙酸叔丁酯溶于二甲基甲酰胺中，得到混合溶液；其中，所述肌酐与溴乙酸叔丁酯的摩尔比为1～1.2:1；在得到所述混合溶液之后，还包括对所述混合溶液进行加热至恒温的步骤，所述加热至恒温的温度为80～90℃，所述恒温的时间大于等于24h；
步骤S12，向所述混合溶液中加入丙烯酸乙酯，得到反应混合物，并对所述反应混合物在0～4℃的低温下进行搅拌，得到固液混合物；以及
步骤S13，对所述固液混合物依次进行过滤、洗涤纯化和真空干燥处理，得到所述2-CH2COO-叔丁酯肌酐。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述载体与所述肌酐衍生物的连接步骤包括：
步骤S21，制备载体溶液和肌酐衍生物溶液；
步骤S22，将所述肌酐衍生物溶液滴加至所述载体溶液中，得到滴加混合液；
步骤S23，对所述滴加混合液在2～8℃下搅拌过夜，得到所述肌酐免疫原粗品；以及
步骤S24，对所述肌酐免疫原粗品进行纯化，得到所述肌酐免疫原。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S21中，
所述制备载体溶液的步骤包括将载体溶解于0.18～0.25M，pH在8.3～8.8的磷酸缓冲液中，得到所述载体溶液；以及
所述制备肌酐衍生物溶液的步骤包括将所述肌酐衍生物与1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺置于二甲基甲酰胺、乙醇以及8～12mM，pH 4.8～5.2的磷酸钾缓冲液中进行室温搅拌，得到所述肌酐衍生物溶液；
其中，所述载体与所述肌酐衍生物的质量比为1～1.2:1。
10.一种肌酐检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求2至5中任一项所述的抗体。
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