CN103739703B - 甘胆酸免疫原、抗甘胆酸特异性抗体及检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及甘胆酸免疫检测领域，具体涉及一种甘胆酸免疫原、抗甘胆酸特异性抗体及检测试剂。甘胆酸免疫原免疫原性强，抗甘胆酸特异性抗体特异性高，用本发明的高效价的抗甘胆酸特异性抗体研制的免疫试剂可以精确地测定血清或血浆样本中甘胆酸的含量。与放射免疫等传统方法相比，本发明提供的免疫检测试剂灵敏度高、特异性强，结合自动化分析仪使用，具有操作简便、高通量、检测结果准确等优点。
Description
技术领域
本发明涉及甘胆酸免疫检测领域，具体涉及一种甘胆酸免疫原、抗甘胆酸特异性抗体及检测试剂。
背景技术
甘胆酸（Cholylglycine，CG），其结构式如式（III）所示。
甘胆酸是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一，由肝细胞合成，同胆汁进入肠道，经门静脉再回肝脏，当肝细胞受损时，肝细胞摄取甘胆酸能力下降，致使血中含量增加，因此，甘胆酸是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。研究显示，肝硬化、肝癌、急性肝炎和慢性活动性肝炎等肝病患者的甘胆酸含量明显高于正常人，甘胆酸也是检测胆汁郁积和早期酒精肝损伤的重要指标，同时甘胆酸的检测对孕妇妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）的诊断具有重要的临床意义。
直接用甘胆酸免疫动物无法获得抗甘胆酸特异性抗体。目前市场上缺乏灵敏度高、特异性强的甘胆酸检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。
目前，体外定量测定甘胆酸主要使用放射免疫分析法（RIA），化学发光免疫分析法（CLIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）等。放射免疫法需要有专业放免设施，普通实验室难以开展，且放免法准确度低，放射性射线还会对操作人员的健康产生极大的危害，国际上已很少使用。化学发光法灵敏度较高，但是测定速度较慢，测试结果的准确度和试剂稳定性较差，而且需要昂贵的专用化学发光检测设备，不利于常规实验室开展，临床应用局限性明显。酶联免疫法一般用于半定量测定，且操作繁琐，检测时间长，自动化程度低，重复性较差，不利于广泛应用于临床检验。
均相酶免疫检测法，以其检测速度快、操作简单、灵敏度高、特异性强且可以在全自动生化分析仪上实现对小分子物质的高通量快速化检测的优点，开始得到越来越多的关注。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种甘胆酸衍生物。
本发明的一个目的在于提供一种甘胆酸免疫原。
本发明的另一个目的在于提供使用本发明甘胆酸免疫原制备得到的抗甘胆酸特异性抗体。
本发明的又一个目的在于提供一种甘胆酸检测试剂。
本发明的最后一个目的在于提供一种甘胆酸免疫原的制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
甘胆酸免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示：
式中，R为连接基团，载体具有免疫原性。
优选的，载体为具有免疫原性的蛋白质。更优选的，所述的载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白。
R优选为-(CH2)n-O-CH2-COO-，n是1至20之间的整数，特别的，R为-(CH2)2-O-CH2-COO-。
一种抗甘胆酸特异性抗体，由上述的甘胆酸免疫原免疫宿主动物后分离纯化得到。
优选的，所述的抗体为完整的抗体分子，或者为，保留与甘胆酸特异性结合的能力的抗体片段或抗体衍生物。
优选的，所述的抗体为采用单一的甘胆酸免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体。
宿主动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马。
一种甘胆酸衍生物，其结构式如式（II）所示：
式中R为-(CH2)n-O-CH2-COO-，n为1至20之间的整数。
一种甘胆酸检测试剂，含有前述的抗甘胆酸特异性抗体、甘胆酸衍生物的酶标偶联物和酶的底物。
甘胆酸免疫原的制备方法，由载体和所述的甘胆酸衍生物连接而成，取n=2时，其特征在于，其中甘胆酸衍生物的制备步骤如下：
n=2时，甘胆酸衍生物的制备在合成化合物5时选用了乙二醇为合成原料，故所得的最终产物甘胆酸衍生物的链接基团R为-(CH2)2-O-CH2-COO-，选用其它乙二醇类似物进行实验时，除n取值不同外，合成方法完全一致。
本发明的甘胆酸免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗甘胆酸特异性抗体。免疫原性高与所合成的甘胆酸衍生物分子结构及所选载体种类有关，现有技术中甘胆酸免疫原的免疫原性较弱，所产抗体的特异性、与甘胆酸的结合力，敏感度都不如本发明。
同理，本发明的抗甘胆酸特异性抗体，特异性高，与甘胆酸的结合力强，敏感度远高于现有的抗甘胆酸抗体。
本发明的甘胆酸检测试剂，可以方便、准确地确定样品中的甘胆酸含量。
本发明的甘胆酸检测试剂可以在全自动生化分析仪上实现检验的快速化、批量化和自动化。
附图说明
图1是甘胆酸ELISA检测反应曲线；
图2是甘胆酸均相酶免疫反应曲线。
具体实施方式
本发明所采取的技术方案是：
甘胆酸免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示：
式中，R为连接基团，载体具有免疫原性。优选的，载体为具有免疫原性的蛋白质。免疫原性载体一般是蛋白质或多肽；虽然其他足够大的具备免疫原性的物质也可以作为载体，但通常情况下选用蛋白质作为载体。最常用的免疫原性载体包括血清蛋白，血蓝蛋白（KLH）和甲状腺球蛋白。本发明中的载体优选为血清蛋白。
R优选为-(CH2)n-O-CH2-COO-，n是1至20之间的整数，特别的，R为-(CH2)2-O-CH2-COO-。
一种抗甘胆酸特异性抗体，由上述甘胆酸免疫原免疫动物后生产得到。
本发明中所指的“抗体”不仅仅指完整的抗体分子，也包括保留完整抗体特异性结合能力的抗体片断或者衍生物。本发明的抗体可以是为多克隆抗体也可以是单克隆抗体，优选为多克隆抗体。
本发明的抗体可以通过现有技术制备得到。获得多克隆抗体的典型方法是使用单一的免疫原，在加或者不加佐剂后，在动物的一个或者多个部位进行免疫，宿主动物包括：兔，山羊，小鼠，绵羊，豚鼠或马。持续免疫一直进行，直至抗体效价达到最高。动物定时采血得到适量的特异抗血清，抗血清可以纯化。单克隆抗体可通过体细胞杂交技术来制作。
一种甘胆酸检测试剂，含有上述抗甘胆酸特异性抗体、甘胆酸酶标偶联物和酶标底物。
甘胆酸检测试剂盒，含有上述抗甘胆酸特异性抗体以及检测抗甘胆酸特异性抗体和甘胆酸复合物的指示试剂。
指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂。优选的，指示试剂由甘胆酸酶标偶联物和酶的底物所组成。
优选的，上述酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
下面结合实施例，进一步说明本发明。
实施例一：甘胆酸衍生物的合成及其结构确认
以下实施例中使用的甘胆酸衍生物化学结构如式（IV）所示：
该甘胆酸衍生物的合成路线如下：
具体的合成步骤如下：
化合物3的合成
1）称取10.0g（24.5mmol）化合物1胆酸，将化合物1溶解于100mL无水二甲基甲酰胺（DMF）中，室温下加入7.04g（36.7mmol）碳二亚胺盐酸盐（EDCI）、4.96g（36.7mmol）羟基苯并三氮唑（HOBT）和10.7mL（61.2mmol）二异丙基乙胺（DIEA），再加入3.07g（24.5mmol）化合物2甘氨酸，搅拌4小时，得到合成溶液；
2）将上述合成溶液用水稀释后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用水和卤水冲洗有机层，加入Na2SO4干燥，通过减压方法使溶剂蒸发，最后得到9.38g白色固体化合物3，即甘氨胆酸，产率80%。
化合物4的合成
1）称取8.27g（17.2mmol）化合物3溶解于90mL的吡啶中，0℃下加入2.37g（20.7mmol）甲基磺酰氯（MsCl），将此溶液在室温下搅拌1小时，得到合成溶液。
2）将上述合成溶液用水稀释后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用水和卤水冲洗有机层，加入Na2SO4干燥，通过减压方法使溶剂蒸发，最后得到6.67g白色固体化合物4，产率81%。
化合物5的合成
1）称取10.0g（18.0mmol）化合物4溶解于100mL的吡啶中，室温下加入20mL的乙二醇，将此反应混合液加热至110℃过夜。
2）将上述反应混合液除去溶剂，残留物用水稀释后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用卤水冲洗有机层，加入Na2SO4干燥，过滤，浓缩并通过FCC（DCM/MeOH=30/1）方法纯化得到1.33g粗提白色固体化合物5，产率11%。
化合物7的合成
1）称取100mg（0.191mmol）化合物5和64mg（0.21mmol）碳酸铯（Cs2CO3），共同悬浮于5mL的无水二甲基甲酰胺（DMF）中，冰浴条件下加入41mg（0.21mmol）化合物6（溴乙酸叔丁酯），室温下搅拌反应过夜。
2）将上述反应液用水稀释后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用水和卤水冲洗有机层，加入Na2SO4干燥，过滤，浓缩并通过FCC（DCM/MeOH=35/1）方法纯化得到15mg黄色固体化合物7，产率12%。
甘胆酸衍生物的合成
1）称取80mg（0.13mmol）化合物7溶解于5mL的二氯甲烷（DCM）中，冰浴条件下加入1mL三氟乙酸（CF3COOH），室温下搅拌反应2小时。
2）将上述反应液除去溶剂后用1N的氢氧化钠（NaOH）调节pH值至9.0，再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取。将水相用1N的盐酸（HCl）调节pH值至6.0，再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取。
3）使用卤水冲洗有机层，加入Na2SO4干燥，浓缩得到65mg无色固体产物，即式（IV）所示的甘胆酸衍生物，产率89%，纯度>95%。
本实施例中甘胆酸衍生物的制备在合成化合物5时选用了乙二醇为合成原料，故所得的最终产物甘胆酸衍生物的链接基团R为-(CH2)2-O-CH2-COO-，选用其它乙二醇类似物进行实验时，除n取值不同外，合成方法完全一致。
对上述无色固体纯化产物进行结构鉴定
1、利用Bruker Avance III plus400MHz和VARIAN MERCURYplus300M对上述无色固体化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H NMR(400MHz,CD3OD):δ4.61(s,2H),4.27(t,J=5.2Hz,2H),3.95(s,1H),3.90(s,2H),3.79(s,1H),3.71(s,3H),3.60-3.61(m,3H),2.14-2.43(m,4H),1.73-1.92(m,6H),1.55-1.65(m,7H),1.28-1.45(m,7H),1.03(d,J=6.4Hz,3H),0.92(s,3H),0.71(s,3H)。表征为式（IV）所示的甘胆酸衍生物。
2、利用色谱/质谱技术（LCMS）对得到的衍生物进行分析鉴定，采用安捷伦公司的串联四级杆质谱仪LC/MSD1200系列，离子源采用正离子或负离子化模式。色谱柱规格为：Symmetry C18(50×4.6mm,5μm)，柱温为30℃，流速为1.5mL/min，检测波长为214nm，流动相为5-60%乙腈-0.02%NH4OAc。LCMS结果显示：纯度>95%；保留时间3.637min。
综合上述结果，可以确定该无色固体化合物为式（IV）所示的甘胆酸衍生物。
实施例二：BSA-甘胆酸衍生物免疫原的合成
BSA-甘胆酸免疫原由牛血清白蛋白BSA与式（II）所示的甘胆酸衍生物的-(CH2)n-O-CH2-COO-基团连接而成，在本实施例中，以n=2为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：
1)将牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）（200mg）溶解于50ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；
2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的甘胆酸衍生物、3.5ml二甲基酰胺（dimethylformamide，DMF）、3.5ml乙醇、7.0ml10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、200mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS），将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min；
3)将溶解好的溶液滴加至BSA溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到甘胆酸免疫原。
类似的，n取1～20范围内的其他整数时，用同样的方法可以制备出如式（I）所示的甘胆酸免疫原。当然，载体仍为具有免疫原性的蛋白质，可以是血清蛋白，血蓝蛋白（KLH）和甲状腺球蛋白。优选的，载体为牛血清白蛋白。
本发明中仅合成了连接基团R为-(CH2)n-O-CH2-COO-，且n=2的甘胆酸衍生物并进行了后续实验，由于连接基团主要起小分子衍生物与载体的连接作用，免疫原性强弱与所合成的甘胆酸衍生物分子结构及所选载体种类有关，理论上n取1至20之间的任意整数时，实验结果并无显著差异。
实施例三：抗甘胆酸特异性抗体的制备
将上述制得的BSA-甘胆酸免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
用PBS将上述合成的BSA-甘胆酸免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射。
2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。
对上述实验动物兔取血，分离纯化得到抗甘胆酸特异性抗体，经测定，该抗甘胆酸特异性抗体的效价为1:30000。
实施例四：甘胆酸ELISA检验
采用制得的抗体进行甘胆酸的ELISA检验。
该检验是利用竞争性免疫分析法来测定液体样本中的甘胆酸含量。
样本中的甘胆酸与偶联的甘胆酸衍生物（HRP-甘胆酸衍生物酶偶联物）竞争结合包被在酶联板中抗体上的有限位点。如果液体样本中几乎没有或没有甘胆酸，HRP酶偶联的甘胆酸衍生物就会与酶标板中的抗体结合。相反的，如果液体样本中含有大量或一定数量的甘胆酸，那么酶-甘胆酸衍生物偶联体就会减少与抗体的结合，从而使显色信号减弱。因此，检验产生的吸光度与液体样本中的甘胆酸含量成反比。其剂量效应曲线如图1所示，其中横坐标为甘胆酸浓度(μg/ml)，纵坐标为OD值。
实施例五：甘胆酸均相酶免疫检验
采用制得的抗体进行甘胆酸的均相酶免疫检验（HomogeneousEnzyme Immunoassay）。
该检验是一种竞争性反应，反应体系中与抗体结合的甘胆酸和游离的甘胆酸不需要通过固相来分离。该检验的基本原理是，液体样本中游离的甘胆酸与偶联在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-PhosphateDehydrogenase，G6PDH）上的甘胆酸衍生物对特异性抗体的结合位点进行竞争。液体样本中的甘胆酸竞争性的取代与抗体结合的甘胆酸酶偶联物，并使其从抗体的结合位点上释放出来，从而使酶恢复活性。因此，液体样本中甘胆酸的含量越多，游离的甘胆酸衍生物-G6PDH酶偶联物就越多，从而能得到更强的信号。
其均相酶免疫检验得到的剂量效应曲线如图2所示，其中横坐标为甘胆酸浓度(μg/ml)，纵坐标为OD值。
实施例六：药物干扰试验
选取45种常见药物，调整浓度至10.0μg/ml，进行干扰试验测定。常见的45种药物以及测定结果具体参见表1。
表1常见干扰药物
测定结果：上述45种常见药物等价于甘胆酸的浓度均小于0.1μg/ml。可见，本发明的抗体是抗甘胆酸的特异性抗体。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.甘胆酸免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示：
式中，R为连接基团-(CH2)n-O-CH2-COO-，n是1至20之间的任意整数，载体具有免疫原性。
2.根据权利要求1所述的甘胆酸免疫原，其特征在于：载体为具有免疫原性的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的甘胆酸免疫原，其特征在于：R为-(CH2)2-O-CH2-COO-。
4.根据权利要求2所述的甘胆酸免疫原，其特征在于：所述的载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白。
5.一种抗甘胆酸特异性抗体，由权利要求1～4任意一项所述的甘胆酸免疫原免疫宿主动物后分离纯化得到。
6.根据权利要求5所述的一种抗甘胆酸特异性抗体，其特征在于：所述的抗体为完整的抗体分子，或者为，保留与甘胆酸特异性结合的能力的抗体片段或抗体衍生物。
7.根据权利要求5所述的一种抗甘胆酸特异性抗体，其特征在于： 所述的抗体为采用单一的甘胆酸免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的宿主动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马。
8.一种甘胆酸衍生物，其结构式如式（II）所示：
式中R为-(CH2)n-O-CH2-COO-，n为1至20之间的整数。
9.一种甘胆酸检测试剂，含有权利要求5所述的抗甘胆酸特异性抗体、甘胆酸衍生物的酶标偶联物和酶的底物。
10.甘胆酸免疫原的制备方法，由载体和权利要求8所述的甘胆酸衍生物连接而成，取n=2时，其特征在于，其中甘胆酸衍生物的制备步骤如下：
。
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| CN106366193A (zh) * | 2016-08-25 | 2017-02-01 | 广东工业大学 | 一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103739703A (zh) | 2014-04-23 |
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