CN106366193A - 一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法 - Google Patents

一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫学技术领域，公开了一种以胆酸为原料来制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法。所述多克隆抗体是以胆酸为原料人工合成的甘氨胆酸衍生物作为半抗原与载体蛋白结合免疫动物制成，其中所述甘氨胆酸衍生物作为半抗原是由胆酸与4‑氨基丁酸反应制成。本发明制备的甘氨胆酸多克隆抗体具有较高的特异性，且合成方法简便，成本低廉，可用于甘氨胆酸的快速免疫检测，具有良好的应用价值。

Description

一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，特别涉及一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法。
背景技术
甘氨胆酸(glycocholic acid)是白色晶体，不溶于水，溶于有机溶剂，分子式为C26H43NO6，分子量为465.6227。甘氨胆酸是胆汁酸的主要成分之一，是胆酸与甘氨酸在肝脏内合成的结合胆酸复合物，具有抗炎，免疫功能的调节作用。据报道甘氨胆酸钠盐在人体中具有较强的表面活性，是良好的乳化剂，临床上甘氨胆酸可以作为药物赋形剂和吸收促进剂。在正常情况下肝脏可以有效的摄取甘氨胆酸，在人体循环中能维持稳定的水平。当肝细胞损伤或者胆汁淤积时肝脏对甘氨胆酸摄取和排泄功能发生障碍导致血液中甘氨胆酸含量增加。空腹血清甘氨胆酸含量变化是诊断急、慢性肝炎，重症肝炎的敏感指标。对肝病病情观察和预后判断，鉴别慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎，判定慢性活动性肝炎发展或缓慢，监测疗效，及肝癌诊断等都有重要的参考意义。目前已知检测甘氨胆酸的方法有放射性免疫法(RIA)、高相液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光法等。
发明内容
为了克服现有技术中的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法，该方法按照以下步骤：
(1)半抗原的合成：以四氢呋喃为溶剂，在三乙胺和氯甲酸异丁酯的催化作用下，胆酸与4-氨基丁酸发生发应，得到半抗原；
(2)免疫抗原的合成：采用混合酸酐法将步骤(1)所得半抗原与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫抗原；
(3)包被抗原的合成：采用混合酸酐法将甘氨胆酸与卵清蛋白进行偶联，得到包被抗原；
(4)多克隆抗体的制备：用步骤(2)合成的免疫抗原免疫兔子，取血，离心得到抗血清，即为甘氨胆酸多克隆抗体。
步骤(1)所述半抗原的合成具体按照以下步骤：称取1～5g胆酸加到烧瓶中，依次向其中加入2～15ml无水的四氢呋喃、0.5～2.5ml三乙胺和0.5～2.3ml氯甲酸异丁酯，室温搅拌0.2～1.5h，待溶液变澄清后，再加入0.4～2.5g 4-氨基丁酸，继续室温搅拌反应2～5天；反应完成后，加入去离子水，减压旋转蒸发除去四氢呋喃，然后用盐酸调节溶液的pH至酸性，用乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯层，减压旋转蒸发得到粗产品；最后以二氯甲烷：甲醇：乙酸＝10：1：0.01为展开剂将上述粗产品通过硅胶柱进行分离提纯，得到半抗原。
步骤(2)所述免疫抗原的合成具体按照以下步骤：称取10～40mg步骤(1)所得半抗原溶于0.3～1.2ml N,N-二甲基甲酰胺，再加入5～20μl三正丁胺和4～20μl氯甲酸异丁酯制得A液，在2～10ml碳酸盐缓冲溶液中加入0.4～1.2μl N,N-二甲基甲酰胺和15～70mg牛血清蛋白制得B液；将A液滴加在B液中，4℃搅拌过夜，第二天把反应液放入透析袋中，在4℃条件下用磷酸缓冲盐溶液透析三天，每天换三次透析液，得到免疫抗原。
步骤(3)所述包被抗原的合成具体按照以下步骤：称取5mg甘氨胆酸溶于150μl N,N-二甲基甲酰胺，加入2.4μl三正丁胺和1.9μl氯甲酸异丁酯制得A液，在1ml碳酸盐缓冲溶液中加入200μl N,N-二甲基甲酰胺和10mg卵清蛋白制得B液；将A液滴加在B液中，4℃搅拌过夜，第二天把反应液放入透析袋中，用磷酸缓冲盐溶液透析三天，每天换三次透析液，得到包被抗原。
步骤(4)所述用步骤(2)合成的免疫抗原免疫兔子的过程包括以下几个步骤：选取两只新西兰大白兔，雌性，月龄3个月，体重1.5-2公斤；用新鲜配制的磷酸缓冲盐溶液将步骤(2)所得免疫抗原配制成1mg/ml的免疫抗原溶液，各取1ml免疫抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂，用乳化器进行乳化使其完全混为一相，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2ml；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂与免疫抗原溶液混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2ml，以后每隔两周进行加强免疫一次；加强免疫4次后，于最后一次免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于4℃冰箱过夜，第二天以10000r/min的离心速度，离心分离10min，分离取上清液，得到甘氨胆酸多克隆抗体，于-20℃保存备用。
与现有的方法相比，本发明具有以下优点及有益效果：本发明制备的甘氨胆酸多克隆抗体具有较高的特异性，且合成方法简便，成本低廉，可用于甘氨胆酸的快速免疫检测，具有良好的应用价值。
附图说明
图1是本发明所述的半抗原的合成路线。
图2是本发明所述的免疫抗原电泳图。
图3是本发明所述的制备的甘氨胆酸抗体效价图。
具体实施方法
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法，该方法按照以下步骤：
(1)半抗原的合成：称取1.5g胆酸加到烧瓶中，依次向其中加入3ml无水的四氢呋喃、509μl三乙胺和464μl氯甲酸异丁酯，室温搅拌30min，待溶液变澄清后，再加入379mg 4-氨基丁酸，继续室温搅拌反应3天；反应完成后，加入去离子水，减压旋转蒸发除去四氢呋喃，然后用盐酸调节溶液的pH至酸性，用乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯层，减压旋转蒸发得到粗产品；最后以二氯甲烷：甲醇：乙酸＝10：1：0.01为展开剂将上述粗产品通过硅胶柱进行分离提纯，得到半抗原；(反应过程如图1所示)
(2)免疫抗原的合成：称取10mg步骤(1)所得半抗原溶于300μl N,N-二甲基甲酰胺，再加入4.7μl三正丁胺和3.8μl氯甲酸异丁酯制得A液，在2ml碳酸盐缓冲溶液中加入400μlN,N-二甲基甲酰胺和20mg牛血清蛋白制得B液；将A液滴加在B液中，4℃搅拌过夜，第二天把反应液放入透析袋中，在4℃条件下用磷酸盐缓冲溶液透析三天，每天换三次透析液，得到免疫抗原；(所得免疫抗原的电泳图如图2所示，其中免疫抗原的电泳图与BSA相比发生了明显变化，说明半抗原与载体蛋白偶联成功)
(3)包被抗原的合成：称取5mg甘氨胆酸溶于150μl N,N-二甲基甲酰胺，加入2.4μl三正丁胺和1.9μl氯甲酸异丁酯制得A液，在1ml碳酸盐缓冲溶液中加入200μl N,N-二甲基甲酰胺和10mg卵清蛋白制得B液；将A液滴加在B液中，4℃搅拌过夜，第二天把反应液放入透析袋中，用磷酸缓冲盐溶液透析三天，每天换三次透析液，得到包被抗原；
(4)多克隆抗体的制备：实验采用2只新西兰大白兔，雌性，月龄3个月，体重1.5-2公斤，饲养在标准动物房内，连续观察一周，确定其状态良好后，开始进行免疫；
用新鲜配制的磷酸缓冲盐溶液将步骤(2)所得免疫抗原配制成1mg/ml的免疫抗原溶液，各取1ml免疫抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂，用乳化器进行乳化使其完全混为一相，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2ml；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂与免疫抗原溶液混合乳化，，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2ml，以后每隔两周进行加强免疫一次；加强免疫4次后，于最后一次免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于4℃冰箱过夜，第二天以10000r/min的离心速度，离心分离10min，分离取上清液，得到甘氨胆酸多克隆抗体，于-20℃保存备用。
实施例2
采用间接ELISA方法检测兔子血清中抗体的效价，包括以下步骤：
(1)包被：将包被抗原用碳酸盐缓冲液稀释至5μl/ml并充分混匀，使用移液枪100μl/孔添加到微孔板中，置于37℃水浴锅温浴1小时后，再放置于4℃冰箱中包被过夜；
(2)清洗：将孔中的液体甩干，用PBST洗涤液清洗3次，再将孔中剩余的液体在吸水纸上拍干；
(3)封闭：用含浓度为30mg/ml的脱脂奶粉磷酸缓冲盐溶液，270μl/孔加入到微孔板中，37℃温浴1小时，重复步骤(2)；
(4)竞争反应：将实施例1最后所得的抗血清(即甘氨胆酸多克隆抗体血清)用磷酸缓冲盐溶液，按体积倍比稀释成1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000的溶液，以100μl/孔加入到微孔板中，同时增加空白对照，37℃温浴1小时，重复步骤(2)；
(5)加酶标二抗：加入以磷酸缓冲盐溶液稀释5000倍数的酶标二抗，按照100μl/孔添加到微孔板中，放置于37℃温浴1小时，重复步骤(2)；
(6)显色：在已配制的10ml底物缓冲液中，加入10μl 30％过氧化氢并充分混匀，按照100μl/孔加到微孔板中，置于37℃下避光孵育15分钟。
终止和读数：向酶标版的微孔中加入50μl/孔的2M硫酸终止反应。设定酶标仪测定波长参数为450nm，并测定其光密度值。阳性的判定原则：样品孔OD值大于空白处读数的2.1倍即可判定为阳性。(甘氨胆酸多克隆抗体的效价图如图3所示，使用实施例2中对应的分析方法，说明制备的甘氨胆酸多克隆抗体效价达到1:64000倍)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法，其特征在于：该方法按照以下步骤：
(1)半抗原的合成：以四氢呋喃为溶剂，在三乙胺和氯甲酸异丁酯的催化作用下，胆酸与4-氨基丁酸发生发应，得到半抗原；
(2)免疫抗原的合成：采用混合酸酐法将步骤(1)所得半抗原与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫抗原；
(3)包被抗原的合成：采用混合酸酐法将甘氨胆酸与卵清蛋白进行偶联，得到包被抗原；
(4)多克隆抗体的制备：用步骤(2)合成的免疫抗原免疫兔子，取血，离心得到抗血清，即为甘氨胆酸多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法，其特征在于：步骤(1)所述半抗原的合成具体按照以下步骤：称取1～5g胆酸加到烧瓶中，依次向其中加入2～15ml无水的四氢呋喃、0.5～2.5ml三乙胺和0.5～2.3ml氯甲酸异丁酯，室温搅拌0.2～1.5h，待溶液变澄清后，再加入0.4～2.5g4-氨基丁酸，继续室温搅拌反应2～5天；反应完成后，加入去离子水，减压旋转蒸发除去四氢呋喃，然后用盐酸调节溶液的pH至酸性，用乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯层，减压旋转蒸发得到粗产品；最后以二氯甲烷：甲醇：乙酸＝10：1：0.01为展开剂将上述粗产品通过硅胶柱进行分离提纯，得到半抗原。
3.根据权利要求1所述的一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法，其特征在于：步骤(2)所述免疫抗原的合成具体按照以下步骤：称取10～40mg步骤(1)所得半抗原溶于0.3～1.2ml N,N-二甲基甲酰胺，再加入5～20μl三正丁胺和4～20μl氯甲酸异丁酯制得A液，在2～10ml碳酸盐缓冲溶液中加入0.4～1.2μl N,N-二甲基甲酰胺和15～70mg牛血清蛋白制得B液；将A液滴加在B液中，4℃搅拌过夜，第二天把反应液放入透析袋中，在4℃条件下用磷酸缓冲盐溶液透析三天，每天换三次透析液，得到免疫抗原。
4.根据权利要求1所述的一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法，其特征在于：步骤(3)所述包被抗原的合成具体按照以下步骤：称取5mg甘氨胆酸溶于150μl N,N-二甲基甲酰胺，加入2.4μl三正丁胺和1.9μl氯甲酸异丁酯制得A液，在1ml碳酸盐缓冲溶液中加入200μl N,N-二甲基甲酰胺和10mg卵清蛋白制得B液；将A液滴加在B液中，4℃搅拌过夜，第二天把反应液放入透析袋中，用磷酸缓冲盐溶液透析三天，每天换三次透析液，得到包被抗原。
5.根据权利要求1所述的一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法，其特征在于：步骤(4)所述用步骤(2)合成的免疫抗原免疫兔子的过程包括以下几个步骤：选取两只新西兰大白兔，雌性，月龄3个月，体重1.5-2公斤；用新鲜配制的磷酸缓冲盐溶液将步骤(2)所得免疫抗原配制成1mg/ml的免疫抗原溶液，各取1ml免疫抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂，用乳化器进行乳化使其完全混为一相，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2ml；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂与免疫抗原溶液混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2ml，以后每隔两周进行加强免疫一次；加强免疫4次后，于最后一次免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于4℃冰箱过夜，第二天以10000r/min的离心速度，离心分离10min，分离取上清液，得到甘氨胆酸多克隆抗体，于-20℃保存备用。
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