CN116381244A - 降低基质效应的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫检测领域,特别涉及降低基质效应的方法。本发明提供了在光激化学发光检测系统降低基质效应的方法,通过添加血清,能够提高试剂对于不同待测样本类型的干扰,另一方面对于实验室室间质评,第三方质控品等的检测基质效应也能起到很好的消除效果。
Description
本申请要求于2021年12月31日提交中国专利局、申请号为
202111680238.X、发明名称为“降低基质效应的方法”的中国专利申请的优先权,其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及检测领域,特别涉及降低基质效应的方法。
背景技术
光激化学发光的基础原理是一种均相免疫反应。它是基于两种微粒表面包被的抗原或抗体,在液相中形成免疫复合物而将两种微粒拉近。在激光的激发下,发生微粒之间的离子氧的转移,进而产生高能级的红光,通过单光子计数器和数学拟合将光子数换算为靶分子浓度。而当样本不含靶分子时,两种微粒间无法形成免疫复合物,两种微粒的间距超出离子氧传播范围,离子氧在液相中迅速淬灭,检测时则无高能级红光产生。这种反应模式描述在中国发明专利108051585号中,其相关公开内容通过引用并入本文。
基质效应是指“样本中除分析物以外,所有其他成份所介导的分析误差”,影响分析物定量测定的准确性。“基质效应”是一个很广泛的概念,它几乎存在于所有样本中,当你想要测定样本中任何一个分析物时,都不可避免地要受到“周围物质”的影响。按RobertRej的观察,基质效应是来自于生物标本中未知的或性质不明的物质或特性(Properties,如黏度,表面张力,蒸汽压,pH)所引起干扰。
因此,提供在光激化学发光定量检测系统降低基质效应的方法,具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了降低基质效应的方法。在使用了抗基质血清后,基质效应明显降低。进一步优化反应模式后,基质效应也明显降低。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
第一方面,本发明提供了血清在降低光激化学发光检测中基质效应的应用。
第二方面,本发明提供了降低光激化学发光检测中基质效应的检测试剂,包括R1试剂、R2试剂和/或R3试剂;
所述R1试剂包括能与单线态氧反应生成可检测信号的受体以及与之结合的第一对应物,所述第一对应物能与待测靶分子特异性反应;
所述R2试剂包括与待测靶分子特异性反应的第二对应物;
所述R3试剂包括稀释液;
所述第一对应物与所述第二对应物可以相同,也可以不相同;
所述检测试剂还包括血清;
所述血清的加入方式包括:
加入待测样本中,不加入所述R1试剂、所述R2试剂或所述R3试剂中;或
加入待测样本和所述R1试剂中,不加入所述R2试剂或所述R3试剂中;或
加入待测样本和所述R2试剂中,不加入所述R1试剂或所述R3试剂中;或
加入待测样本和所述R3试剂中,不加入所述R1试剂或所述R2试剂中;或
加入待测样本、所述R1试剂和所述R2试剂中,不加入所述R3试剂中;或
加入待测样本、所述R1试剂和所述R3试剂中,不加入所述R2试剂中;或
加入待测样本、所述R2试剂和所述R3试剂中,不加入所述R1试剂中;或
加入待测样本、所述R1试剂、所述R2试剂和所述R3试剂中;或
加入所述R1试剂中,不加入待测样本、所述R2试剂或所述R3试剂中;或
加入所述R2试剂中,不加入待测样本、所述R1试剂或所述R3试剂中;或
加入所述R3试剂中,不加入待测样本、所述R1试剂或所述R2试剂中;或
加入所述R1试剂和所述R2试剂中,不加入所述待测样本或所述R3试剂中;或
加入所述R1试剂和所述R3试剂中,不加入待测样本或所述R2试剂中;或
加入所述R2试剂和所述R3试剂中,不加入待测样本或所述R1试剂中;或
加入所述R1试剂、所述R2试剂和所述R3试剂中,不加入待测样本中。
在本发明的一些具体实施方案中,所述R1试剂包括发光微球包被的与待测靶分子特异性反应的第一抗体;所述R2试剂包括生物素标记的与待测样本特异性反应的第二抗体;所述第一抗体和第二抗体可以相同,也可以不相同。
在本发明的一些具体实施方案中,所述血清包括动物血清;
所述动物血清包括胎牛血清、小牛血清、成牛血清、马血清、羊血清、鸡血清、兔血清或合成血清替代品中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中,所述血清包括马血清。
在本发明的一些具体实施方案中,所述血清包括经过滤或灭活,去除杂质沉淀、杀灭病毒后的血清。
在本发明的一些具体实施方案中,所述血清的浓度包括1%~80%。
在本发明的一些具体实施方案中,所述血清的浓度包括10%~40%。
在本发明的一些具体实施方案中,所述血清的pH包括5~10。
在本发明的一些具体实施方案中,所述血清的pH包括但不限于6~8。
在本发明的一些具体实施方案中,所述pH通过缓冲物维持,所述缓冲物包括磷酸盐、碳酸盐、硼酸盐、tris、MES、HEPES、ACES、MOPS中的一种或多种的组合。
在本发明的一些实施例中,在CA199试剂盒中不同的血清均有一定抗基质效应的作用,其中马血清效果最好,且加在试剂R3中的结果更接近参比厂家。
在本发明的一些实施例中,AFP-R2试剂中,加入的马血清浓度在10%-40%、pH为6.0-8.0的试剂缓冲液效果更好,与参比厂家结果偏差在5%以内。其中,缓冲液3(包括:0.1M PBS、1% BSA、150mM NaCl、20%马血清,pH7.4)的效果最优。
在本发明的一些实施例中,使用AFP-R2试剂的缓冲液(包括:0.1M PBS、1%BSA、150mM NaCl、20%马血清,pH7.4),通过样本和试剂的加样量组合,可以降低室间质评的测定结果,降低基质效应。其中,模式3(待测样本加血清5ul、试剂R1加血清50ul和试剂R2加血清50ul)的效果更优。
在本发明的一些具体实施方案中,所述待测样本包括但不限于体液;
作为优选,所述待测样本包括但不限于全血、血清、血浆、尿液中的一种或多种。
第三方面,本发明还提供了所述检测试剂在制备降低光激化学发光检测中基质效应的试剂盒、检测系统或检测装置中的应用。
第四方面,本发明还提供了降低光激化学发光检测中基质效应的试剂盒,包括所述检测试剂,以及可接受的辅料、助剂或载体。
作为优选,所述可接受的辅料包括但不限于稳定剂、表面活性剂、抗凝剂、防腐剂中的一种或多种;和/或
作为优选,所述稳定剂包括但不限于甘油、蔗糖、海藻糖或葡聚糖中的一种或多种;和/或
作为优选,所述表面活性剂包括但不限于吐温20、吐温80或曲拉通中的一种或多种;和/或
作为优选,所述抗凝剂包括但不限于EDTA或肝素中的一种或多种;和/或
作为优选,所述防腐剂包括但不限于硫酸庆大霉素、叠氮钠、硫柳汞或procolin300中的一种或多种。
第五方面,本发明还提供了降低光激化学发光检测中基质效应的方法,取待测样本与所述检测试剂或所述试剂盒中的检测试剂混合,检测。
第六方面,本发明还提供了检测系统,包括所述检测试剂或所述检测试剂盒,以及可接受的模块。
第七方面,本发明还提供了检测装置,包括所述检测试剂、所述检测试剂盒或所述检测系统,以及可接受的部件。
本发明的有益效果包括但不限于:
本发明提供一种在检测特别是光激化学发光定量检测系统降低基质效应的方法,在使用了抗基质血清后,基质效应明显降低。进一步优化了反应模式后,基质效应也明显降低。能够提高试剂对于不同检测样本类型的干扰,包括但不限于全血、血清、血浆、尿液等。另一方面对于实验室室间质评,第三方质控品等的检测基质效应也能消除。
具体实施方式
本发明公开了降低基质效应的方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
在提供了数值范围的情况下,应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中,并且也涵盖在本发明内,服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下,排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义,本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用,但是现在描述了优选的方法和材料。
术语
本发明所述用语“待测样本”是指可能含有被分析物的一种混合物,被分析物包括但不限于蛋白质、激素、抗体或抗原。可以被用在本发明公开的方法中的典型待测样本包括体液,如血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、唾液、滑液和肺气肿积液等。待测样本可以是在使用前根据需要利用稀释液或缓冲溶液对可能含有被分析物的样本进行稀释后的溶液。例如,为了避免HOOK效应,可以在上机检测前使用样本稀释液将被分析物进行稀释后再在检测仪器上进行检测,此时可能含有被分析物的稀释后的溶液均统称为待测样本。
本发明所述用语“血清”是指血液凝固后,在血浆中除去纤维蛋白原及某些凝血因子后分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白原已被除去的血浆。其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和生长因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。本发明中,血清包括胎牛血清、透析型胎牛血清、天然低IGG胎牛血清、干细胞培养胎牛血清、特殊用途胎牛血清、活性炭/葡萄糖处理胎牛血清、胎牛血清替代物、小牛血清、新生牛血清、加强型小牛血清、补铁小牛血清、成牛血清、供体马血清、兔血清、鸡血清、猪血清、马血清、其他动物血清、合成血清替代品中的一种或多种。在一些实施例中,血清包括胎牛血清、小牛血清、成牛血清、马血清、羊血清、鸡血清、兔血清或合成血清替代品中的一种或多种。作为优选,血清包括马血清。
本发明所述用语“抗体”以最广含义使用,包括任何同种型的抗体,保留对抗原的特异性结合的抗体片段,包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。所述抗体能够与待测抗原特异性结合。
在本发明中,第一抗体与第二抗体可以相同,也可以不同。凡是本领域公知的抗体,均在本发明的保护范围之内。
本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答,并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合,发生免疫效应的物质。
本发明所述用语“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或者T细胞受体的任何蛋白决定簇。在本发明的一些具体实施例中,表位是抗原表面能够被抗体特异性集合的区域。表位决定簇通常可以包括分子的化学活性表面基团,例如但不限于:氨基酸、糖侧链、磷酰基和/或磺酰基。在本发明的其他一些具体实施例中,表位可以具体特定三位结构特征以及特定电荷特征。
本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用,包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。
本发明所述用语“特异性结合”,是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应,从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。
本发明所述用语“生物素”广泛存在于动植物组织中,其分子上有两个环状结构,分别为咪唑酮环和噻吩环,其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下,与已知的几乎所有生物大分子偶联,包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等;而“链霉亲和素”是由链霉菌分泌的一种蛋白质,分子量为65kD。“链霉亲和素”分子由4条相同的肽链组成,其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子,从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。在任何需要的情况下,本发明中所用任何试剂,包括抗原、抗体、受体或供体,可以根据实际需要缀合生物素-链霉亲和素特异性结合配对成员中的任一员。
光激化学发光法的基本原理:
光激化学发光法的基本原理是本领域技术人员所熟知的。常规的做法是通过感光微粒和发光微粒在一定范围内结合,产生离子氧能量的传递,发出光信号,从而对待测样本进行检测。其中,感光微粒内部填充有感光化合物,而发光微粒内部填充有发光化合物和镧系元素。在红色激光(600~700nm)的激发下,感光微粒释放出高能态的单线态氧离子(4μS),其传播距离约为200nm。当感光微粒和发光微粒的距离足够接近时,感光微粒释放的单线态氧离子能到达发光微粒,并通过一系列的化学反应,发射出520~620nm高能级的光,而被仪器检测到。
本发明所述用语“受体”是指能够与单线态氧反应可以产生可检测信号的物质。供体被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的单线态氧,该高能态的单线态氧被近距离的受体俘获,从而传递能量以激活所述受体。在本发明的一些具体实施例中,所述受体是这样的物质,其经历与单线态氧的化学反应以形成不稳定的亚稳态中间体,所述亚稳态中间体可以分解,同时或随后发光。这些物质的典型例子包括但不限于:烯醇醚、烯胺、9-烷叉黄原胶、9-烷叉-N-烷基吖啶满、芳乙烯醚、双环氧乙烯、二甲基噻吩、芳香性咪唑或光泽精。在本发明的另一些具体实施例中,所述受体是能够与单线态氧反应以形成可以分解成酮类或羧酸衍生物的氢过氧化物或二氧环丁烷的烯烃类;可以通过光的作用分解的稳定二氧环丁烷;可以与单线态氧反应以形成二酮类的乙炔类;可以形成偶氮化合物或偶氮羰基化合物的腙类或酰肼类,诸如鲁米诺;和可以形成内过氧化物类的芳族化合物。可以根据本公开和要求保护的发明利用的受体的具体的、非限制性实例记载于美国专利号US5340716(该专利文献在此全文引为参考)。在本发明另一些具体实施例中,所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物,其是非粒子化的并且在含水介质中可溶,这种受体的情况可参见专利PCT/US2010/025433(该专利文献在此全文引为参考)。
在光激化学发光系统中,除了供体试剂外,根据检测对象或检测方法的需要,还包括其他试剂,例如:受体试剂、包被生物素的二抗、稀释液等。在体外诊断领域,尤其是免疫分析领域,各个厂家为了简化商品试剂盒中不同成分的命名,通常都会将试剂盒中不同瓶子的组分标记或简称为试剂1、试剂R1或R1试剂,试剂2、试剂R2或R2试剂,试剂3、试剂R3或R3试剂,……,以此类推,这样便于客户识别、组装和使用,也出于技术保密的目的。因此,不同体外诊断厂家的试剂盒产品可能都会含有试剂1、试剂2、试剂3、……,但是不同厂家对应的各试剂组分却各不相同。
在本发明中,R1试剂包括发光微球包被的与待测样本特异性反应的抗体;R2试剂包括生物素标记的与待测样本特异性反应的另一抗体;抗体与另一抗体识别的抗原表位相同或不相同。R3试剂包括稀释液。
本发明技术方案包括:
本发明提供一种在光激化学发光定量检测系统降低基质效应的方法。能够提高试剂对于不同检测样本类型的干扰,包括但不限于全血、血清、血浆、尿液等。另一方面对于实验室室间质评,第三方质控品等的检测基质效应也能消除。
在试剂中加入一种抗基质血清,如动物血清,包括但不限于胎牛血清、小牛血清、成牛血清、马血清、羊血清、鸡血清、兔血清等,也可以是合成血清替代品;优选马血清,优选条件为处理过的马血清包括过滤、灭活等方法,其目的可以是去除杂质沉淀、杀灭病毒等作用,通常浓度为1%-80%,优选浓度为10%-40%,通常pH大约在5-10,优选pH条件调整为6.0-8.0。可以使用各种缓冲液维持期望的pH,包括磷酸盐、碳酸盐、硼酸盐、tris、MES、HEPES、ACES、MOPS等,所选缓冲液并不重要,但在个别分析中可优选一种或另一种缓冲液。
通常试剂由R1和R2组成,R1试剂通常是能与单线态氧反应生成可检测信号的受体以及与之结合的对应物,该对应物能与样本特异性反应,在下面的实施例中为发光微球包被的与待测样本特异性反应的抗体,试剂R2包含与受体特异性反应的另一对应物,在下面的实施例中为生物素标记的与待测样本特异性反应的另一抗体。有些试剂还可以有R3,该试剂可以有稀释等多种作用。
上述抗基质血清可以选择性加入试剂R1、R2、R3中,因上述对应物在不同项目上敏感性可能不同,在特定的分析中可以选择性加入一种或两种或三种试剂组分中。
上述试剂中还可以加入多种辅助物料。例如添加试剂稳定剂,如甘油、蔗糖、海藻糖、葡聚糖等。在某些实施例中还可以加入表面活性剂,如吐温20、吐温80、曲那通等,这些试剂在本领域是公知的,如EDTA、肝素等。另外试剂还包括一种或多种常用的防腐剂,如硫酸庆大霉素、叠氮钠、硫柳汞、procolin300等。如果使用以上试剂,一种或多种组合及浓度都是可以根据试剂调整的。
实验结果表明,在使用了抗基质血清后,基质效应明显降低。进一步,在优化了反应模式后,基质效应也明显降低。
本发明提供的降低基质效应的方法中,所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1试剂中加入不同的血清
在CA199试剂盒的不同试剂中加入不同血清进行测试,实验组列表如下:
表1
表2反应模式
结果:
表3
结论:
从上述实验结果发现,CA199项目不同的血清均有一定抗基质效应的作用,其中马血清效果最好,且加在试剂R3中的结果更接近参比厂家。
实施例2AFP-R2试剂缓冲液组分的优化
马血清预处理:取马血清,56℃水浴灭活30min,待用。
配制AFP-R2试剂缓冲液:
表4
PBS | BSA | NaCl | 马血清 | pH | |
缓冲液1 | 0.1M | 1% | 150mM | 无 | 7.4 |
缓冲液2 | 0.1M | 1% | 150mM | 5% | 7.4 |
缓冲液3 | 0.1M | 1% | 150mM | 20% | 7.4 |
缓冲液4 | 0.1M | 1% | 150mM | 50% | 7.4 |
缓冲液5 | 0.1M | 1% | 150mM | 20% | 5.0 |
缓冲液6 | 0.1M | 1% | 150mM | 20% | 9.0 |
配制AFP-R2试剂:使用上述缓冲液配制试剂,加入生物素标记的AFP抗体。
表5反应模式
室间质评的测定:按照说明书复溶室间质评,然后用配制的AFP试剂测定。
第三方质控的测定:选择购买伯乐质控,按照厂家说明书复溶,然后用配制的AFP试剂以及参比厂家的试剂同步进行测定,分别得到测值后计算配置试剂与参比厂家试剂测值的偏差。在AFP的免疫检测试剂方面,参比厂家的试剂是行业内公认检测效果排行靠前的,因此与其测值的偏差越小则判定试剂的性能越好。
表6不同缓冲液室间质评测定结果
表7不同缓冲液伯乐质控测定结果
从表6和表7看出,优选的条件是缓冲液3;加入的马血清浓度在10%~40%、pH为6.0~8.0的试剂缓冲液效果更好,与参比厂家结果偏差在5%以内。
实施例3AFP反应模式的设计
本实施例根据本公开要求保护的优化仪器及试剂组成来改进基质效应的方法。
使用实施例2中的缓冲液3,进行不同反应模式的测试。
反应模式如下:
表8
表9不同反应模式室间质评的测定结果
不同反应模式结果显示,通过样本和试剂的不同加入量反应模式组合,可以降低室间质评的测定结果偏差,降低基质效应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.血清在降低光激化学发光检测中基质效应的应用。
2.降低光激化学发光检测中基质效应的检测试剂,其特征在于,包括R1试剂、R2试剂和/或R3试剂;
所述R1试剂包括能与单线态氧反应生成可检测信号的受体以及与之结合的第一对应物,所述第一对应物能与待测靶分子特异性反应;
所述R2试剂包括与待测靶分子特异性反应的第二对应物;
所述R3试剂包括稀释液;
所述第一对应物与所述第二对应物可以相同,也可以不相同;
所述检测试剂还包括血清;
所述血清的加入方式包括:
加入待测样本中,不加入所述R1试剂、所述R2试剂或所述R3试剂中;或
加入待测样本和所述R1试剂中,不加入所述R2试剂或所述R3试剂中;或
加入待测样本和所述R2试剂中,不加入所述R1试剂或所述R3试剂中;或
加入待测样本和所述R3试剂中,不加入所述R1试剂或所述R2试剂中;或
加入待测样本、所述R1试剂和所述R2试剂中,不加入所述R3试剂中;或
加入待测样本、所述R1试剂和所述R3试剂中,不加入所述R2试剂中;或
加入待测样本、所述R2试剂和所述R3试剂中,不加入所述R1试剂中;或
加入待测样本、所述R1试剂、所述R2试剂和所述R3试剂中;或
加入所述R1试剂中,不加入待测样本、所述R2试剂或所述R3试剂中;或
加入所述R2试剂中,不加入待测样本、所述R1试剂或所述R3试剂中;或
加入所述R3试剂中,不加入待测样本、所述R1试剂或所述R2试剂中;或
加入所述R1试剂和所述R2试剂中,不加入所述待测样本或所述R3试剂中;或
加入所述R1试剂和所述R3试剂中,不加入待测样本或所述R2试剂中;或
加入所述R2试剂和所述R3试剂中,不加入待测样本或所述R1试剂中;或
加入所述R1试剂、所述R2试剂和所述R3试剂中,不加入待测样本中。
3.如权利要求2所述的检测试剂,其特征在于,所述血清包括动物血清;
所述动物血清包括胎牛血清、小牛血清、成牛血清、马血清、羊血清、鸡血清、兔血清或合成血清替代品中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的检测试剂,其特征在于,所述血清包括马血清。
5.如权利要求2所述的检测试剂,其特征在于,所述血清的浓度包括1%~80%。
6.如权利要求2所述的检测试剂,其特征在于,所述血清的pH包括5~10。
7.如权利要求6所述的检测试剂,其特征在于,所述pH通过缓冲物维持,所述缓冲物包括磷酸盐、碳酸盐、硼酸盐、tris、MES、HEPES、ACES、MOPS中的一种或多种的组合。
8.如权利要求2至7任一项所述的检测试剂在制备降低光激化学发光检测中基质效应的试剂盒、检测系统或检测装置中的应用。
9.降低光激化学发光检测中基质效应的试剂盒,其特征在于,包括如权利要求2至7任一项所述的检测试剂,以及可接受的辅料、助剂或载体。
10.降低光激化学发光检测中基质效应的方法,其特征在于,取待测样本与如权利要求2至7任一项所述的检测试剂或如权利要求9所述试剂盒中的检测试剂混合,检测。
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