CN114264826A

CN114264826A - 人免疫球蛋白g4试剂盒

Info

Publication number: CN114264826A
Application number: CN202111602142.1A
Authority: CN
Inventors: 杨帆; 宋金玲; 魏智薪; 史文艳; 田永帅; 刘万建; 李文菁; 高文晓
Original assignee: Qingdao Hightop Biotech Co ltd
Current assignee: Qingdao Hightop Biotech Co ltd
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2022-04-01

Abstract

本发明属于医学及生物化学技术领域，目的在于解决现有技术中检测人免疫球蛋白G4的方法存在的试剂盒制作涉及到糖基化的复杂工艺。本发明提供一种人免疫球蛋白G4试剂盒，由R1试剂、R2试剂和免疫球蛋白校准品组成，R1试剂包含Good’s缓冲溶液、氯化钠、PEG6000、TWEEN20、proclin300，溶剂为纯化水；R2试剂包括Good’s缓冲溶液、海藻糖、蔗糖、氯化钠、牛血清白蛋白、proclin300、两种不同粒径的标记人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球，溶剂为纯化水；免疫球蛋白校准品中包含免疫球蛋白G4、TWEEN20、牛血清白蛋白，溶剂为纯化水。本发明抗干扰能力强，灵敏度高，特异度好。

Description

人免疫球蛋白G4试剂盒

技术领域

本发明属于医学及生物化学技术领域，具体涉及到一种人免疫球蛋白G4试剂盒。

背景技术

人体内共有5种免疫球蛋白分型，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。其分子结构一般由两条重链和两条轻链构成。其中IgG占比最高，IgG又由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四种亚型组成。IgG4占比最低，仅占1-3％。IgG4体内含量虽少，但与IgG4相关性的疾病(IgG4-RD)众多。相关性的疾病最常受累的脏器包括胰腺、肝胆系统、唾液腺、泪腺、腹膜后腔和淋巴结等。

根据现有技术，血清IgG4升高是诊断IgG4-RD的重要指标。研究表明，血清IgG4升高与受累器官数量呈正相关，其血清IgG4水平越高，即患者疾病越严重，所以血清IgG4检测是辅助诊断的重要环节。

目前检测人免疫球蛋白G4的方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫比浊法和荧光免疫层析法。酶联免疫吸附法(ELISA)全部为手工操作，操作步骤繁琐，耗时长，难以满足于医院批量检测、快速的结果反馈要求；荧光免疫层析法虽然检出结果快，但对样本量要求大，重复性差，很难满足临床需求。专利公开号为CN 106771251B的专利申请兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒，该试剂盒采用糖基化修饰鼠抗IgG4单克隆抗体，虽然能兼顾高灵敏度和特异度，但是糖基化抗体工艺复杂，耗时长，成本较高。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中检测人免疫球蛋白G4的方法存在的试剂盒制作涉及到糖基化的复杂工艺。本发明提供一种人免疫球蛋白G4试剂盒，通过将筛选出的特定商用化抗体对搭配双胶乳微球工艺，同时采取对样本进行稀释100倍的检测方式，克服了抗体需要经过糖基化复杂预处理过程，才能达到的抗HAMA和RF干扰，假阳性率低的试剂性能；同时，检测人免疫球蛋白G4的检测试剂盒，最大程度降低样本量对检测反应体系的影响，仅需2ul样本就可以重复多次检测，在日常质控环节可以降低检测成本，并且在机稳定性同样能达到30天的稳定性能，达到降本增效的效果。

本发明是通过下列技术方案达到本发明目的的：

一种人免疫球蛋白G4试剂盒，由R1试剂、R2试剂和免疫球蛋白校准品组成，

所述R1试剂中包含10mM-50mM Good’s缓冲溶液、5g/L-10g/L氯化钠、1g/L-10g/LPEG6000、1％-5％TWEEN20、1g/L proclin300，溶剂为纯化水；

所述R2试剂中包括10mM-50mM Good’s缓冲溶液、1g/L-5g/L海藻糖、1g/L-5g/L蔗糖、5g/L-10g/L氯化钠、2g/L-8g/L牛血清白蛋白、1g/L proclin300、0.5‰-1‰的标记人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球，溶剂为纯化水；所述标记人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球包含两种不同粒径的微球，其粒径差为100nm-300nm；

所述免疫球蛋白校准品中包含0g/L-6.0g/L免疫球蛋白G4、1％-5％TWEEN20、2g/L-8g/L牛血清白蛋白，溶剂为纯化水。

优选的，所述R1试剂中Good’s缓冲液为MES缓冲液、HEPES缓冲液、Trizam缓冲液和ADA缓冲液中的至少一种缓冲液。

优选的，其特征在于，所述R2试剂中Good’s缓冲液为MES缓冲液、HEPES缓冲液、Trizam缓冲液、ADA缓冲液中的至少一种缓冲液。

优选的，所述R1试剂与R2试剂的加样体积比例是3:1。

优选的，所述标记人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球采用如下方法制备：将乳胶微球用50mM MES缓冲液稀释至0.2％，依次添加EDC和NHS至终浓度为0.5mM，25℃条件下活化30min，随后用100mM MES缓冲液重悬至乳胶微球终浓度为0.2％；将单克隆抗体用50mM MES缓冲液稀释至1mg/mL；将乳胶微球与单克隆抗体混匀，25℃孵育90min，随后加入封闭剂封闭60min，然后离心取沉淀，最后用100mM MES缓冲液重悬，超声后保存。

优选的，所述乳胶微球由粒径分别为100nm和300nm的微球组成。

优选的，所述乳胶微球中100nm粒径微球与300nm粒径的微球的数量比为：9:1。

优选的，其特征在于，所述乳胶微球与单克隆抗体按照体积比9:1的比例滴加混匀。

优选的，以13000r/min-15000r/min的转速离心。

优选的，所述标记人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球保存在HEPES缓冲液中。

在本发明的有益效果：

(1)该试剂盒采用的抗体无需糖基化，标记工艺步骤简单易操作，耗时短，提高了生产效率，降低了人工成本。

(2)将样本量稀释100倍后检测，稀释后，样本占检测体系1/12000，有效降低样本中除被测物以外的其他成分对检测结果的影响，同时保障了试剂线性范围(0.04-6.0g/L)；减少对样本的需要，仅需2ul样本就可以重复多次检测，在日常质控环节可以降低检测成本，达到降本增效的目的。

(3)采用大小粒径胶乳微球混合的方式，大粒径微球可以提高试剂灵敏度，在样本稀释100倍后仍可以检测到线性低值0.04g/L的浓度，小粒径微球提高了试剂的线性范围，可以测到线性上线6.00g/L的浓度，这种双粒径微球按特定比例混搭就同时兼顾了试剂的线性、灵敏度。

附图说明

图1为实施例1IgG4定标曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

下述实施例中所用的实验材料和试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例所采用的标记人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球采用如下方法制备：

(1)微球活化：首先，取粒径分别为100nm和300nm的两种商业化乳胶微球，按照数量比为9：1的比例混合，将这两种微球用50mM MES缓冲液稀释至0.2％，依次添加EDC和NHS至终浓度0.5mM,25℃活化30min，随后，离心去上清，再用100mM MES缓冲液分别重悬至乳胶微球终浓度为0.2％。

(2)微球标记：首先，将商业化人免疫球蛋白G4单克隆抗体用50mM MES缓冲液稀释至1mg/ml；按照乳胶微球与单克隆抗体的体积比9:1的比例滴加混匀，25℃孵育90min，随后加入封闭剂封闭60min，然后，使用超速离心机≤13000r/min离心；最后，用100mM MES缓冲液重悬，超声后保存在HEPES缓冲液中。

实施例中若未注明具体技术或条件，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件进行。

实施例1

一种人免疫球蛋白G4试剂盒，由R1试剂、R2试剂和免疫球蛋白校准品组成。

其中R1试剂的组成为：10mM HEPES缓冲溶液、5g/L氯化钠、5g/LPEG6000、1％TWEEN-20、1g/L proclin300、溶剂为纯化水。

R2试剂的组成为：10mM HEPES缓冲溶液、1g/L海藻糖、5g/L蔗糖、5g/L氯化钠、2g/L牛血清白蛋白、1g/L proclin300、0.5‰的标记人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球、溶剂为纯化水。

免疫球蛋白校准品的组成为：0.1g/L免疫球蛋白G4、5％TWEEN-20、5g/L牛血清白蛋白、溶剂为纯化水。

R1试剂的制备方法：将HEPES溶于纯化水至终浓度为10mM，依次加入氯化钠至终浓度5g/L、加入PEG6000至终浓度5g/L、加入TWEEN-20至终浓度1％、加入proclin300至终浓度1g/L，调节pH至8.0，充分搅拌均匀，即得R1试剂。

R2试剂的制备：将HEPES溶于纯化水至终浓度为10mM，依次加入海藻糖至终浓度1g/L,加入蔗糖至终浓度5g/L,加入氯化钠至终浓度5g/L，加入牛血清白蛋白至终浓度2g/L，加入proclin300至终浓度1g/L，调节pH至7.4，加入标记人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球至终浓度0.5‰，即制得R2试剂。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于R1试剂和R2试剂的组成不同。

R1试剂的组成：50mM HEPES缓冲溶液、10g/L氯化钠、10g/LPEG6000、5％TWEEN-20、1g/L proclin300、溶剂为纯化水。

R2试剂的组成：50mM HEPES缓冲溶液、1g/L海藻糖、5g/L蔗糖、10g/L氯化钠、8g/L牛血清白蛋白、1g/L proclin300、0.5‰的标记人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球、溶剂为纯化水。

免疫球蛋白校准品的组成与实施例1相同，R1试剂和R2试剂的制备方法参照实施例1。

实施例3

本实施例与实施例1的区别之处在于R1试剂和R2试剂的组成不同。免疫球蛋白校准品的组成与实施例1相同，R1试剂和R2试剂的制备方法参照实施例1。

R1试剂的组成：50mM HEPES缓冲溶液、8g/L氯化钠、8g/LPEG6000、2％TWEEN-20、1g/L proclin300、溶剂为纯化水。

R2试剂的组成：10mM HEPES缓冲溶液、1g/L海藻糖、5g/L蔗糖、10g/L氯化钠、8g/L牛血清白蛋白、1g/L proclin300、1‰的标记人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球、溶剂为纯化水。

实施例4

R2试剂的组成：R2试剂中包括10mM HEPES缓冲溶液、1g/L海藻糖、5g/L蔗糖、10g/L氯化钠、8g/L牛血清白蛋白、1g/L proclin300、2‰的标记人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球、溶剂为纯化水。

实施例5

R1试剂的组成：50mM HEPES缓冲溶液、8g/L氯化钠、8g/LPEG6000、4％TWEEN-20、1g/L proclin300、溶剂为纯化水。

R2试剂的组成：10mM HEPES缓冲溶液、1g/L海藻糖、5g/L蔗糖、10g/L氯化钠、8g/L牛血清白蛋白、1g/L proclin300、5‰的标记人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球、溶剂为纯化水。

应用例

本发明实施例1-5所述试剂盒性能评定结果水平基本一致，以实施例1为例制备的试剂盒进行基本性能分。

基本性能分析

1、线性范围宽(0.04-6.00g/L)

表1IgG4定标曲线

2、检测线性范围：

表2线性范围分析

3、精密度

表3精密度分析

4、热稳定性

表4热稳定性分析

注：同一批次试剂盒：0时值是将一部分试剂盒保存于2-8℃；37℃是将一部分试剂盒放置在37℃加速。

5、在机稳定性

表5在机稳定性分析

注：同一批次试剂盒：0时值是将一部分试剂盒保存于2-8℃；在机是将试剂盒开封放置在仪器上。

表6临床比对分析

注：经确认是带干扰的样本：S-3/S-8/S-16；参考范围小于1.40g/L；

西门子：S-3/S-8/S-16均检测为阳性；S-9/S-11/S-12/S-19/S-21超出试剂线性范围；

某国产试剂：S-3检测为阳性，S-8/S-16检测为阴性；S-12/S-19超出该试剂线性范围上线；

实施例1试剂：S-3/S-8/S-16均检测为阴性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种人免疫球蛋白G4试剂盒，其特征在于，由R1试剂、R2试剂和免疫球蛋白校准品组成；

所述R2试剂中包括10mM-50mM Good’s缓冲溶液、1g/L-5g/L海藻糖、1g/L-5g/L蔗糖、5g/L-10g/L氯化钠、2g/L-8g/L牛血清白蛋白、1g/L proclin300、0.5‰-1‰的标记抗人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球，溶剂为纯化水；所述标记抗人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球包含两种不同粒径的微球，其粒径差为100nm-300nm；

2.根据权利要求1所述的人免疫球蛋白G4试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中Good’s缓冲液为MES缓冲液、HEPES缓冲液、Trizam缓冲液和ADA缓冲液中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的人免疫球蛋白G4试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中Good’s缓冲液为MES缓冲液、HEPES缓冲液、Trizam缓冲液、ADA缓冲液中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的人免疫球蛋白G4试剂盒，其特征在于，所述R1试剂与R2试剂的使用体积比例为3:1。

5.根据权利要求1所述的人免疫球蛋白G4试剂盒，其特征在于，所述标记抗人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球采用如下方法制备：将乳胶微球用50mM MES缓冲液稀释至0.2％，依次添加EDC和NHS至终浓度为0.5mM，25℃条件下活化30min，离心去除上清液，随后用100mM MES缓冲液重悬至乳胶微球终浓度为0.2％；将单克隆抗体用50mM MES缓冲液稀释至1mg/mL；将乳胶微球与单克隆抗体混匀，25℃孵育90min，随后加入封闭剂封闭60min，然后离心取沉淀，最后用100mM MES缓冲液重悬，超声后保存。

6.根据权利要求5所述的人免疫球蛋白G4试剂盒，其特征在于，所述乳胶微球由粒径分别为100nm和300nm的微球组成。

7.根据权利要求6所述的人免疫球蛋白G4试剂盒，其特征在于，所述乳胶微球中100nm粒径微球与300nm粒径的微球的数量比为：9:1。

8.根据权利要求5-7任一项所述的人免疫球蛋白G4试剂盒，其特征在于，所述乳胶微球与单克隆抗体按照体积比9:1的比例滴加混匀。

9.根据权利要求5-7任一项所述的人免疫球蛋白G4试剂盒，其特征在于，以13000r/min-15000r/min的转速离心。

10.根据权利要求5-7任一项所述的人免疫球蛋白G4试剂盒，其特征在于，所述标记抗人免疫球蛋白G4单克隆抗体的乳胶微球保存在HEPES缓冲液中。