CN112391353B - 杂交瘤细胞及其制备方法、单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杂交瘤细胞及其制备方法、单克隆抗体及其应用。该杂交瘤细胞的保藏号为GDMCC No：61110。该杂交瘤细胞可分泌效价高且特异性好的抗甘胆酸的单克隆抗体。

Description

杂交瘤细胞及其制备方法、单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种杂交瘤细胞及其制备方法、单克隆抗体及其应用。

背景技术

甘胆酸(Cholylglycine，CG)也称血清甘胆酸，是胆酸与甘氨酸结合而成的结合胆酸，在血清中主要以蛋白结合形式存在，是主要胆酸之一。胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12)，侧链末端的羧基以肽键与甘氨酸结合，形成甘胆酸，甘胆酸的分子量为465.63。

在肝脏中，胆固醇经过酶促反应转变为初级胆汁酸，其中包括胆酸(CA)、鹅去氧胆酸(CDCA)和相应结合型胆汁酸。初级胆汁酸经胆管排入胆囊储存，餐后胆囊收缩，初级胆汁酸随同胆汁进入十二指肠，并在小肠下段和大肠中脱去羟基转化成胆汁酸(包括脱氧胆酸和石胆酸)，参与脂肪的消化吸收。95％的胆汁酸由小肠粘膜重吸收入血，经门静脉输送至肝脏，由肝细胞摄取。正常情况下，肝脏能有效摄取门静脉血中99％以上的甘胆酸，仅有＜1％的甘胆酸溢入体循环，故外周血中甘胆酸含量甚微，空腹甘胆酸浓度约为250μg/dL。

当肝细胞受损，其摄取甘胆酸能力下降，致使血液中甘胆酸含量增高，因此，检测血清甘胆酸具有重要的临床意义。例如，有报道称，血清甘胆酸含量升高程度与肝硬化的病理发展进程呈正相关，是临床判断肝硬化程度和预后很好的指标。此外，血清甘胆酸水平在胆结石、肝结石等患者检测中可达正常人的50倍，可辅助判断及预测肝病、胆囊排泄等功能是否有障碍。又例如，在妊娠晚期，血清甘胆酸水平的检测可辅助判断部分孕妇出现的肝内胆汁淤积(ICP)症状，降低羊水污染、早产、胎儿宫内窘迫及剖宫产的风险。再例如，在临床鉴别慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎方面，血清甘胆酸可作为一项有价值的指标，对判断慢性活动性肝炎的进展和缓解、预测疗效和复发均有很大的价值。

甘胆酸检测试剂盒主要利用能特异性结合甘胆酸的抗体进行甘胆酸检测。然而，目前的甘胆酸检测试剂盒的灵敏度和特异性还有待提高。

发明内容

基于此，有必要提供一种可分泌效价高且特异性好的抗甘胆酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞可以提高甘胆酸检测试剂盒的灵敏度和特异性。

一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞的保藏号为GDMCC No：61110。

上述杂交瘤细胞可分泌效价高且特异性好的抗甘胆酸的单克隆抗体。

一种单克隆抗体，由上述的杂交瘤细胞分泌。

上述的杂交瘤细胞的制备方法，包括以下步骤：

用免疫原免疫动物，得到免疫后的动物的脾细胞，其中，所述免疫原包括甘胆酸和与所述甘胆酸偶联的载体蛋白；

将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合后，筛选，制备阳性融合细胞；及

将所述阳性融合细胞进行亚克隆，得到所述杂交瘤细胞。

在其中一个实施例中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白，所述免疫原由甘胆酸和牛血清白蛋白通过N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法制得。

上述的杂交瘤细胞或上述的单克隆抗体在制备甘胆酸检测试剂盒中的应用。

一种甘胆酸检测试剂盒，包括上述的单克隆抗体。

在其中一个实施例中，所述单克隆抗体上标记有标记物；

可选地，所述标记物为三联吡啶钌、吖啶酯、辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、荧光素、生物素或胶体金。

在其中一个实施例中，所述单克隆抗体被三联吡啶钌标记，所述试剂盒还包括生物素标记的甘胆酸和链霉亲和素包被的磁微粒。

在其中一个实施例中，包括抗体溶液、抗原溶液和磁珠溶液，其中：

所述抗体溶液中含有三联吡啶钌标记的所述单克隆抗体、Tris缓冲液，在所述抗体溶液中，所述三联吡啶钌标记的所述单克隆抗体的浓度为0.1μg/mL～0.5μg/mL；

所述抗原溶液中含有偶联有牛血清白蛋白并标记有生物素的甘胆酸、Tris缓冲液，在所述抗原溶液中，所述偶联有牛血清白蛋白并标记有生物素的甘胆酸的浓度为0.1μg/mL～0.5μg/mL；

所述磁珠溶液中含有链霉亲和素包被的磁珠。

一种甘胆酸检测系统，包括：

检测设备；及

上述的单克隆抗体、或者上述的甘胆酸检测试剂盒。

附图说明

图1为实施例1制得的CG-BSA的SDS-PAGE电泳结果；

图2为实施例1制得的六种杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体的中值效价拟合曲线；

图3为实施例1制得的杂交瘤细胞3F8所分泌的单克隆抗体与其他杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体之间阻断结果；

图4为实施例2的甘胆酸检测试剂盒的标准曲线；

图5为实施例2的甘胆酸检测试剂盒的特异性检测结果；

图6为采用实施例2的甘胆酸检测试剂盒与Snibe的甘胆酸化学发光检测试剂盒的相关性分析。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

本发明一实施方式提供了一种杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞于2020年7月27日保藏于保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：61110。该杂交瘤细胞的名称为：Mus musculus hybridoma 3F8，提议的分类学名称为：Mus musculus hybridoma。该杂交瘤细胞可分泌抗甘胆酸的单克隆抗体，可应用于抗甘胆酸的单克隆抗体的制备。

本发明一实施方式还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体由上述保藏编号为GDMCC No：61110的杂交瘤细胞分泌。该单克隆抗体可与甘胆酸特异性结合，特异性好且效价高，可应用于甘胆酸检测领域。

此外，本发明一实施方式还提供了一种免疫原，该免疫原可以用于制备上述杂交瘤细胞。

具体地，上述免疫原包括甘胆酸和与甘胆酸偶联的牛血清白蛋白(BSA)。由于甘胆酸分子量小，且不具备免疫原性，单独使用时不能诱导机体产生免疫应答。因此，本实施方式通过将甘胆酸与牛血清白蛋白以共价键的形式进行结合形成较大的分子，使其具有免疫原性，诱导免疫应答。可选地，上述免疫原为偶联有牛血清白蛋白(BSA)的甘胆酸。在一个可选地具体示例中，在免疫原中，牛血清蛋白与甘胆酸的摩尔之比为1：(20～40)。通过将牛血清蛋白与甘胆酸的摩尔之比控制为1：(20～40)，有利于获得能够分泌效价高的单克隆抗体的杂交瘤细胞。例如，在免疫原中，牛血清蛋白与甘胆酸的摩尔之比为1：40。

在一些施例中，免疫原由甘胆酸和牛血清白蛋白通过N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法制得。具体地，甘胆酸在二环己基碳化二亚胺(DCC)的作用下，与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应，生成活泼的酯衍生物，然后该活泼的酯衍生物与牛血清白蛋白上的氨基反应，使得甘胆酸与牛血清白蛋白以酰胺键连接，从而得到甘胆酸与牛血清白蛋白偶联的免疫原。免疫原的合成路径如下：

当然，在其他实施例中，免疫原的制备方法不限于上述，还可以是其他方法。

此外，本发明一实施方式还提供了一种上述杂交瘤细胞的制备方法，该制备方法包括步骤a～步骤c，具体地：

步骤a：用免疫原免疫动物，得到免疫后的动物的脾细胞。

具体地，用免疫原多次免疫动物制备免疫后的动物，然后取免疫后的动物的脾细胞。免疫原如上文所述，此处不再赘述。

在一些实施例中，将免疫原与免疫佐剂混合后免疫动物，制备免疫后的动物的脾细胞。具体地，先采用弗氏完全佐剂乳化的免疫原免疫动物，然后用弗氏不完全佐剂乳化的免疫原继续多次免疫，制备免疫后的动物。进一步地，免疫动物为小鼠，弗氏完全佐剂与免疫原的体积之比为1：1，弗氏不完全佐剂与免疫原的体积之比为1：1；在用弗氏完全佐剂乳化免疫原的免疫阶段，免疫动物的免疫剂量为25μg/只～100μg/只；在用弗氏不完全佐剂乳化免疫原的免疫阶段，免疫动物的免疫剂量为25μg/只～50μg/只。

当然，在其他实施例中，免疫动物不限于小鼠，还可以是其他可作为杂交瘤细胞制备过程中的脾细胞的供体的动物。可以理解的是，在其他实施例中，免疫佐剂不限于弗氏佐剂，还可以是其他免疫佐剂。

步骤b：将脾细胞与骨髓瘤细胞融合后筛选，得到阳性融合细胞。

具体地，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，然后经过选择性培养和ELISA间接法筛选，得到阳性融合细胞。更具体地，取血清效价大于1:10⁵的小鼠脾细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞，用质量百分含量为50％PEG 1500进行细胞融合；用含有体积百分含量为20％胎牛血清的HAT-DMEM完全培养基筛选融合细胞；用竞争ELISA方法筛选亲和力高、特异性强的阳性融合细胞。

步骤c：将阳性融合细胞进行亚克隆，得到杂交瘤细胞。

具体地，采用有限稀释法进行亚克隆，得到稳定分泌抗甘胆酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞。将获得的稳定分泌甘胆酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞于2020年7月27日保藏于保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：61110。

上述杂交瘤细胞的制备方法简捷易操作。

本发明一实施方式还提供了一种上述单克隆抗体在制备甘胆酸检测试剂盒中的应用。具体地，上述单克隆抗体特异性好、效价高，可应用于制备甘胆酸检测试剂盒。

本发明一实施方式提供了一种甘胆酸检测试剂盒，该甘胆酸检测试剂盒包括上述单克隆抗体。

在一些实施例中，单克隆抗体为标记的单克隆抗体。例如，采用化学发光免疫检测、酶联免疫检测或放射免疫检测中常用的标记物对单克隆进行标记而得到的带有标记的单克隆抗体。具体地，标记单克隆抗体的标记物为三联吡啶钌、吖啶酯、辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、荧光素、生物素或胶体金。通过单克隆抗体上的标记物可以检测与该单克隆抗体相结合的甘胆酸的量，从而得到检测待测样品中甘胆酸的量。当然，在其他一些实施例中，单克隆抗体也可以不被标记。例如，利用双抗夹心法的检测试剂盒：将单克隆抗体包被在固相载体上，然后通过有标记的其他的能与甘胆酸结合的抗体与甘胆酸的结合，形成双抗夹心复合体，从而检测待测样品中的甘胆酸的量。

进一步地，上述甘胆酸检测试剂盒是利用竞争电化学发光法进行甘胆酸检测的检测试剂盒。具体地，上述甘胆酸检测试剂盒中的单克隆抗体被三联吡啶钌标记。更具体地，上述甘胆酸检测试剂盒还包括生物素标记的甘胆酸和链霉亲和素包被的磁微粒。在一个可选地具体示例中，链霉亲和素包被的磁微粒为链霉亲和素包被的磁珠。可选地，上述甘胆酸检测试剂盒包括抗体溶液、抗原溶液和磁珠溶液，其中：抗体溶液中含有三联吡啶钌标记的单克隆抗体、Tris缓冲液，在抗体溶液中，三联吡啶钌标记的单克隆抗体的浓度为0.1μg/mL～0.5μg/mL；抗原溶液中含有偶联有牛血清白蛋白并标记有生物素的甘胆酸、Tris缓冲液，在抗原溶液中，偶联有牛血清白蛋白并标记有生物素的甘胆酸的浓度为0.1μg/mL～0.5μg/mL；磁珠溶液中含有链霉亲和素包被的磁珠。可选地，在抗体溶液和抗原溶液中的Tris缓冲液的pH为7.3～7.6。

进一步地，在抗体溶液中，三联吡啶钌标记的单克隆抗体的浓度为0.25μg/mL；在抗原溶液中，偶联有牛血清白蛋白并标记有生物素的甘胆酸的浓度为0.5μg/mL。

上述甘胆酸检测试剂盒含有上述单克隆抗体，灵敏度高，特异性好，稳定性高。

本发明一实施方式还提供了一种甘胆酸检测系统，该甘胆酸检测系统包括上述单克隆抗体或上述甘胆酸检测试剂盒，及检测设备。检测设备用于检测由上述单克隆抗体或上述甘胆酸检测试剂盒中的单克隆抗体与待测样品中的甘胆酸特异性结合后形成的带有标记的复合物。可选地，检测设备为酶标仪或电化学发光分析仪。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

(1)合成甘胆酸偶联物：

将46.6mg(100μmol)甘胆酸、17.0mg(150μmol)NHS溶于1mL DMF溶液中，并加入31.0mg(150μmol)DCC，将混合液置于4℃过夜搅拌。反应完毕后离心，并吸取上清，去除白色二环己脲沉淀。分别取900μL上清液，逐滴加入用8mL PBS(10mM,pH 7.4)溶解的BSA(113mg)和OVA(卵清蛋白，75mg)溶液中，制备含有BSA和甘胆酸的混合液和含有OVA和甘胆酸的混合液；接着将混合液置于4℃搅拌12h。最后用PBS(10mM，pH7.4)透析，得到偶联有牛血清白蛋白的甘胆酸(也即是CG-BSA)和偶联有卵清蛋白的甘胆酸(也即是CG-OVA)，备用。

此外，将得到的CG-BSA经SDS-PAGE分析，其纯度大于90％，SDS-PAGE图谱如图1所示。在图1中，M为Marker，单位为kDa；第一泳道为采用上述方法制得的CG-BSA；第二泳道为BSA。由图1可知，BSA和CG-BSA都只有一条带，无杂蛋白。在同一条件下，分子量大的蛋白或蛋白偶联物迁移距离小。图1中CG-BSA的迁移距离比BSA略小，说明BSA偶联甘胆酸成功。

(2)免疫BalB/c小鼠：

将步骤(1)制得的CG-BSA作为免疫原，用10mM、pH7.4 PBS缓冲液稀释到2μg/mL，并与弗氏佐剂按照体积比1：1的比例混合制成乳状液。首次免疫使用弗氏完全佐剂，每只小鼠抗原注射量为100μg，背部皮下注射5点～7点，共免疫3只BalB/c母鼠。两周以后免疫使用弗氏不完全佐剂(弗氏不完全佐剂与用PBS缓冲液将CG-BSA稀释为浓度为2μg/mL的CG-BSA溶液的体积之比为1：1)，每只小鼠注射量为50μg，每隔两周免疫一次，共免疫三次。当然，免疫前采集尾静脉血清作为阴性对照。

(3)检测血清抗体效价：

用间接ELISA检测步骤(2)的经四次免疫的小鼠血清中抗体效价。具体地：采用50mM、pH 9.6的碳酸缓冲液，将步骤(1)制得的CG-OVA稀释成为1μg/mL后包被聚苯乙烯微孔板，每孔100μL，4℃孵育过夜；用10mM、pH7.4的PBST(含0.01％Tween-20(V/V)，Sigma)缓冲液洗板3次后，将板拍干。用含质量百分含量为5％BSA，10mM、pH7.4的PBS封闭液进行封闭，每孔100μL，37℃孵育2h，用10mM、pH7.4的PBST(含0.01％Tween-20(V/V))缓冲液洗板3次，将板拍干备用。然后在包被好CG-OVA的微孔板中加入步骤(2)制得的小鼠的尾静脉血清，从1:100开始做5倍梯度稀释，每孔100μL，37℃孵育1h。洗板3次后，将板拍干，加入比例1:5000倍的HRP标记羊抗鼠IgG(南京金斯瑞)，每孔100μL，37℃孵育30min；洗板3次且板拍干后，加入TMB显色液显色(广州捷倍斯)每孔100μL，37℃避光孵育10min；最后加入50μL/孔，2MH₂SO₄终止反应，在酶标仪上用波长450nm进行检测读数，以免疫前小鼠血清为阴性对照，以测定值与阴性对照比值≧2.0为阳性判断标准，计算免疫血清抗体效价。

经计算发现，经CG-BSA免疫的小鼠的血清抗体效价最高可以达到1：3.125×10⁶。

(4)制备Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞：

在细胞融合前1周，复苏Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞至小瓶，并用DMEM完全培养基培养。待细胞长满(细胞融合度达到90％)后，传代培养以备用。细胞融合前1天，转移Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞至新鲜完全培养基中。在细胞融合前，用倒置显微镜确定Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞生长状况良好(折光力强，未污染，并且生长足量)。融合当天，用无菌滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50mL离心管内。1400g离心8min，弃上清。接着加入35mL DMEM不完全培养基，吹匀Sp2/0-Ag14悬液，并进行细胞计数，为1×10⁷个细胞/mL；然后1400g离心8min，弃上清备用。

(5)制备脾细胞：

先将步骤(2)经过四次免疫后且血清抗体效价最高的小鼠固定，用镊子夹住小鼠眼球并拉出，收集眼血至1.5mL EP管中，12000rpm离心5min，收集上清标记备用。然后拉颈处死小鼠，放入75％酒精中浸泡3min。接着将处死后的小鼠放入已灭菌的平皿上，无菌取出脾脏，用剪刀剔除脾脏上多余的组织，将脾脏移至预置了10mL不完全培养基的培养皿中，进行清洗。将洗净的脾组织放入200目尼龙网过滤网上，使用弯剪将组织分成4块，并轻轻将脾脏磨碎，期间不断滴加不完全培养基，使磨碎的细胞通过200目尼龙网进一步分离，制成脾细胞的单细胞悬液。将脾细胞的单细胞悬液移至50mL离心管中，并添加35mL不完全培养基，2300g室温离心10min，弃上清；接着加入35mL不完全培养基将脾细胞沉淀重悬，1400g离心8min，弃上清；然后再次加入35mL不完全培养基将脾细胞沉淀重悬，并进行细胞计数；然后将细胞数调整为1×10⁸个细胞/mL。接着将调整了细胞密度的脾细胞悬液1400g离心8min，弃上清，备用。

(6)细胞融合：

按照Sp2/0-Ag14和脾细胞的个数比为1:5的比例(即Sp2/0-Ag14的细胞个数为6.48×10⁷，脾细胞的细胞个数为3.24×10⁸)将脾细胞转入Sp2/0-Ag14中，并加入35mL DMEM不完全培养基，1400g离心8min。将离心后的混合细胞内的培养基用吸管吸出，减少离心管中的培养基量，以免稀释PEG，并将管底细胞用手轻轻弹散。将装有混合细胞的离心管放入37℃水的烧杯中水浴。使用1mL移液管向混合细胞中加入0.8mL 37℃预热的质量百分含量为50％PEG(聚乙二醇，MW1500，Sigma)溶液，在1min内匀速、逐滴加入，边加边用移液管轻轻混匀细胞。滴加完成后用移液管轻轻混匀90s。使用干净移液管向混合细胞液中逐滴加入预热的DMEM不完全培养基，同时轻轻混匀。4min内匀速滴加4mL不完全培养基；然后1min内匀速滴加10mL不完全培养基，共用时间7.5min。然后在37℃放置5min，1400g离心7min，弃上清。之后，加入HAT-DMEM完全培养基(含20％胎牛血清，Gibco)混匀融合细胞，平均加入到预先铺好腹腔细胞的96孔板中。标记融合时间，并置于37℃5％CO₂培养箱培养。培养3天后，在倒置显微镜下可观察到细胞团；若细胞团长势良好，培养6天后，将所有细胞板半换液成新鲜的HAT-DMEM完全培养基(含20％胎牛血清，Gibco)进行培养。

(7)筛选分泌甘胆酸抗体的杂交瘤细胞株：

将步骤(1)制备的CG-OVA作为检测抗原，用50mM、pH 9.6的碳酸缓冲液稀释至1μg/mL，4℃包被过夜。第2天加入100μL/孔10mM、pH7.4的PBS含质量百分含量为5％BSA的封闭液进行封闭，置于37℃封闭2h。洗板后4℃备用。

在细胞融合7天后，先在包被板1中加入50μL 10mM pH 7.4的PBS缓冲液，包被板2中加入50μL 15μg/mL的CG，然后在含PBS包被板1及含小分子抗原包被板2中分别加50μL细胞融合7天后的细胞上清液，将小鼠阳性血清(免疫四次后的血清)1：500稀释后作为阳性对照。37℃孵育2h。每孔加入100μL酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP，比例1:5000，南京金斯瑞)，37℃孵育30min。接着每孔加入100μL TMB显色液，37℃放置。反应10min后加入2M H₂SO₄终止液终止反应，并置于酶标仪上，450nm检测其OD值。判定标准：选择包被板1中测定值与阴性对照比值大于2.0的孔，及对应包被板2中检测结果为阴性或接近阴性的细胞孔，根据公式：

计算单抗的亲和常数。(其中，A₀为无抗原时OD₄₅₀值，A为采用CG抗原的OD₄₅₀值，a₀为抗原浓度，K为亲和常数)。挑出亲和力高的阳性细胞孔，并做标记后，进行复测。复测时，先取4块包被板，分别标记为板1、板2、板3、板4，依次在板1中加入50μL的20μg/mL牛黄胆酸钠(TCS)、在板2中加入50μL的20μg/mL石胆酸(LCA)、在板3中加入50μL的20μg/mL胆酸(CA)、在板4中加入50μL、20μg/mL甘氨脱氧胆酸(GDCA))，然后分别在4块包被板中加入50μL细胞上清液，进行ELISA检测，挑出比值大于2.0的阳性孔进行亚克隆，并用有限稀释法连续克隆化3～4次，直至获得100％阳性率为止。按照上述方法，最终获得6株稳定分泌抗甘胆酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞(如表1所示)。将获得的阳性细胞扩增培养后冻存于液氮中。

表1

(8)抗体亚型鉴定：

用50mM pH 9.6碳酸缓冲液稀释亚型抗体。IgG1、IgG2b、IgG3稀释比例为1：1000；IgG2a、IgM稀释比例为1：5000。每孔100μL，4℃包被过夜。用PBST洗板3次后，将板拍干，每孔加入300μL 2％BSA的PBST封闭液，37℃孵育1h。用PBST洗板3次后，将板拍干。每孔加入100μL检测样本(6种杂交瘤细胞的培养上清)，37℃孵育1h。用PBST洗板3次后，将板拍干。用含0.1％BSA的PBST稀释羊抗鼠IgG-HRP，比例为1：10000，每孔加入100μL，37℃孵育1h。用PBST洗板3次后，将板拍干。每孔加入100μL TMB显色液，室温孵育10min，避光进行。每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止反应，检测450nm处的吸光度并记录结果，判定其亚型。结果如表1所示。

(9)腹水制备及采集：

在接种杂交瘤细胞的前一周，用5mL注射器往4只Balb/C小鼠腹腔内分别注射0.5mL石蜡油。在ELISA检测杂交瘤细胞上清液为阳性后，用滴管将细胞从细胞培养瓶壁轻轻吹下，将阳性细胞计数，1400g离心6min，弃上清。用生理盐水洗涤细胞1次，按照每只小鼠注射60万个细胞的量计算4只石蜡鼠所需细胞用量，对小鼠进行腹腔注射。6天后观察小鼠状态，如小鼠腹部明显变大，肤色明显变黑，即判断腹水产生，可进行腹水采集。每隔1天，抽取腹水1次。腹水收集后，5000rpm离心5min，取上清，并汇总腹水收集量，结果如表1所示。

(10)腹水效价检测

采用ELISA检测腹水效价，具体地：第1孔为2000倍稀释腹水，从第2孔开始，用10mM、pH7.4的PBS 5倍逐级稀释至第9孔，将步骤(2)中免疫四次后且血清效价最高的小鼠的血清稀释500倍为阳性对照，以PBS为阴性对照。腹水效价判定标准：阳性对照OD₄₅₀>1.0，阴性对照OD₄₅₀<0.2，以阳性测定值与阴性对照比值大于2.0的孔对应的稀释比例，即为腹水效价。腹水效价测定结果见表2。

表2

由表2可知，杂交瘤细胞3F8的腹水效价最高，为1.25×10⁶，其次是杂交瘤细胞3G10、杂交瘤细胞1D9、杂交瘤细胞1B3和杂交瘤细胞3E8，均为2.50×10⁵，杂交瘤细胞5E5的腹水效价最低，为5.00×10⁴。

(11)抗体纯化及纯度鉴定

采用亲和层析法Protein A Sepharose Fast Flow纯化收集的腹水，以HPLC检测单克隆抗体纯度，结果如下表3所示。

表3

由表3可知，各杂交瘤细胞分泌的抗甘胆酸的单克隆抗体的纯度可达到90％以上。

(12)抗体效价检测

先将各杂交瘤细胞产生的抗甘胆酸的单克隆抗体的浓度用10mM pH7.4的PBS统一稀释为1000μg/mL，从第2孔开始，用10mM、pH 7.4的PBS按照5倍逐级稀释至第10孔，将步骤(2)中免疫四次后且血清效价最高的小鼠的血清稀释500倍为阳性对照，以PBS为阴性对照，采用ELISA测定各单克隆抗体的OD₄₅₀，结果如表4和图2所示。抗体效价判定标准：以Log(稀释度)为横坐标，以抗体OD₄₅₀值为纵坐标作曲线，曲线方程：y＝min+(max-min)/(1+10^((LoGEC50-x)×Hillslope))，通过sigmaplot数据处理软件拟合曲线，并获得中值效价。

结果显示，甘胆酸抗体杂交瘤细胞3F8所产生的单克隆抗体的中值效价最高为113567.2；杂交瘤细胞3E8所产生的单克隆抗体的中值效价最低为6336.85。杂交瘤细胞5E5所产生的单克隆抗体的中值效价为84116.88，杂交瘤细胞1B3所产生的单克隆抗体的中值效价为89155.11，杂交瘤细胞1D9所产生的单克隆抗体的中值效价为70287.96，杂交瘤细胞3G10所产生的单克隆抗体的中值效价为30598.19。

表4

(13)抗体识别表位检测

ELISA板条中包被步骤(1)制备的CG-OVA作为检测抗原，分别向ELISA板条的不同孔中加入不同的抗甘胆酸的单克隆抗体，并使抗甘胆酸的单克隆抗体的量足够多，达到过量，置于37℃孵育1h，弃掉孔中液体，在不同孔中分别加入HRP标记的CG单抗(抗甘胆酸的单克隆抗体(mAb)的HRP标记使用改良的过碘酸钠法)，37℃孵育1h，TMB显色结束后，450nm处检测吸光值(OD₄₅₀)，计算抑制率，即(OD₄₅₀对照组-OD₄₅₀实验组)/OD₄₅₀对照组，抑制率越大，与抗原结合位点重叠的可能性越大。结果如图3所示，图3中，横坐标中的“1B3”对应于杂交瘤细胞1B3所产生的单克隆抗体，“1D9”对应于杂交瘤细胞1D9所产生的单克隆抗体，“3E8”对应于杂交瘤细胞3E8所产生的单克隆抗体，“3G10”对应于杂交瘤细胞3G10所产生的单克隆抗体，“5E5”杂交瘤细胞5E5所产生的单克隆抗体。

由图3可知，用HRP标记杂交瘤细胞3F8所产生的单克隆抗体与其他5株杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体竞争甘胆酸上的B细胞表位。杂交瘤细胞1B3、杂交瘤细胞1D9、杂交瘤细胞3E8、杂交瘤细胞3G10、杂交瘤细胞5E5之间反应抑制率均在85％以上，抑制明显，表明其识别位点可能相同，将这5株抗体归为一类，识别同一种抗原表位。

综上，杂交瘤细胞3F8所产生的单克隆抗体的效果好，将杂交瘤细胞3F8于2020年7月27日保藏于保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：61110。

实施例2

将杂交瘤细胞3F8所产生的单克隆抗体应用在甘胆酸检测试剂盒中。具体地，该检测试剂盒利用竞争电化学发光法进行检测，具体试剂包括抗体溶液、抗原溶液、磁珠溶液、阳性校准品、阴性校准品，其中：抗体溶液由三联吡啶钌标记的杂交瘤细胞3F8所产生的单克隆抗体、pH 7.4的0.01M Tris缓冲液组成，在抗体溶液中，三联吡啶钌标记的杂交瘤细胞3F8所产生的单克隆抗体的浓度为0.25μg/mL；抗原溶液由偶联有牛血清白蛋白并标记有生物素的甘胆酸、pH 7.4的0.01M Tris缓冲液，在抗原溶液中，偶联有牛血清白蛋白并标记有生物素的甘胆酸的浓度为0.5μg/mL；磁珠溶液由链霉亲和素包被的磁珠和pH 7.4的0.01MPBS缓冲液组成，在磁珠溶液中链霉亲和素包被的磁珠的浓度为0.75mg/mL。

实施例2的甘胆酸检测试剂盒的使用如下：

将30μL待样本、65μL 0.25μg/mL三联吡啶钌标记的杂交瘤细胞3F8所产生的单克隆抗体一起孵育9min，形成抗原抗体复合物；之后加入65μL 0.5μg/mL偶联有牛血清白蛋白并标记有生物素的甘胆酸、35μL 0.75mg/mL链霉亲和素包被的磁微粒进行孵育9min，偶联有牛血清白蛋白并标记有生物素的甘胆酸竞争三联吡啶钌标记的杂交瘤细胞3F8所产生的单克隆抗体的位点，生物素与链霉亲和素间的反应结合，从而形成钌标记的CG单抗-生物素化的CG-BSA-磁珠复合物。然后将反应混和液吸到测量池中，磁微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，钌标记的CG单抗-生物素化的CG-BSA-磁珠复合物在电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行检测，检测结果由仪器自动从标准曲线(图4)上输出。图4中，抑制率RLU/RLU₀为纵坐标，甘胆酸浓度的对数值为横坐标，由图4可知，IC50为0.171μg/mL。

测定实施例2的甘胆酸检测试剂盒的灵敏度、准确度、线性范围、特异性、稳定性等指标：

(1)分析灵敏度

以零浓度校准品(阴性人血清)作为待测样本采用实施例2的甘胆酸检测试剂盒进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的相对发光值(RLU)，并计算其平均值

和标准差(SD)，得出X-2SD。根据零浓度校准品与相邻浓度校准品之间的浓度0.2μg/mL-相对光强(RLU)结果进行两点回归拟合得出一次方程，将

-2SD所对应的相对光强代入拟合出的一次方程中，求出对应的浓度值为0.013μg/mL，即实施例2的甘胆酸检测试剂盒的灵敏度为0.013μg/mL，优于常规的甘胆酸检测试剂盒的灵敏度，其中，常规的甘胆酸检测试剂盒的灵敏度可以达到0.02μg/mL。

(2)准确度检测

将甘胆酸高值样本C1加入到基础样本C0中，配制成3个不同浓度的检测样本：C_测1、C_测2、C_测3，所加入CG高值样本与基础样本之间的体积比不大于1：9，根据回收率公式：

计算回收率，其中，R为回收率；V₁为高值样本体积；V₀为基础样本体积；C_测i为加入高值样本后的检测浓度(采用实施例2的甘胆酸检测试剂盒测得)，i＝1，2，3；C₀为基础样本浓度；C₁为高值样本浓度。结果如表5所示。

表5

由表5可以看出，实施例2的甘胆酸检测试剂盒的回收率在90％～110％范围内，为101％～104％，说明实施例2的甘胆酸检测试剂盒的准确性高。

(3)线性检测

用实施例2的甘胆酸检测试剂盒，测定浓度值略高于线性上限的高值样本(异常病人血清)和用阴性人血清按比例稀释至少5种浓度的样本，且将待测样本随机排列，重复测定2次，并计算其平均值，根据稀释比计算各样本理论浓度值，测定结果平均值为纵坐标做图，作线性回归，计算其斜率、截距、相关系数R²，结果如表6所示。

表6

由表6可知，R²＝0.9927，在检测范围内，线性相关度高。

(4)特异性检测

用阴性人血清将鹅去氧胆酸(CDCA)、去氧胆酸(DCA)、牛黄胆酸钠(TCS)、石胆酸(LCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、胆酸(CA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)以及睾酮(TESTO)和孕酮(PROG)分别配制成测试样本，采用实施例2的甘胆酸检测试剂盒将每个测试样本检测两次，计算其交叉反应率，结果如图5和表7所示。

表7实施例2的甘胆酸检测试剂盒的特异性检测结果

特异性物质	名称缩写	交叉反应率
			牛黄胆酸钠	TCS	1.70％
胆酸	CA	1.20％
			甘氨脱氧胆酸	GDCA	0.78％
睾酮	TESTO	0.00％
			孕酮	PROG	0.00％
熊去氧胆酸	UDCA	-0.32％
			去氧胆酸	DCA	-0.46％
鹅去氧胆酸	CDCA	-0.57％
			石胆酸	LCA	-0.70％

由图5和表7可知，实施例2的甘胆酸检测试剂盒中的由杂交瘤细胞3F8所分泌的抗甘胆酸的单克隆抗体对甘胆酸的亲和性好，特异性高，与9种甘胆酸类似物的交叉反应率小于2％。该抗体的获得主要与筛选高亲和力、强特异性的甘胆酸杂交瘤细胞株有关，利用甘胆酸特筛选抗体，最大限度的排除了与类似物反应的细胞株，提高了抗体的特异性。

(5)相关性检测

将实施例2的甘胆酸检测试剂盒与Snibe的甘胆酸化学发光检测试剂盒进行对比验证，并进行相关性分析，结果如图6所示。

由图6可以看出，两者的相关系数R²≧0.9940，说明这两种检测试剂盒的检测结果有较好的相关性。

(6)稳定性检测

将实施例2的甘胆酸检测试剂盒中的抗体溶液进行以下处理：a：-20℃反复冻融3次；b：-20℃反复冻融4次；c：-20℃反复冻融5次；d：-20℃反复冻融6次；e：-20℃反复冻融7次；f：-20℃保存3个月；g：37℃热加速7天；h：37℃热加速14天。然后利用经过上述不同条件处理的抗体溶液检测低值样本(浓度为4.0μg/mL)和高值样本(浓度为12.0μg/mL)，各检测3遍，计算偏差和变异系数，结果如表8所示。

表8

由表8可知，利用经过上述不同条件处理的抗体溶液检测低值样本的偏差和利用经过上述不同条件处理的抗体溶液检测的偏差均小于4％，表明实施例2的甘胆酸检测试剂盒中的抗体溶液的稳定性良好，且利用本抗体制备的试剂盒精密度良好。

并且，采用实施例2的甘胆酸检测试剂盒对低值样本及高值样本在37℃热加速14天后检测结果的偏差分别为1.38％和3.84％，优于常规的甘胆酸检测试剂盒对低值样本及高值样本在37℃热加速14天后检测结果的偏差(具体地，常规的甘胆酸检测试剂盒的低值样本的检测偏差为5.81％，高值样本的检测偏差为7.24％，)，说明实施例2的甘胆酸检测试剂盒中的抗体溶液在37℃下具有较高的热稳定性，实施例2的甘胆酸检测试剂盒的有效期长。

综上，实施例1的杂交瘤细胞3F8所产生的抗甘胆酸的单克隆抗体效价高，特异性好，采用实施例1的杂交瘤细胞3F8所产生的抗甘胆酸的单克隆抗体指标的甘胆酸检测试剂盒的灵敏度高、特异性强、稳定性好，能在电化学发光平台定量检测血清或血浆中甘胆酸含量，与市场上在售试剂检测结果高度相关。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞的保藏号为GDMCC No：61110。

2.一种单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞或权利要求2所述的单克隆抗体在制备甘胆酸检测试剂盒中的应用。

4.一种甘胆酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的甘胆酸检测试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体上标记有标记物。

6.根据权利要求5所述的甘胆酸检测试剂盒，其特征在于，所述标记物为三联吡啶钌、吖啶酯、辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、荧光素、生物素或胶体金。

7.根据权利要求6所述的甘胆酸检测试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体被三联吡啶钌标记，所述试剂盒还包括生物素标记的甘胆酸和链霉亲和素包被的磁微粒。

8.根据权利要求4所述的甘胆酸检测试剂盒，其特征在于，包括抗体溶液、抗原溶液和磁珠溶液，其中：

所述抗体溶液中含有三联吡啶钌标记的所述单克隆抗体、Tris缓冲液，在所述抗体溶液中，所述三联吡啶钌标记的所述单克隆抗体的浓度为0.1μg/mL～0.5μg/mL；

所述抗原溶液中含有偶联有牛血清白蛋白并标记有生物素的甘胆酸、Tris缓冲液，在所述抗原溶液中，所述偶联有牛血清白蛋白并标记有生物素的甘胆酸的浓度为0.1μg/mL～0.5μg/mL；

所述磁珠溶液中含有链霉亲和素包被的磁珠。

9.一种甘胆酸检测系统，其特征在于，包括：

检测设备；及

权利要求2所述的单克隆抗体、或者权利要求4～8任一项所述的甘胆酸检测试剂盒。

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