CN107417579B - L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 - Google Patents
L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107417579B CN107417579B CN201710462453.XA CN201710462453A CN107417579B CN 107417579 B CN107417579 B CN 107417579B CN 201710462453 A CN201710462453 A CN 201710462453A CN 107417579 B CN107417579 B CN 107417579B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- arginine
- lauramide
- antigen
- hours
- hapten
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 76
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 229940116335 lauramide Drugs 0.000 title claims abstract description 31
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N EtOH Substances CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 16
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 title claims abstract description 11
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims abstract description 10
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 title claims abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 20
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims abstract description 20
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 10
- XTJKNGLLPGBHHO-HNNXBMFYSA-N (2s)-5-(diaminomethylideneamino)-2-(dodecanoylamino)pentanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N XTJKNGLLPGBHHO-HNNXBMFYSA-N 0.000 claims description 29
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 24
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 19
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 16
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 11
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 10
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 10
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 8
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- NRDQFWXVTPZZAZ-UHFFFAOYSA-N butyl carbonochloridate Chemical compound CCCCOC(Cl)=O NRDQFWXVTPZZAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N tributylamine Chemical compound CCCCN(CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 abstract description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 abstract description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 102100034336 Acyl-coenzyme A synthetase ACSM1, mitochondrial Human genes 0.000 description 38
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 24
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 24
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 19
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 18
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 12
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 7
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 7
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 4
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 4
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 3
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- MUUGCDGGIVCSDT-UHFFFAOYSA-N [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])(=O)=O.CCCCCCCC(O)=O Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])(=O)=O.CCCCCCCC(O)=O MUUGCDGGIVCSDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000005452 food preservative Substances 0.000 description 2
- 235000019249 food preservative Nutrition 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 108010004839 lanatoside 15'-O-acetylesterase Proteins 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- YDGMGEXADBMOMJ-LURJTMIESA-N N(g)-dimethylarginine Chemical compound CN(C)C(\N)=N\CCC[C@H](N)C(O)=O YDGMGEXADBMOMJ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000007630 basic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000447 pesticide residue Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
- C07C279/04—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton
- C07C279/14—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/77—Ovalbumin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明公开了L‑月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯人工抗原、特异抗体制备方法及其用途,属于免疫化学分析技术领域,专用于L‑月桂酰胺精氨酸特异性抗体的制备及酶联免疫检测方法,合成了人工抗原LAS‑BSA和LAS‑OVA,免疫兔子获得L‑月桂酰胺精氨酸的特异性多克隆抗体,最后利用合成的包被抗原和特异性抗体建立酶联免疫分析方法,该方法LAE最低检测限为0.005mg/L,回收率为82.4‑109.8%,平均变异系数为3.2‑5.8%,具有准确度和灵敏度高的特点,符合残留分析标准。
Description
技术领域
本发明属于免疫化学分析技术领域,具体涉及一种新型食品防腐剂L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯的抗原、特异抗体制备方法及用途。
背景技术
L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯(ethyl lauroyl arginate(LAE)),分子式为C20H41ClN4O3,结构如下:
LAE结构
LAE外观为白色粉末,在20℃水中的溶解度为247g/kg,在pH3-7范围内化学性质稳定,具有较高的抑菌活性,熔点50-58℃,它在水和油中的分配系数大于10。即主要存在于水相中,该性质使得LAE与其它化学结构不同功能相似的防腐剂相比,可以更方便地溶解到水基质的食品及化妆品体系中,更好地发挥其抑菌效能。LAE主要作用于微生物的细胞壁、细胞质膜及细胞壁和细胞膜的中间层,抑制微生物增殖。LAE以往主要用于医药、化妆品行业。目前作为一种新型的食品防腐剂得到越来越多的应用。2013年欧洲食品安全局(EFSA)应欧盟委员会的要求对作为食品添加剂的LAE进行了暴露评估,基于不同人群和场景的暴露数据设定LAE每日允许摄入量(ADI)为0.5mg/kg bw/d。
目前对LAE的残留分析有紫外分光光度法、液相色谱串联四级杆飞行时间质谱法,这些方法需要使用大型仪器,检测费用高,过程繁琐,不适合大批量样品的检测与分析。免疫分析为农药残留研究提供了一个新的分析检测途径,以其快速、灵敏、方便、廉价,便于现场监控以及适用大批量样品检测等优点得到了迅速发展。但到目前为止,LAE的免疫分析方法,国内外尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯半抗原。
本发明所要解决的又一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用上述半抗原制备L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯的免疫抗原。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用上述半抗原制备L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯的包被抗原。
本发明所要解决的再一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用上述免疫抗原制备L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯的特异性抗体的制备方法。
本发明所要解决的最后一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种上述特异性抗体的用途。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:该L-月桂酰胺精氨酸半抗原,其结构式如下所示:
其基于月桂酰精氨酸LAS是L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯LAE分子结构中的主要组成部分,并能使该结构特征充分暴露且含有能与蛋白质偶联的羧基,因此将其作为半抗原。
本发明利用碳二亚胺法与牛血清蛋白(BSA)偶联获得免疫抗原LAS-BSA,其分子结构如下:
本发明利用混合酸酐法与卵清蛋白(OVA)偶联获得包被抗原LAS-OVA,其分子结构如下:
本发明还提供一种L-月桂酰胺精氨酸免疫抗原的制备方法,其特征在于包含以下步骤:
①将71.3~142.6mg的月桂酰精氨酸LAS溶解在1~2mL的N,N-二甲基甲酰胺中,加入81.6~163.2mg的N-羟基琥珀酰亚胺和72.9~145.8mg的二环己基碳二亚胺,室温下搅拌反应过夜,离心;
②取步骤1中的上清液0.5~1ml加入到10~20ml的10~20mg/mL牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中,磁力搅拌反应5~6小时,装入透析袋,4℃下先用蒸馏水透析3次,每次间隔2~3小时,然后用磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.01mol/L,pH7.4)透析3~5天,12小时换一次透析液,即得免疫抗原,分装保存于-20℃的冰箱中。
同时,本发明还提供一种L-月桂酰胺精氨酸包被抗原的制备方法,其特征在于包含以下步骤:
①将71.3~142.6mg的月桂酰精氨酸LAS溶解在1~2mL的N,N-二甲基甲酰胺中,加入60~120μL的三正丁胺和30~60μL的氯甲酸丁酯,室温下搅拌反应1~2小时;
②取步骤1中的反应液1~2ml加入到10~20mL的10~20mg/mL卵清蛋白碳酸盐缓冲溶液中,磁力搅拌反应2~4小时,装入透析袋,4℃下先用蒸馏水透析3次,每次间隔2~3小时,然后用磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.01mol/L,pH7.4)透析3~5天,12小时换一次透析液,即得包被抗原,分装保存于-20℃的冰箱中。
本发明用上述免疫抗原制备获得L-月桂酰胺精氨酸特异性抗体,L-月桂酰胺精氨酸特异性抗体是能与L-月桂酰胺精氨酸发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。它用于检测农产品和食品(如乳制品)中L-月桂酰胺精氨酸的残留量。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:1、本发明通过首次利用LAS作为LAE半抗原,经免疫兔子产生特异性抗体,为LAE残留的高效快速分析提供了一种新的方法,同时样品前处理简单快速,避免了大量使用有机溶剂,成本低廉,一次可同时检测大批量样品,便于进行现场监控,可以与传统仪器分析方法互为补充;
2、利用LAE抗原抗体免疫反应和酶促反应建立LAE酶联免疫分析法。在检测分析样品中LAE残留是具有较高的特异性和灵敏度。抗体特异性识别LAE,与其他同类化合物没有明显的交叉反应。该方法LAE最低检测限为0.005mg/L,回收率为82.4-109.8%,平均变异系数为3.2-5.8%,具有准确度和灵敏度高的特点,符合残留分析标准。
具体实施方式
以下通过结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1、人工抗原的合成
基于月桂酰精氨酸(LAS)是LAE分子结构中的主要组成部分,并能使该结构特征充分暴露且含有能与蛋白质偶联的羧基,因此将其作为半抗原。
半抗原的结构如下:
1.1免疫抗原的合成与纯化
免疫抗原的合成采用碳二亚胺法:将71.3mg的月桂酰精氨酸LAS(约0.2mmol)溶解在1mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF中,加入81.6mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS(约0.6mmol),室温下搅拌反应15min后加入72.9mg的二环己基碳二亚胺DCC(0.3mmol),室温下搅拌反应过夜,离心,取上清液0.5mL缓慢加入到10mL10mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中,磁力搅拌反应5小时。将反应完成的溶液装入透析袋,4℃下先用蒸馏水透析3次,每次透析的间隔时间为2小时,然后用0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS透析3天,12小时换一次透析液,即得免疫抗原,分装保存于-20℃的冰箱中。
1.2免疫抗原的鉴定
对半抗原、载体蛋白及偶联物进行紫外(200nm~400nm)扫描。从紫外谱图看到偶联物紫外吸收光谱较载体蛋白和半抗原的吸收光谱发生了明显的变化,具有载体蛋白和半抗原的紫外吸收特征,说明半抗原和载体蛋白偶联成功。根据它们在280nm波长下的摩尔吸光系数估算得到免疫抗原的结合比为15:1。
1.3免疫抗体的制备
①免疫动物制备抗血清
实验选用半周岁左右,体重为2-3公斤,健康的雄性新西兰大白兔。免疫三只兔子,分别编号为兔子1-3。实验免疫剂量基础免疫为0.25~4.0mg/kg,加强免疫剂量为0.5~4.0mg/kg,用生理盐水分别稀释相应剂量人工抗原复合物,加入等体积弗氏完全佐剂,充分乳化,直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。3~4周后进行加强免疫,以后每隔2周再次加强免疫,加强免疫时采用弗氏不完全佐剂。从第三次免疫开始,每次免疫后第8~10天,从兔子耳缘静脉采血,测定效价和特异性。待免疫血清效价合格后,就进行采血。
本实验采用心脏取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后,先待收集在三角烧瓶中的血液凝固后,然后用接种针沿三角烧瓶边缘将血块与玻璃脱离,放置于37℃温箱中半小时,再放到4℃冰箱中3~4小时,待血块收缩后,用吸管将血清吸入试管中,以3000rpm离心15分钟,分离出血清。
②抗体的纯化与鉴定
一般采用辛酸-硫酸铵盐析法,也可采用蛋白A柱层析。辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)以外的蛋白质都沉淀下来,上清液中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同,人血清为70μl/ml,兔血清为75μl/ml,小鼠血清为40μl/ml,小鼠腹水为33μl/ml。这种方法IgG的回收率达90%以上。
③抗血清效价测定
免疫原复合物按常规方法免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始,在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血,血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。待第4次免疫时,兔子获得了高效价的抗体,经纯化制成冻干粉后的效价为5.12×105。
实施例2
2、人工抗原的合成
基于月桂酰精氨酸(LAS)是LAE分子结构中的主要组成部分,并能使该结构特征充分暴露且含有能与蛋白质偶联的羧基,因此将其作为半抗原。
半抗原的结构如下:
2.1免疫抗原的合成与纯化
免疫抗原的合成采用碳二亚胺法:将107.0mg的月桂酰精氨酸LAS(约0.3mmol)溶解在2mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF中,加入122.4mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS(0.9mmol),室温下搅拌反应15min后加入109.4mg的二环己基碳二亚胺DCC(0.45mmol),室温下搅拌反应过夜,离心,取上清液0.8mL缓慢加入到15mL15mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中,磁力搅拌反应5.5小时。将反应完成的溶液装入透析袋,4℃下先用蒸馏水透析3次,每次透析的间隔时间为3小时,然后用0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS透析5天,12小时换一次透析液,即得免疫抗原,分装保存于-20℃的冰箱中。
2.2免疫抗原的鉴定
对半抗原、载体蛋白及偶联物进行紫外(200nm~400nm)扫描。从紫外谱图看到偶联物紫外吸收光谱较载体蛋白和半抗原的吸收光谱发生了明显的变化,具有载体蛋白和半抗原的紫外吸收特征,说明半抗原和载体蛋白偶联成功。根据它们在280nm波长下的摩尔吸光系数估算得到免疫抗原的结合比为17:1。
2.3免疫抗体的制备同实施例1
经纯化制成冻干粉后的效价为5.12×105。
实施例3
3、人工抗原的合成
基于月桂酰精氨酸(LAS)是LAE分子结构中的主要组成部分,并能使该结构特征充分暴露且含有能与蛋白质偶联的羧基,因此将其作为半抗原。
3.1免疫抗原的合成与纯化
免疫抗原的合成采用碳二亚胺法:将142.6mg的月桂酰精氨酸LAS(约0.4mmol)溶解在1.5mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF中,加入163.2mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS(1.2mmol),室温下搅拌反应15min后加入145.8mg的二环己基碳二亚胺DCC(0.6mmol),室温下搅拌反应过夜,离心,取上清液1mL缓慢加入到20mL 20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中,磁力搅拌反应6小时。将反应完成的溶液装入透析袋,4℃下先用蒸馏水透析3次,每次透析的间隔时间为2.5小时,然后用磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.01mol/L,pH7.4)透析4天,12小时换一次透析液,即得免疫抗原,分装保存于-20℃的冰箱中。
3.2免疫抗原的鉴定
对半抗原、载体蛋白及偶联物进行紫外(200nm~400nm)扫描。从紫外谱图看到偶联物紫外吸收光谱较载体蛋白和半抗原的吸收光谱发生了明显的变化,具有载体蛋白和半抗原的紫外吸收特征,说明半抗原和载体蛋白偶联成功。根据它们在280nm波长下的摩尔吸光系数估算得到免疫抗原的结合比为14:1。
3.3免疫抗体的制备同实施例2
经纯化制成冻干粉后的效价为2.56×105。
实施例4
4、人工抗原的合成
基于月桂酰精氨酸(LAS)是LAE分子结构中的主要组成部分,并能使该结构特征充分暴露且含有能与蛋白质偶联的羧基,因此将其作为半抗原。
半抗原的结构如下:
4.1包被抗原的合成与纯化
包被抗原的合成利用混合酸酐法:将71.3mg的月桂酰精氨酸LAS(约0.2mmol)溶解在1mL的N,N-二甲基甲酰胺中,加入60μL的三正丁胺(约0.2mmol)和30μL的氯甲酸丁酯(约0.2mmol),室温下反应1小时,1mL反应液缓慢加入到10mL 10mg/mL的卵清蛋白碳酸盐缓冲溶液中,磁力搅拌反应4小时,反应完成后装入透析袋,4℃下先用蒸馏水透析3次,每次透析的间隔时间为2小时,然后用磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.01mol/L,pH7.4)透析3天,12小时换一次透析液,即得包被抗原,分装保存于-20℃的冰箱中。
4.2人工抗原的鉴定
对半抗原、载体蛋白及偶联物进行紫外(200nm~400nm)扫描。从紫外谱图看到偶联物紫外吸收光谱较载体蛋白和半抗原的吸收光谱发生了明显的变化,具有载体蛋白和半抗原的紫外吸收特征,说明半抗原和载体蛋白偶联成功。根据它们在280nm波长下的摩尔吸光系数估算得到包被抗原的结合比为9:1。
实施例5
5、人工抗原的合成
基于月桂酰精氨酸(LAS)是LAE分子结构中的主要组成部分,并能使该结构特征充分暴露且含有能与蛋白质偶联的羧基,因此将其作为半抗原。
半抗原的结构如下:
5.1包被抗原的合成与纯化
包被抗原的合成利用混合酸酐法:将107.0mg的月桂酰精氨酸LAS(约0.3mmol)溶解在1.5mL的N,N-二甲基甲酰胺中,加入90μL的三正丁胺(约0.3mmol)和45μL的氯甲酸丁酯(约0.3mmol),室温下反应1.5小时,1.5mL反应液缓慢加入到15mL 15mg/mL的卵清蛋白碳酸盐缓冲溶液中,磁力搅拌反应4小时,反应完成后装入透析袋,4℃下先用蒸馏水透析3次,每次透析的间隔时间为3小时,然后用磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.01mol/L,pH7.4)透析5天,12小时换一次透析液,即得包被抗原,分装保存于-20℃的冰箱中。
5.2人工抗原的鉴定
对半抗原、载体蛋白及偶联物进行紫外(200nm~400nm)扫描。从紫外谱图看到偶联物紫外吸收光谱较载体蛋白和半抗原的吸收光谱发生了明显的变化,具有载体蛋白和半抗原的紫外吸收特征,说明半抗原和载体蛋白偶联成功。根据它们在280nm波长下的摩尔吸光系数估算得到包被抗原的结合比为8:1。
实施例6
6、人工抗原的合成
基于月桂酰精氨酸(LAS)是LAE分子结构中的主要组成部分,并能使该结构特征充分暴露且含有能与蛋白质偶联的羧基,因此将其作为半抗原。
半抗原的结构如下:
6.1包被抗原的合成与纯化
包被抗原的合成利用混合酸酐法:将142.6mg的月桂酰精氨酸LAS(约0.4mmol)溶解在2mL的N,N-二甲基甲酰胺中,加入120μL的三正丁胺(约0.4mmol)和60μL的氯甲酸丁酯(约0.4mmol),室温下反应2小时,2mL反应液缓慢加入到20mL20mg/mL的卵清蛋白碳酸盐缓冲溶液中,磁力搅拌反应4小时,反应完成后装入透析袋,4℃下先用蒸馏水透析3次,每次透析的间隔时间为2.5小时,然后用磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.01mol/L,pH7.4)透析4天,12小时换一次透析液,即得包被抗原,分装保存于-20℃的冰箱中。
6.2人工抗原的鉴定
对半抗原、载体蛋白及偶联物进行紫外(200nm~400nm)扫描。从紫外谱图看到偶联物紫外吸收光谱较载体蛋白和半抗原的吸收光谱发生了明显的变化,具有载体蛋白和半抗原的紫外吸收特征,说明半抗原和载体蛋白偶联成功。根据它们在280nm波长下的摩尔吸光系数估算得到包被抗原的结合比为11:1。
实施例7利用包被抗原对LAE的残留分析
其中,LAE酶联免疫吸附测定方法建立与鉴定如下:
7.1 LAE ELISA测定方法的原理
采用间接竞争酶联免疫分析方法。它是将农药分子与大分子载体(如蛋白质)偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体(96孔酶标板)上,制备成固相抗原,然后加入待测农药和相应抗体,固相抗原中的农药,待测农药,与抗体进行竞争结合反应,待测农药含量多,被结合在固相抗原上的抗体就少,反之结合在固相抗原的抗体多,反应后加入酶标二抗(只能与结合在固相抗原上的抗体相结合),最后用底物进行显色加以测定,当抗体量一定时,加入的待测农药量越多,与固相抗原结合的抗体就越少,显色反应就减弱,抑制率增高,反之,则显色反应增强,抑制率降低,因而可根据已知量农药的标准线和待检样品的抑制率,推算出待测农药的浓度。
7.2最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度的确定
IC-ELISA抗原抗体工作浓度的确定用方阵滴定法,选择OD值为1.0时的抗原抗体稀释浓度。在同一包被液浓度下,随着抗体的稀释,所得OD值呈下降趋势,同样在同一抗体稀释浓度下,随着包被液浓度的下降,所得OD值也呈下降趋势。经试验,包被抗原浓度1.0μg/mL,抗体浓度以20μg/mL作为最适工作浓度。
7.3标准曲线和检测灵敏度
7.3.1标准曲线的制备,其基本的操作步骤如下:
7.3.1.1包被
用CBS缓冲液(0.05mol/L,pH9.6)将包被抗原稀释至最适浓度,100μL/孔加入96孔酶标版(MaxisorpTM透明聚乙烯板),4℃包被过夜;
7.3.1.2封闭
取出包被好的酶标版,甩掉包被液,用0.5%吐温-20的磷酸盐缓冲溶液(PBST,0.01mol/L,0.5%Tween20,pH7.4)洗涤后,每孔加入用PBS(0.01mol/L,pH7.4)缓冲溶液稀释的1.0%的OVA封闭液200μL,于37℃温箱中温育0.5h。
7.3.1.3加样
1)配制LAE的标准溶液
取LAE标样配制100ppm的标准溶液,用PBS稀释成若干(5~8)个浓度,使每个浓度溶液中含有10%的甲醇。
2)LAE抗体稀释液的配制
从冰箱中取出抗体,用PBS稀释成工作浓度。
3)点板
取出经封闭的酶标板,经200μl PBST洗涤5次后,每孔加入系列浓度的LAE标准液50μL,再加入抗体稀释液50μL,对照孔加入含10%甲醇的PBS 50μL和抗体稀释液50μL。放入37℃温箱中温育1h,弃去孔内液体,用300μl PBST溶液洗涤5次,拍干。
7.3.1.4加酶标二抗
每孔加入经1∶2000稀释的羊抗兔辣根过氧化物酶PBS溶液100μL,放入37℃温箱中1h,弃去孔内液体,用200μl PBST溶液洗涤5次,拍干。
7.3.1.5显色
每孔加入四甲基联苯胺(TMB)-过氧化氢尿素溶液100μL,37℃温箱中温育15min,用50μL 2mol/L H2SO4终止反应。在酶联仪上测定490nm波长下的吸光值。根据抑制率与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。
式中:ODmax为不加药时的吸光值,ODx为农药x时的吸光值,ODmin为空白对照孔的吸光值。
由上述公式计算得LAE各浓度的抑制率,以LAE浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图。LAE的抑制中浓度(IC50)为1.16mg/L,最低检测限(以IC10表示)为0.005mg/L,LAE在0.005ppm~10ppm范围内,抑制率与LAE浓度呈线性关系,相关系数为r=0.9964。
7.4抗体的特异性
抗体的特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应活性作为评价的重要标准。交叉反应越小,抗体的特异性则越好。将LAE及其类似物做系列稀释,分别与同一种抗体竞争反应,按照7.3的方法制作标准曲线,并在曲线上找出抑制率50%的剂量和类似物抑制率50%时的用量,然后计算出类似物的交叉反应率。抗体对非对称二甲基精氨酸的交叉反应率小于1%,从而可知,所制备的抗体特异性强,可以用于LAE的分析。
Claims (6)
3.一种如权利要求1所述L-月桂酰胺精氨酸免疫抗原的制备方法,其特征在于包含以下步骤:
①将71.3~142.6mg的月桂酰精氨酸LAS溶解在1~2mL的N,N-二甲基甲酰胺中,依次加入81.6~163.2mg的N-羟基琥珀酰亚胺和72.9~145.8mg的二环己 基碳二亚胺,室温下搅拌反应过夜,离心;
②取步骤1中的上清液0.5~1ml加入到10~20ml,10~20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中,磁力搅拌反应5~6小时,装入透析袋,4℃下先用蒸馏水透析3次,每次间隔2~3小时,然后用磷酸盐缓冲溶液透析3~5天,12小时换一次透析液,即得免疫抗原,分装保存于-20℃的冰箱中。
4.一种如权利要求2所述L-月桂酰胺精氨酸包被抗原的制备方法,其特征在于包含以下步骤:
①将71.3~142.6mg的月桂酰精氨酸LAS溶解在1~2mL的N,N-二甲基甲酰胺中,加入60~120μL的三正丁胺和30~60μL的氯甲酸丁酯,室温下搅拌反应1~2小时;
②取步骤1中的反应液1~2ml加入到10~20mL,10~20mg/mL的卵清蛋白碳酸盐缓冲溶液中,磁力搅拌反应2~4小时,装入透析袋,4℃下先用蒸馏水透析3次,每次间隔2~3小时,然后用磷酸盐缓冲溶液透析3~5天,12小时换一次透析液,即得包被抗原,分装保存于-20℃的冰箱中。
5.一种用权利要求3所述L-月桂酰胺精氨酸免疫抗原制备的L-月桂酰胺精氨酸特异性抗体。
6.一种用权利要求5中所述的L-月桂酰胺精氨酸特异性抗体在检测乳制品中L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯残留量中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710462453.XA CN107417579B (zh) | 2017-06-19 | 2017-06-19 | L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710462453.XA CN107417579B (zh) | 2017-06-19 | 2017-06-19 | L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107417579A CN107417579A (zh) | 2017-12-01 |
CN107417579B true CN107417579B (zh) | 2022-07-19 |
Family
ID=60429016
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710462453.XA Active CN107417579B (zh) | 2017-06-19 | 2017-06-19 | L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107417579B (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1389195A (zh) * | 2001-06-06 | 2003-01-08 | 味之素株式会社 | 新型化妆料组合物 |
CN101046474A (zh) * | 2006-03-30 | 2007-10-03 | 中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所 | 一种检测喹噁啉类药物残留的酶联免疫试剂盒 |
CN103613563A (zh) * | 2013-12-11 | 2014-03-05 | 南京农业大学 | 苯噻菌酯半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101314618A (zh) * | 2008-06-30 | 2008-12-03 | 南京农业大学 | 芳基-n-甲基氨基甲酸酯类农药残留免疫检测方法 |
CN101343325A (zh) * | 2008-08-21 | 2009-01-14 | 上海交通大学 | 可检测多种有机磷农药残留的抗体制备方法 |
CN104387431A (zh) * | 2014-10-24 | 2015-03-04 | 江南大学 | 一种高特异性的利巴韦林人工抗原的制备方法 |
-
2017
- 2017-06-19 CN CN201710462453.XA patent/CN107417579B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1389195A (zh) * | 2001-06-06 | 2003-01-08 | 味之素株式会社 | 新型化妆料组合物 |
CN101046474A (zh) * | 2006-03-30 | 2007-10-03 | 中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所 | 一种检测喹噁啉类药物残留的酶联免疫试剂盒 |
CN103613563A (zh) * | 2013-12-11 | 2014-03-05 | 南京农业大学 | 苯噻菌酯半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
精恶唑禾草灵酶联免疫吸附分析方法研究;王俊东等;《分析化学》;20090131;第37卷(第1期);82-86 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107417579A (zh) | 2017-12-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Huang et al. | Preparation of high-affinity rabbit monoclonal antibodies for ciprofloxacin and development of an indirect competitive ELISA for residues in milk | |
Campbell et al. | Detection and quantitation of chloramphenicol by competitive enzyme-linked immunoassay | |
CN113717949B (zh) | 一株分泌酮康唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
CN105277423A (zh) | 一种用于呕吐毒素富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用 | |
CN109239368A (zh) | 测定孕酮的方法及试剂盒 | |
CN107417579B (zh) | L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 | |
CN111334479A (zh) | 一株氯羟吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株tyl及其应用 | |
CN114058594B (zh) | 一种分泌维生素a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
CN110927382A (zh) | 一种检测喹乙醇的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其应用 | |
CN110713986A (zh) | 一株维生素b1单克隆抗体杂交瘤细胞株cbdd及其应用 | |
CN113582923B (zh) | 一种喹哪啶半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用 | |
WO2018103630A1 (zh) | 一株分泌抗巴龙霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株c1及其应用 | |
CN111499637B (zh) | 一种育亨宾半抗原yha、人工抗原和其抗体及其制备和应用 | |
CN111377888B (zh) | 一种闹羊花毒素iii半抗原及其制备方法与应用 | |
CN114716535A (zh) | 一种展青霉素人工抗原合成方法及其单克隆抗体的制备和应用 | |
CN110894208B (zh) | 一种黄体酮半抗原、人工抗原和多克隆抗体及其制备方法和应用 | |
CN114014774A (zh) | 一种氟胺酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 | |
CN110616193B (zh) | 一株分泌抗甜蜜素单克隆抗体的杂交瘤细胞株bcb及其应用 | |
CN110117286B (zh) | 一种杂环胺8-MeIQx半抗原、抗体及其制备方法和应用 | |
CN110927376A (zh) | 一种喹乙醇的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用 | |
CN112011516A (zh) | 一株西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
CN111548309A (zh) | 一种抑霉唑半抗原ym-a、人工抗原、重链抗体及其制备方法和应用 | |
JP2007106696A (ja) | 抗ケルセチンモノクローナル抗体、その産生細胞、ケルセチンの検出方法および検出試薬 | |
CN113717948B (zh) | 一株分泌抗菌核净单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
CN115215811B (zh) | 丙硫菌唑半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |