CN113005097A - 一株分泌抗卡马西平单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一株分泌抗卡马西平单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

一株分泌抗卡马西平单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。分泌抗卡马西平单克隆抗体的杂交瘤细胞株DTM，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCC No.19679。由5H‑二苯并[b,f]氮杂卓与戊二酰基二氯反应得到具有羧基的产物为半抗原，与载体蛋白偶联得完全抗原。免疫BALB/c小鼠，PEG法与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选；再经间接竞争酶联免疫法筛选并三次亚克隆，得细胞株DTM。其分泌的单抗，对卡马西平有较好特异性和检测灵敏度(IC50为0.5ng/mL)，实现对猪肉中卡马西平残留量检测，为食品中卡马西平残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株分泌抗卡马西平单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一株分泌抗卡马西平单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属 于食品安全免疫检测领域。
背景技术
卡马西平作为《世界卫生组织基本药物标准清单》和《中国国家基本药物 目录》在列药物，属于广谱抗惊厥药的一种，主要用于治疗癫痫和三叉神经痛 等精神疾病。同时具有治疗心律失常和抗利尿的作用。但随着该类药物的广泛 使用，其毒副作用也日益受到重视。较常见的不良反应有视力模糊或复视、惊 厥，剧烈眩晕或嗜睡，诱发的刺激抗利尿激素释放，可引起水钠潴留。水钠潴 留可造成组织水肿，体重异常增加。同时新版兽药典并未收录卡马西平及其代 谢物，因此检测动物组织中卡马西平及其代谢物异常含量，对打击非法药物添 加和注水具有重要意义。
目前，国内外报道的卡马西平化合物检测主要是通过高效液相色谱法 (HPLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱串联质谱(GC-MS)等。但这些方法的样品 前处理过程复杂，实验周期长，不适合大量样本的快速检测。而国内尚未建立 卡马西平的检测标准及其测定方法，这给卡马西平食品添加剂生产使用和进出 口贸易以及食品卫生监测工作带来很大的困难。基于酶联免疫分析方法 (ELISA)简单、灵敏、快捷和高通量的优点，建立一种高效的卡马西平免疫 学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对卡马西平 的高特异性单克隆单体。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速 的检测方法，然而得到高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提， 其中人工抗原的合成是其中重要的一步。
发明内容
本发明的目的是在于提供一株分泌抗卡马西平单克隆抗体的杂交瘤细胞株 及其应用，并提供一种对应的卡马西平人工抗原的合成方法，由该细胞株制备 的抗体对卡马西平具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立卡马西平的免 疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株分泌抗卡马西平单克隆抗体的杂交瘤细胞株 DTM，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地 址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单 克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCC No.19679。
卡马西平单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCC No.19679的杂交瘤 细胞株DTM分泌产生。
卡马西平半抗原，结构简式如下：
Figure BDA0002980128920000021
卡马西平半抗原的制备方法，合成路线如下：
Figure BDA0002980128920000022
步骤为：将化合物1和戊二酰基二氯溶解在二氯甲烷DCM中，并在冰浴 中冷却；然后将溶于二氯甲烷DCM的三乙醇胺TEA添加到上述混合物中；添 加后，温度逐渐升至室温；将所得反应混合物在真空中浓缩，并通过快速柱色 谱法纯化，得到化合物2；将化合物2溶于DMF中，然后将该溶液加入到H2O 中；通过过滤收集产物，随后用DCM广泛洗涤三次，并在真空下干燥，得到 目标化合物卡马西平半抗原CBZ。
将2.59mmol化合物1和戊二酰基二氯2.85mmol溶解在5mL二氯甲烷DCM 中，并在冰浴中冷却；在30min内将溶于5mL DCM的3.10mmol TEA添加到 混合物中；添加后，温度逐渐升至室温；将反应混合物在真空中浓缩，并通过 快速柱色谱法纯化，得到化合物2；纯化条件为DCM∶MeOH体积比1∶0，逐 渐增加至40∶1；
将化合物2溶于3mL DMF中，然后将该溶液加入到3mL H2O中，将分离 出白色固体；过滤收集产物，随后用DCM广泛洗涤三次，并在真空下干燥， 得到目标化合物卡马西平半抗原CBZ。
卡马西平完全抗原的制备方法：取卡马西平半抗原CBZ，与BSA偶联得 到偶联物完全抗原CBZ-BSA；或与KLH偶联得到偶联物完全抗原CBZ-KLH。
卡马西平完全抗原CBZ-BSA的制备步骤为：
(1)称取CBZ 8.9mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐16.23mg和N-羟基琥珀酰 亚胺8.8mg，用600μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4-6h，称为 A液；按照CBZ与BSA摩尔比为30:1计，称取牛血清蛋白BSA 10mg，加入 等体积硼酸缓冲溶液，称为B液；在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室 温反应过夜，即得偶联物CBZ-BSA混合液；
(2)透析：取8cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水 冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物CBZ-BSA混合液放入透析 袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原CBZ-BSA。
卡马西平完全抗原CBZ-KLH的制备步骤为：
(1)称取6.5mg CBZ，1-乙基碳二亚胺盐酸盐12.5mg，N-羟基琥珀酰亚 胺7.1mg，用500μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4-6h，称为A 液；称取匙孔血蓝蛋白KLH8mg，CBZ与KLH摩尔比为2000:1，加入等体积 硼酸缓冲溶液，称为B液；在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应 过夜，即得偶联物CBZ-KLH混合液；
(2)透析：取8cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水 冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物CBZ-KLH混合液放入透析 袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原CBZ-KLH。
卡马西平的人工抗原的鉴定：
(1)采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。
(2)人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的 浓度，计算其偶联比。
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法， 虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或 相对含量)的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度 与蛋白浓度的比确定偶联比的。
用PBS配制0.5mg/mL的蛋白溶液与完全抗原溶液，以PBS建立基线，在 波长200～500nm间扫描，得到蛋白溶液与完全抗原溶液在半抗原的紫外吸收特 征峰处的吸光值分别为A1，A2；用甲醇配制5～50μg/mL的半抗原即为Xμg/mL， 以甲醇建立基线，在波长200～500nm间扫描，得到半抗原紫外吸收特征峰处的 吸光值A3，半抗原的相对分子质量为M1，蛋白的相对分子质量为M2，则偶联 比＝[(A2-A1)(X/M1)/A3]/(0.5/M2)。
分泌抗卡马西平单克隆抗体的杂交瘤细胞株DTM的制备方法：
(1)小鼠的免疫：将卡马西平完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对 BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)。首次免疫用完全 弗氏佐剂，剂量为80μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为 40μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半 即为20μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之 间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争 酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
(2)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG 4000)法将小鼠脾细 胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基(HAT培养基)筛选出杂交 瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性 细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释 法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按 上述方法进行三次亚克隆后获得卡马西平的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细 胞株DTM；
(3)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
所述卡马西平单克隆抗体的应用，用于食品中卡马西平残留的检测。
进一步地，采用卡马西平单克隆抗体制备卡马西平的免疫检测试剂盒或胶 体金试纸条用于检测。
进一步地，具体用于猪肉或牛奶检测中卡马西平残留的分析检测。
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株DTM分泌的单克隆抗体，对卡 马西平具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.5ng/mL)，由该细胞株制备 的抗体对卡马西平具有较好特异性和检测灵敏度，与其他类似物交叉率很低， 说明该半抗原能够很好的暴露其原结构，可以用来建立卡马西平的免疫学检测 方法，可实现对猪肉、牛奶中卡马西平残留量的检测，为食品中卡马西平残留 的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株分泌抗卡马西平单克隆抗体的杂交瘤细胞株 DTM，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地 址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单 克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCC No.19679。
附图说明
图1半抗原CBZ的NMR鉴定图。
图2半抗原CBZ的LC-MS鉴定图。
图3CBZ-BSA人工抗原的免疫原紫外鉴定图。
图4卡马西平单克隆抗体对卡马西平的标准抑制曲线。
具体实施方式
实施例1半抗原CBZ的合成
合成路线如下：
Figure BDA0002980128920000041
将化合物1(500mg，2.59mmol)和戊二酰基二氯(480.99mg，2.85mmol) 溶解在二氯甲烷(DCM)(5mL)中，并在冰浴中冷却。然后在30min内将溶 于DCM(5mL)的TEA(314.18mg，3.10mmol)添加到混合物中。添加后， 温度逐渐升至室温。薄层色谱TLC显示原料已消耗。将反应混合物在真空中浓 缩，并通过快速柱色谱法纯化(DCM∶MeOH，1∶0，逐渐增加至40∶1)，得 到化合物2。浅黄色固体状氯化物(553mg，1.70mmol，产率65.60％)。
将化合物2(553mg，1.70mmol)溶于DMF(3mL)中。然后将该溶液加入 到H2O(3mL)中。白色固体将分离出来。通过过滤收集产物，随后用DCM广泛 洗涤三次，并在真空下干燥。得到目标化合物(379mg，1.23mmol，产率72.65％)， 为白色固体，即卡马西平半抗原CBZ。
制备所得半抗原CBZ结构通过1H NMR光谱确认，如图1所示：1H NMR (400MHz，MeOD，CBZ)δ7.55–7.32(m 8H)，7.02(d，J＝1.8Hz，2H)， 2.40–2.30(m 1H)，2.26–2.10(m2H)，2.01–1.90(m 1H)，1.82–1.68(m 2H)。 LC-MS鉴定图如图2所示；由图2色谱图可知，保留时间为15.543min。同时， 半抗原CBZ的分子量为m/z 307，从阳离子加钠离子质谱仪获得的半抗原的分 子量为m/z 330，这证实了CBZ已成功获得；其中HR-MS:Calced:C19H17NO3307.1208；Found:330.1096[M+Na+]。
实施例2完全抗原的制备
将实施例1制备的半抗原CBZ，与BSA偶联得到偶联物完全抗原 CBZ-BSA；或与KLH偶联得到偶联物完全抗原CBZ-KLH。
卡马西平完全抗原CBZ-BSA的制备步骤为：
(1)称取CBZ 8.9mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐16.23mg和N-羟基琥珀酰 亚胺8.8mg，用600μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4-6h，称为 A液；按照CBZ与BSA摩尔比为30:1计，称取牛血清蛋白BSA10mg，加入 等体积硼酸缓冲溶液，称为B液；在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室 温反应过夜，即得偶联物CBZ-BSA混合液；
(2)透析：取8cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水 冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物CBZ-BSA混合液放入透析 袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原CBZ-BSA。
卡马西平完全抗原CBZ-KLH的制备步骤为：
(1)称取6.5mg CBZ，1-乙基碳二亚胺盐酸盐12.5mg，N-羟基琥珀酰亚 胺7.1mg，用500μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4-6h，称为A 液；称取匙孔血蓝蛋白KLH8mg，CBZ与KLH摩尔比为2000:1，加入等体积 硼酸缓冲溶液，称为B液；在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应 过夜，即得偶联物CBZ-KLH混合液；
(2)透析：取8cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水 冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物CBZ-KLH混合液放入透析 袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原CBZ-KLH。
CBZ-BSA免疫原的紫外鉴定如图3所示。由图3可知在200-400nm的波 长下，通过UV/Vis光谱对半抗原-蛋白结合物进行了定性分析。从半抗原的 UV-Vis光谱来看，与半抗原和载体蛋白相比，半抗原-蛋白结合物在特征吸收 峰上有明显的变化。载体蛋白在278nm处表现出吸光度，半抗原CBZ在280-285 nm处有一个明显的峰。对于结合物，在270–290处观察到一个宽峰。因此， 完全抗原合成的结果是成功的。
实施例3杂交瘤细胞株DTM的制备
(1)动物免疫：将卡马西平完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对 BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)。首次免疫用完全 弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为 50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半 即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之 间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争 酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。
(2)细胞融合：
在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行 细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入体积浓度75％酒 精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研 磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用 RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体 积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎 牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细 胞数量达到(1-4)×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时， 收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中； 第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基； 第5min和第6min，每30s内滴加1mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴 加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，10min)， 弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20％胎牛血清、2％50×HAT的RPMI-1640选择性培养基(HAT培养基)，按照200μL/孔加到96孔细胞板， 置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融 合细胞进行半换液；第5天用含20％胎牛血清、1％的100×HT的RPMI-1640 过渡培养液(HT培养基)进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分 两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用卡马西平为标准 品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对卡马西平标准品有较 好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。 按上述方法进行三次亚克隆，最终获得卡马西平单克隆抗体细胞株DTM。
实施例4单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每 只小鼠腹腔注射2×106卡马西平杂交瘤细胞DTM，从第七天开始收集腹水，将 腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹 水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度 的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液 (pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
(1)包被：将包被原CBZ-BSA用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL 开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备 用；
(4)加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被 孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗 鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液， 37℃避光反应15min；
(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定 各孔的OD450值。
DTM的单克隆抗体对卡马西平的标准抑制曲线如图4所示；由图4可知标 准曲线方程为：y＝0.13781+1.68601/(1+[x/0.55416]1.34887)，IC50值为0.5ng/mL， LOD值为0.099ng/mL，线性检测范围(IC20–IC80)为0.198–1.549ng/mL。 用ic-ELISA测定单克隆抗体卡马西平的IC50为：0.5ng/mL，对其类似物的交 叉率见表1。说明本发明制备的单克隆抗体对卡马西平有很好的灵敏度，可用 于卡马西平免疫分析检测。
表1卡马西平单克隆抗体与其类似物的交叉反应性
Figure BDA0002980128920000071
Figure BDA0002980128920000081
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少 量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容 至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05％吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4 .12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至 1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混 合即为TMB显色液，现用现混。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。 即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范 畴。

Claims (10)

1.一株分泌抗卡马西平单克隆抗体的杂交瘤细胞株DTM，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCCNo.19679。
2.卡马西平单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.19679的杂交瘤细胞株DTM分泌产生。
3.卡马西平半抗原，其特征在于结构简式如下：
Figure FDA0002980128910000011
4.卡马西平半抗原的制备方法，其特征在于合成路线如下：
Figure FDA0002980128910000012
步骤为：将化合物1和戊二酰基二氯溶解在二氯甲烷DCM中，并在冰浴中冷却；然后将溶于二氯甲烷DCM的三乙醇胺TEA添加到上述混合物中；添加后，温度逐渐升至室温；将所得反应混合物在真空中浓缩，并通过快速柱色谱法纯化，得到化合物2；将化合物2溶于DMF中，然后将该溶液加入到H2O中；通过过滤收集产物，随后用DCM广泛洗涤三次，并在真空下干燥，得到目标化合物卡马西平半抗原CBZ。
5.如权利要求4所述卡马西平半抗原的制备方法，其特征在于步骤为：将2.59mmol化合物1和戊二酰基二氯2.85mmol溶解在5mL二氯甲烷DCM中，并在冰浴中冷却；在30min内将溶于5mL DCM的3.10mmol TEA添加到混合物中；添加后，温度逐渐升至室温；将反应混合物在真空中浓缩，并通过快速柱色谱法纯化，得到化合物2；纯化条件为DCM∶MeOH体积比1∶0，逐渐增加至40∶1；
将化合物2溶于3mL DMF中，然后将该溶液加入到3mL H2O中，将分离出白色固体；过滤收集产物，随后用DCM广泛洗涤三次，并在真空下干燥，得到目标化合物卡马西平半抗原CBZ。
6.卡马西平完全抗原的制备方法，其特征在于：取卡马西平半抗原CBZ，与BSA偶联得到偶联物完全抗原CBZ-BSA；或与KLH偶联得到偶联物完全抗原CBZ-KLH。
7.如权利要求6所述卡马西平完全抗原的制备方法，其特征在于：
卡马西平完全抗原CBZ-BSA的制备步骤为：
(1)称取CBZ 8.9mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐16.23mg和N-羟基琥珀酰亚胺8.8mg，用600μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4-6h，称为A液；按照CBZ与BSA摩尔比为30:1计，称取牛血清蛋白BSA 10mg，加入等体积硼酸缓冲溶液，称为B液；在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物CBZ-BSA混合液；
(2)透析：取8cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物CBZ-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原CBZ-BSA；
卡马西平完全抗原CBZ-KLH的制备步骤为：
(1)称取CBZ 6.5mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐12.5mg，N-羟基琥珀酰亚胺7.1mg，用500μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4-6h，称为A液；称取匙孔血蓝蛋白KLH 8mg，CBZ与KLH摩尔比为2000:1，加入等体积硼酸缓冲溶液，称为B液；在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物CBZ-KLH混合液；
(2)透析：取8cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物CBZ-KLH混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原CBZ-KLH。
8.权利要求2所述卡马西平单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品中卡马西平残留的检测。
9.根据权利要求8所述卡马西平单克隆抗体的应用，其特征在于：采用卡马西平单克隆抗体制备卡马西平的免疫检测试剂盒或胶体金试纸条用于检测。
10.根据权利要求8所述卡马西平单克隆抗体的应用，其特征在于：具体用于猪肉或牛奶检测中卡马西平残留的分析检测。
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