NO166383B - Fremgangsmaate ved fremstilling av bispesifikke antistoff-determinanter. - Google Patents
Fremgangsmaate ved fremstilling av bispesifikke antistoff-determinanter. Download PDFInfo
- Publication number
- NO166383B NO166383B NO85855200A NO855200A NO166383B NO 166383 B NO166383 B NO 166383B NO 85855200 A NO85855200 A NO 85855200A NO 855200 A NO855200 A NO 855200A NO 166383 B NO166383 B NO 166383B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- molecules
- thiol
- antibody
- determinants
- bispecific
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 16
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 9
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 8
- 150000004662 dithiols Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 6
- AQLMHYSWFMLWBS-UHFFFAOYSA-N arsenite(1-) Chemical compound O[As](O)[O-] AQLMHYSWFMLWBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L cadmium dichloride Chemical compound Cl[Cd]Cl YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 4
- ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N Bipyridyl Chemical group N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1 ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 3
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L tetrathionate(2-) Chemical compound [O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 40
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 40
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 40
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 15
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 6
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- -1 sodium arsenite Chemical compound 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 4
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 4
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 4
- PTLRDCMBXHILCL-UHFFFAOYSA-M sodium arsenite Chemical compound [Na+].[O-][As]=O PTLRDCMBXHILCL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- GANZODCWZFAEGN-UHFFFAOYSA-N 5-mercapto-2-nitro-benzoic acid Chemical class OC(=O)C1=CC(S)=CC=C1[N+]([O-])=O GANZODCWZFAEGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 3
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 3
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000005465 channeling Effects 0.000 description 3
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 3
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 3
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 3
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 3
- BQVCCPGCDUSGOE-UHFFFAOYSA-N phenylarsine oxide Chemical compound O=[As]C1=CC=CC=C1 BQVCCPGCDUSGOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- UHBAPGWWRFVTFS-UHFFFAOYSA-N 4,4'-dipyridyl disulfide Chemical compound C=1C=NC=CC=1SSC1=CC=NC=C1 UHBAPGWWRFVTFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 2
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 2
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 2
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 240000000731 Fagus sylvatica Species 0.000 description 1
- 235000010099 Fagus sylvatica Nutrition 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001661 cadmium Chemical class 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- FRTGEIHSCHXMTI-UHFFFAOYSA-N dimethyl octanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCCCC(=N)OC FRTGEIHSCHXMTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000005669 field effect Effects 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000013631 noncovalent dimer Substances 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical group 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000009597 pregnancy test Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011949 solid catalyst Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av en bispesifikk monoklonal antistoff-deterninant og anvendelse av sistnevnte for immunologisk bestemmelse av mengden av en ukjent substans i en væskeprøve.
Bakgrunn for oppfinnelsen
IgG antistoffene er kjent for å bestå av to halvmolekyler, som hver består av en lett (L) kjede og en tung (H) kjede. H-kjedene til de to halvdeler er bundet med disulfidbindinger som kan brytes ved selektiv reduksjon. Hvis dette trinn utføres for to forskjellige IgG-prøver, kan halvmolekylene kombineres til å danne hybrid-antistoffer. Dette er blitt utført ved bruk av intakte kaninglobuliner: Nisonoff et al. (1964) Science 134, 376-379. IgA-antistoffene kan også spaltes i to identiske halvmolekyler.
Hybrider er også dannet ved å bruke F(ab')2fragmentene av IgG-antistoffer, istedenfor intakte antistoffer, dvs. F(c') delene av molekylene, som ikke gir immunospesifitet, fjernes før hybridisering ved avspaltning med en passende:protease så som pepsin. Denne fremgangsmåte er beskrevet i Nisonoff et al.
(1960) Arch. Biochem. Biophys. 89, 230-244 og i Nisonoff and Rivers (1960) Arch. Biochem. Biophys. 9_3 , 460-462. I en senere diskusjon av den første publikasjon Nisonoff skrev, i Current Contents (Nov.2, 1981), 44.. 25: Hittil har denne fremgangsmåte fått begrenset anvendelse, hovedsakelig ved behandling av celleoverflater med ferritin ved bruk av et hybrid an anti-ferritin antistoff og antistoff overfor et celleoverflateantigen. Bruken av hybrid-antistoff har også vært ansett som et middel for å bringe et farmasøytisk middel spesifikt i kontakt med en ønsket vevsoverflate. Bruken av slike hybrider for dannelse av cytotoksiske medikamenter har også vært foreslått i Raso and Griffin (1978) Fed. Proe. 37, 1350. Milstein (1981) Proe. R.Lond. B211. 393-412 foreslår muligheten å bruke "monoklonale antistoffer som bærere for toksiske substanser for spesifikk behandling av tumorer," og angir at "det er mulig at Fab fragmenter vil være bedre målreagenser enn intakt antistoff". Hybride antistoffer har også blitt dannet ved sammensmeltning av to celler som hver kan produsere forskjellige antistoffer og danne en hybridcelle som kan produsere hybride antistoffer. En slik metode er beskrevet i Milstein & Cuello (1983) Nature 305. 537-540. Muse-hybridomceller som danner forskjellige monoklonale antistoffer ble sammensmeltet og de resulterende sammensmeltede celler ga blandinger av antistoffer som bestod av alle mulige kombinasjoner av de to forskjellige sett opprinnelig tunge og lette kjeder. I denne blandingen av molekyler var det hybridantistoffer som bestod av en halvdel av hver av de opprinnelige antistoff-molekyler, som delvis kunne renses ved ionebytterkromatografi. En annen publikasjon, Raso et al. (1981) Cancer Research 41, 2073-2078, beskriver dannelsen av en uren prøve av kaninantistoff F(ab')2fragmenter; kaninantistoff-fragmentene ble spaltet ved reduksjon og satt sammen igjen med antiricin A-kjede F(ab')2fragmenter. De tosidige spesifikke dimerer ble brukt i målmedikament-avgivende eksperimenter. Artikkelen slår fast: De to typer rensede antistoffer som ble brukt til dette arbeid, ble isolert fra vanlige heteroantisera. Således må en komplisert rekke av affinitets- og spesifitets-kombinasjoner oppstå etter sammensmeltning av disse to populasjoner. Dannelsen av homogene hybridoma-avledede antistoffer vil gi absolutt kontroll over bindingsaffini-tetene til de utgjørende halvdeler av et hybrid antistoff, og denne jevnhet burde hovedsakelig være ansvarlig for deres endelige virkning som avgivende bærere.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en homogen
blanding av identiske bispesifikke antistoff-determinanter,
idet hver bispesifikk determinant er satt sammen av to L-H-halvmolekyler bundet med disulfidbindinger, idet hvert L-H-halvmolekyl er forskjellig fra det andre og er spesifikt for en forskjellig antigen-determinant.
De bispesifikke monoklonale antistoff-determinanter fremstilles ifølge oppfinnelsen ved
å kombinere to forskjellige monoklonale antistoff-determinanter , hvori én er en monoklonal IgG determinant eller F(ab')2-delen derav inneholdende to identiske L-H-halvmolekylér sammenbundet med én eller flere disulfid-bindinger,
bryte disulfidbindingene som binder sammen L-H-halvmolekylene til de to forskjellige antistoff-determinanter, idet dannelse av disulfidbindinger i H-kjedene forhindres ved å utføre spaltningen i nærvær av et ditiolkomplekseringsmiddel såsom arsenitt eller kadmiumklorid eller ved å utføre spaltningen ved en ikke høyere pH enn 4,2; eller etter spaltningen fjerner alle unntatt én redusert cysteinrest ved bruk av et proteolytisk enzym, hvorved hver determinant spaltes i et par identiske halvmolekyler, idet de to forskjellige antistoffer eller antistoff-fragmenter derivatiseres med et tiolaktiverende middel såsom 5 ,5'-ditiobis(2-nitrobenzosyre) eller dipyridin-disulfid, og danner et derivat som reagerer raskt med frie tioler under dannelse av disulfider, og overføring av ett av halvmolekylene av de tiolaktiverte F(ab') til den fri tiol, eller alternativt, hvor de fri tiol-halvmolekyler som dannes ved spaltningsreaksjonen av én av antistoff-determinantene, anvendes direkte uten forutgående omsetning med et tiolaktiverende reagens og påfølgende reduksjon, og blanding av de tiolaktiverte halvmolekyler med de fri tiolhalvmolekyler, og eventuelt separeres alle ikke-omsatte halvmolekyler fra de bispesifikke antistoff-determinanter på grunnlag av molekyl-størrelse som f.eks. ved gelfiltrering.
I foretrukne utførelsesformer er de monoklonale antistoffer IgG (helst IgGlteller mindre gjerne, IgG2A, IgG2B eller IgG3) eller IgA; hvert halvmolekyl, hvis det stammer fra et IgG-antistoff, inneholder minst F(ab') delen; tiolaktiveringsmidlet forhindrer rekombinasjon av de tiolaktiverte halvmolekyler; en eller begge de monoklonale antistoff-determinanter er satt sammen av halvmolekyler, sammenbundet med mer enn én disulfidbinding, og trinnet spaltning av slike determinanter i to halvmolekyler utføres under betingelser som forhindrer dannelsen av disulfidbindinger mellom H-kjedene til halvmolekylene; og det tiolaktiverende middel er 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzosyre),2,2'-dipyridin-disulfid, 4 ,4'-dipyridin-disulfid eller en blanding a sulfit og tetrationat. (Bruken av tiolaktiverende midler til å binde F(ab')-fragmenter til andre proteiner har f.eks. blitt beskrevet i Raso et al. (1980) J. Immunol. 125. 2610; Raso et al (1982) Cancer Res. 42. 457; og Masuho et al.
(1979) B.B.R.C. 90, 320. Fortrinnsvis forhindres dannelsen av disulfidbindinger mellom H-kjedene av halvmolekyler som opprinnelig har vært bundet ved disulfidbindinger ved å utføre spaltningsreaksjonen i nærvær av et ditiol-komplekserende middel så som et arsenitt, f.eks. et uorganisk arsenitt så som natriumarsenitt, eller et arylarsenitt, f.eks. fenylarsinoksyd, eller et kadmiumsalt, eller ved å utfore spaltningsreaksjonen under betingelser hvorunder konformasjonen til H-kjedene modifiseres slik at dannelse av disulfidbindinger forhindres, f.eks. ved en pH mellom 3,8 og 4,5 (helst 4,2), eller ved å fjerne alle bortsett fra én redusert cysteinrest ved bruk av et proteolytisk enzym så som karboksypeptidase Y. Når rekombinasjonen av like halvmolekyler med hverandre forhindres, kan rensning av bispesifikke determinanter fra blandingen ganske enkelt utføres på grunnlag av molekylstørrel-sen, f.eks. ved gelfiltrering, og dette er mulig fordi de eneste molekylene i løsningen, halvmolekyler og bispesifikke hybrider, er forskjellige i størrelse med en faktor på to. Andre separasjonsmetoder er f.eks. ionebytte og isoelektrisk fokusering. Figur 1 viser skjematisk en sammensetning som kan anvendes i en bioluminescens-måling. Figur 2 viser skjematisk en kanaliserende immunologisk måling som anvender bispesifikke monoklonale antistoff-determinanter . Figur 3 viser skjematisk en fluorescens-energioverførings-måling som anvender bispesifikke monoklonale antistoff-determinanter . Figur 4 viser skjematisk strukturen til et kanin IgG^sammenlignet med mus IgG^. Figur 5 viser skjematisk konkurrerende disulfider mellom-kjeder i halvmolekyler hos mus. Figur 6 viser skjematisk en foretrukket fremstil1ingsmetode for bispesifikke monoklonale antistoff-determinanter. Figur 7 viser skjematisk en luminescens-energioverførings-immunologisk måling som anvender bispesifikke monoklonale antistoff-determinanter. De bispesifikke monoklonale antistoff-determinanter som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan anvendes for en hel rekke formål. Disse anvendelser stammer alle fra determinantenes evne til å tjene som meget spesifikke bindeledd mellom spesifikke punkter B' for hvilke som helst to antigen-determinanter som kan stimulere antistoffproduksjonen hos dyr; f.eks. effektive proteiner, polypeptider, karbohydrater, nukleinsyrer eller haptener, enten frie eller immobilisert på overflater eller partikler. En anvendelse av de bispesifikke antistoff-determinanter fremstilt ifølge oppfinnelsen er bruk av dem som midler for å binde en ønsket antigen-enhet til en ønsket overflate som inneholder eller har fått immobilisert på seg en forskjellig antigen-determinant. For eksempel kan enzymer som er blitt immobilisert slik på partikler eller membraner brukes som faste katalysatorer. Fordeler ved denne type immobilisering fremfor andre er at antistoffer kan velges som ikke har noen uheldig virkning på enzymaktiviteten, og at rene enzymer kan immobiliseres fra urene blandinger. Bispesifikke antistoff-determinanter kan også brukes som meget spesifikke bispesifikke reagenser for immunologiske målemetoder som for eksempel brukes i diagnose av medisinske forstyrrelser eller som molekylære prober for å studere sammenhengen mellom antigen-determinanter i biologiske systemer. En ytterligere anvendelse av de bispesifikke antistoff-determinanter er bruken av dem i elektroder. Oppfinnelsen kan brukes i elektroder med enhver form, f.eks. i faste sensorer så som feltéffekt-transistorer, f.eks. som beskrevet i Wohltjen
(1984) Analyt. Chem. 56, 87A.
Enzymelektroder fremstilt ved bruk av bispesifikke anti-stof f-determinanter har flere fordeler fremfor vanlige enzymelektroder. En fordel er deres nøyaktige selvsammensetnings-egenskap: den ønskede elektrodeenhet dannes ganske enkelt ved å knytte det riktige hapten eller haptener til membranet (enten elektrodemembranet eller et separat membran forbundet med elektroden) og deretter neddykke den hapten-utledede membran i en løsning som inneholder de riktige bispesifikke antistoffer og enzymer. Denne letthet ved sammensetning betyr også at elektroden lett kan gjenopplades etter at svekkelse er oppstått gjennom langvarig bruk.
En annen fordel ved elektrodene er også en funksjon av de bispesifikke antistoff-determinanters spesifitet. Ethvert gitt enzym vil ha en rekke antigenpunkter som kan binde seg til et spesifikt punkt på et antistoff. Imidlertid kan kobling av mange av disse punkter bevirke inaktivering av enzymet. I tilfelle bispesifikke monoklonale antistoff-determinanter unngås dette problem fordi determinantene velges slik at de kobler med enzymet bare på et sted som ikke bevirker deaktivering av enzymet.
En videre fordel er at sammensetning eller gjenoppladning av elektroden kan foretas med urene enzymblandinger på grunn av at den enestående spesifiteten til de bispesifikke antistoff-determinanter sikrer riktig valg av enzymene fra den urene blanding. I noen tilfeller kan elektrodeenheten stabiliseres med et svakt bifunksjonelt kryssbindemiddel, f.eks. dimetyl-suberimidat.
Enda en annen anvendelse for de bispesifikke antistoff-determinanter er bruk av dem ved dannelse av selv-sammensettende nettverk, f.eks. som bruk som molekylære mikrokretser.
De ovennevnte anvendelser er beskrevet i nærmere detalj i Paulus US patent nr. 4.444.878.
Det følger en nærmere omtale av dannelsen av de bispesifikke antistoff-determinanter fremstilt ifølge oppfinnelsen, og den spesielle metode hvor de anvendte antistoffer stammer fra mus.
Figur 4 illustrerer forskjellen i struktur mellom kanin IgG-L antistoffer og muse IgG-^ antistoffer (hvilke omfatter hovedsakelig monoklonale antistoffer). Disse strukturer adskiller seg ved antall disulfidbindinger som forbinder de tunge kjeder. De to halvdeler av kanin IgG-^holdes sammen med en eneste binding, og reduksjonen av F(ab')2til F(ab') monomer samt den nye forbindelse av monomer til dimeren innbefatter således brytning og ny dannelse av bare én binding, en relativ enkel prosess. Derimot er de tunge kjeder av muse IgG]^ bundet med 3 disulfidbindinger, og brytning av dem og nydannelse kan føre til konkurrerende bireaksjoner innen kjeden av den type som er illustrert i figur 5, hvilket kan redusere utbytte av det ønskede produkt betydelig. Reaksjonen innen kjeden gjør halvmolekylet utilgjengelig for kombinasjon med et forskjellig halvmolekyl. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen muliggjør produksjon av rene bispesifikke monoklonale antistoff-determinanter i høyt utbytte fra monoklonale museantistoffer samt fra antistoffer som stammer fra andre pattedyrarter.
Fremgangsmåten medfører den følgende rekkefølge av trinn. Ved å bruke vanlige metoder fremstilles to forskjellige monoklonale IgG^antistoffprøver, idet hvert antistoff har én av to ønskede selektiviteter. Hver prøve utsettes deretter for en riktig protease så som pepsin for å avspalte F(c') delen til antistoff-molekylet for å danne et F(ab')2fragment. Hver prøve underkastes så tilstrekkelige betingelser til å bryte disulfidbindingene som forbinder F(ab') halvmolekylene, men ikke noen av de andre disulfidbindinger i molekylet. Samtidig er disse betingelser slik at de forhindrer dannelsen av disulfider innenfor en enkelt tung kjede, f.eks. ved tilsetning av et ditiolkomplekseringsmiddel (f.eks. natriumarsenitt (som vist i figur 6), et aromatisk arsenitt så som fenylarsinoksyd, eller CdCl2), eller ved å modifisere konformasjonen til den tunge sidekjede (f.eks. ved å senke pH til 4,2), eller ved å fjerne alle unntatt én av de reduserte cysteinrester med et proteolytisk enzym (f.eks. karboksypeptidase Y).
En av prøvene utsettes så for et tiolaktiverende reagens for å kompleksere alle frie tioler under dannelse av et derivat som raskt kan reagere med andre frie tioler og danne disulfider som vist ved slutten av sekvens 1 i figur 6. Blant reagensene som er egnet for dette formål er aromatiske disulfider så som DTNB (Ellman (1959) Arch.Biochem. Biophys. 82, 70) (Figur 6), 2,2'-dipyridin disulfid, 4,4'-dipyridin disulfid (Grasetti et al.
(1967) Arch.Biochem. Biophys. 119, 41) og sulfitt/tetrationat (Masuho et al. (1979) B.B.R.C. 98, 320). Denne aktiverte prøve kombineres deretter (sekvens 3 i figur 6) med den andre ditiol-komplekserte prøve, som har tilgjengelige tioler, under beting-else hvor minst noen halvmolekyler kjemisk kombineres under dannelse av bispesifikke antistoffdeterminanter, men ingen monospesifikke Ftab'^-
Alternativt kan begge prøver utsettes for det tiolaktiverende reagens og danne de aktivertetiolderivater. (Dette er ofte lett på grunn av den relativt gode stabiliteten til de aktiverte derivater.) En av prøvene behandles deretter med et overskudd av en tiol med lav molekylvekt for å regenerere de fri tioler på F(ab') monomeren, etterfulgt av separasjon fra overskudd av lavmolekylære tioler. Intramolekylær disulfidbinding-dannelse kan unngås ved tilsetning av et ditiolkomplekserende reagens (sekvens 2 på figur 6) eller ved å modifisere konformasjonen til den tunge kjede. I noen tilfeller kan det imidlertid væreønskelig å tillate dannelse av intramolekylære disulfidbindinger. Denne prøven kombineres så (sekvens 3 på figur 6) med den andre F(ab') prøven i den tiolaktiverte form under betingelser hvor minst noen halvmolekyler kombinerer kjemisk og danner bispesifikk F(ab')2.
Da F(ab'),jfraksjonen som dannes under disse betingelser bare består av de ønskede bispesifikke antistoff-determinanter, forutsatt at tilstrekkelig rensede monoklonale antistoffer har blitt brukt som utgangsmaterialer, kan homogene bispesifikke antistoff-determinanter ganske enkelt oppnås ved å fjerne den monomere F(ab') fraksjon fra den ønskede F(ab')2på grunnlag av molekylstørrelse ved en enkel fremgangsmåte så som gelfiltrering.
Den følgende fremgangsmåte brukes til å fremstille en homogen prøve av identiske bispesifikke antistoff-determinanter hvori hver bispesifikk determinant har et spesifikt punkt for et eneste antigenpunkt på proteinet avidin, og et punkt spesifikt for et eneste antigenpunkt på ensymet B-galaktosidase. Denne fremgangsmåte følger trinnene som generelt er illustrert på figur
Det første trinn er 'fremstillingen av monoklonale antistoffer mot de to proteiner avidin og B-galaktosidase. Dette gjøres ved først å immunisere en gruppe BALB/C mus mot hvert enzym ved bruk av standardimmuniseringsmetoder.
Etter immunisering prepareres miltceller fra immuniserte dyr og smeltes sammen med et derivat av MOPC-2 1 myelomaceller (for eksempel NS1 eller SP2/0-Ag14) ved bruk av fremgangsmåten som er beskrevet i Galfre et al. (1981) Methods in Enzymology 7_3, 3-46. Hybridcellene utvelges i hypoksantin-aminopterin-tymidinmedium, klones og utvelges for produksjon av antistoffer mot de ønskede enzymer ved den metode som er beskrevet i Galfre et al. Id. Klonene som finnes til å fremstille antistoffer mot det ønskede enzym, undersøkes så for å utvelge et klon som produserer et antistoff fra IgG^klassen som har en høy affinitet til enzymet og som ikke bevirker inaktivering av enzymet. Klonene av interesse lagres inntil bruk under flytende nitrogen. Antistoff fremstilles ved standard teknikk for formering av klonede celler som askitiske tumorer i peritoneale hulrom av pristan-primede mus .
De ønskede IgG1 antistoffer mot avidin og ø-galactosidase renses deretter fra bukvatersottvæske hovedsaklig som beskrevet av Parham et al. (1982) Journal of Immunological Methods 53, 133-173, ved en fremgangsmåte som medfører ammoniumsulfatut-felling, gelfiltrering og kromatografi på DEAE cellulose med lineær saltgradient. De monoklonale antistoffer spaltes til F(ab')2fragmenter med pepsin som beskrevet av Lamoyi og Nisonoff
(1983) Journal of Immunological Methods .56, 235-243 ved å inkubere i 18 timer ved 25°C med pepsin (2 vektprosent) i 0,1 M
natriumacetat, pH 4,2. F(ab')2fragmentene renses så ved HPLC på en TSK 3000 SW kolonne i 0,1 M natriumfosfat, pH 6,8, som beskrevet i Parham et al. Id.
F(ab')2fraksjonene overføres så fullstendig til Fab'
monomer ved reduksjon med 1 mM 2-merkaptoetylamin i 1 mM EDTA, 10 mM natriumarsenitt og 0,1 M natriumfosfat, pH 6,8, i 18 timer ved 25°C. Blandingen tilføres deretter fast DTNB til en sluttkonsentrasjon på 20 mM. Etter 2-3 timer ved 25°C fjernes overskudd
DTNB og lavmolekylære produkter ved sentrifugerende gelfiltrering på Sephadex G-25 ekvilibrert med 0,1 M natriumfosfat, pH 6,8, og 1 mM EDTA. De resulterende tionitrobenzoat-derivater av Fab' monomerene er relativt stabile og kan lagres i flere dager uten nevneverdig spaltning.
Et av tionitrobenzoat-derivatene av Fab' monomeren (som stammer fra anti-avidin antistoffet) overføres så tilbake til den tiolfri form (kompleksert med ditiol) ved å inkubere i 30 minutter ved 25°C med 10 mM merkaptoetylamin i 1 mM EDTA, og 0,1 M natriumfosfat, pH 6,8. Overskuddet av merkaptoetylamin og reaksjonsproduktet med lav molekylvekt fjernes så ved sentri-fugalgelfiltrering på Sephadex G-25 ekvilibrert med 0,1 mM natriumfosfat, pH 6,8, og 1 mM EDTA.
Det resulterende anti-avidin F(ab')-tiol bringes så øyeblik-kelig i kontakt med en ekvimolar mengde av tionitrobenzoatderi-vatet av anti-p-galactosidase Fab', ved en proteinkonsentrasjon på 0,5 mg/ml eller høyere i 3 - 20 timer ved 25°C for å mulig-gjøre dannelse av bispesifikt F(ab')^. Blandingen supplementeres så med fast DTNB til en sluttkonsentrasjon på 5 mM og fikk stå i tre timer ved 25°C for å bevirke dissipering av alt ikke-kovalent dimert materiale. Homogen bispesifikk antistoffdeterminant mot avidin og Ø-galaktosidase fremstilles så ved å separere FCab'^ fraksjonen fra de resterende Fab' monomerer ved HPLC på TSK 3000SW i 0,1 M natriumfosfat, pH 6,8, en fremgangsmåte som ikke skader F{ab')2, og ikke krever at det bindes til noe annet, og minimaliserer risikoen for konformasjonsforandringer som kunne påvirke cikti viteten. Dannelsen av den ønskede bispesifikke antistoffdeterminant kan lett påvises ved den evne til å bevirke avidinavhengig binding av p-galaktosidase til skiver av biotin-substituert cellulose.
Den bispesifikke antistoffdeterminant kan kobles til en biotinsubstituert cellulosemembran i en måling for en forbindelse, for eksempel laktose, hvilken p-galaktosidase kan hjelpe til å måle (som forklart i nærmere detalj nedenunder).
Anti-fl-galaktosidase kan immobiliseres på den biotinsubsti-tuerte membran ved ganske enkelt å kontakte membranen (som har
avidin bundet til biotinet) med den bispesifikke determinant med en anti-avidin halvdel og en anti-p-galaktosidasehalvdel, og med (3-galactosidase . På lignende måte kan glukoseoksidase immobiliseres til membranen.
Ved å bruke den samme metode som er beskrevet ovenfor, kan to bispesifikke molekyler dannes, den første med spesifitet for et eneste antigenpunkt på enzymet glukoseoksidase og for et antigenpunkt på g-galaktosidase, og det andre med spesifitet for et forskjellig antigenpunkt på giukoseoksidase og for et antigenpunkt på type I kollagen. Disse kan brukes til å danne en elektrode for å måle laktose generelt som beskrevet i Paulus, Id.
Det følgende er en beskrivelse av et ensempel på den type måling som anvender målingen av en substans som kan måles koiorimetrisk, reklektometrisk, ved luminescens eller fluoro-metrisk, som et mål på en ukjent mengde av en substans som bestemmes. Generelt måler bestemmelsen mengden av en ukjent substans i en flytende prøve, hvilken substans påvirkes av minst et enzym for å utvikle et målbart ion eller forbindelse som kan brukes som et mål på den ukjente substans. Bestemmelsen medfører binding av det første enzym til en fast bærer (for eksempel en kule eller en membranbærer), eller til et tidligere sekvensvirk-ende andre enzym, ved hjelp av en bispesifikk antistoff-determinant ifølge oppfinnelsen med spesifitet for det første enzym og for bæreren eller det andre enzym. Så mange sekvehsenzymer som inngår i reaksjonsskjemaet kan bindes på denne måte, idet det siste som skal virke i alminnelighet er bundet til bæreren. Prøven bringes i kontakt med den bundne enzym eller enzymene som er immobilisert på bæreren, og det målbare ion eller den målbare forbindelse måles. Ukjente substanser som kan måles er for eksempel blodsukker.
Alternativt kan sekvensenzymer bindes indirekte gjennom en ukjent substans som skal måles gjennom passende bispesifikke antistoffer. Dette utvider området av substanser som kan måles til biomolekyler så somhormoner (for eksempel humant chorionisk gonadotropin, målt i graviditetsprøver, og insulin). Figur 1 illustrerer en anordning av selvsammensettende enzymer bundet av bispesifikke antistoff-determinanter (vist som vinkler som sammenbinder sirkulære enzymer). Det siste enzymet i rekken (lusiferase) kan immobiliseres ved for eksempel å bruke avidin og en biotin-substituert membran (ikke vist). Når den er redusert som vist, er lusiferase bioluminescerende (reaksjons-kjeden er beskrevet i større detalj i Wienhausen og DeLuca (1982) Anal.Biochem. 127, 380, og Hastings et al. US patent nr. - 4.278 . 761 . Figur 2 illustrerer en "kanaliserings" immunologisk måling som anvender to bispesifikke monoklonale antistoff-determinanter.
(Den illustrerte bestemmelse anvender noen av prinsippene til den kanaliserende immunologiske måling som er beskrevet i Litman et al. (1980) Anal. Biochem. 106. 223.) Den første bispesifikke determinant har spesifitet overfor et første enzym og overfor et første antigenpunkt på et antigen som måles, for eksempel humant korionisk gonadotropin. Den andre bispesifikke determinant har spesifitet til et andre enzym og til et andre antigenpunkt på antigenet som måles. Det første enzym kan virke på en første substans og danne en andre substans som kan påvirkes ved det andre enzymet og avgi en målbar forbindelse eller ion. Bestemmelsen utføres ved å kontakte væskeblandingen som mistenkes for å inneholde molekylet som skal måles med de to bispesifikke determinanter og de to enzymer i nærvær av det første substrat. Hvis den ukjente er tilstede, vil de to determinanter binde seg til dette og de to bundne enzymer som er bundet til dem vil bringes meget nært sammen, slik at reaksjonsvirkningene økes med størrelsesordner. I det illustrerte skjema er det første enzym glukose-oksidase, det andre enzymet peroksidase, det første substratet glukose, og det andre substratet peroksyd, hvilket oksyderer et leukofargestoff og gir et målbart fargestoff. Det siste enzym i rekkefølgen kan immobiliseres. Målingen som er illustrert i figur 2 innholder et optisk trekk for å forbedre forholdet signal til støy, anvendelse av et konkurrerende enzym (i dette tilfelle katalase) i stor nok mengde til å overskygge virkningen av peroksidase i fravær av den ensymkoplende ukjente substans.
Figur J illustrerer en fluorescens energioverførende immunologisk måling analog med målingen på figur 2; forskjellen'•r at i energiover føringsmålingen påvirkes lys istedenfor organiske substanser for å gi et målbart resultat. Målingen anvender to fluorescerende proteiner, og i den illustrerte måling er disse fykoerytnn ("Phy") og allofykocyanin ("All"), begge fremstilt av blågrønne alger og beskrevet som anvendelige i immunologiske målinger i Glazer og Stryer (1983) Biophys. 3. A3, 323. Som illustrert i figur 3 har en bispesifikk monoklonal antistoffdeterminant spesifitet for et første punkt på antigen som måles (for eksempel humant korionisk gonadotropin) og for Phy, og den andre bispesifikke monoklonale antistoff-determinant har spesifitet for et andre punkt på antigenet for All. Nærvær av antigen kobler Phy og All tett og øker sterkt energioverfør-ingsvirkningen. Signalet dannes fordi Phy eksiterer ved 500 nm og transmitterer ved 580 nm, mens All er transparent for 500 nm, men eksiterer ved 580 nm og transmitterer ved 660 nm. Således oppnås 660 nm signalet bare ved passasje av lys i rekkefølge gjennom begge proteiner, en fremgangsmåte hvis virkning avhenger av proteinenes nærhet. Liksom i målingene som er beskrevet ovenfor, kan et eller begge fluorescerende proteiner være immobilisert på en bærer, enten på vanlig måte eller gjennom bispesifikke determinanter ifølge oppfinnelsen.
En nær beslektet type immunologisk måling som er illustrert i figur 7, medfører luminescens energioverføring mellom et luminescensmoleky1 og en fluorescense-substans som i Patel et al.
(1983) Analytical Biochemistry 129, 162-169. På figur 7 brukes det luminescerende protein aeqvarin i forbindelse med fykoerytrin. Nærværet av antigenet kobler aeqvarin og fykoerytrin tett og øker sterkt energioverføringsvirkningen. Addisjonen av Ca++ frembringer luminescens av aeqvarin ved 475 nm, hvilken eksiterer fykoerytrin og får det til å emittere fluorescens ved 580 nm. Således er 580 nm signalet bare oppnådd ved bølgelengdemodulering av aeqvarin luminescens med fykoerytrin, en prosess hvis virkning avhenger av proteinenes nærhet.
Andre utførelsesformer ligger innenfor de følgende krav.
Selv om for eksempel IgG1antistoffer foretrekkes, kan IgG2og IgA antistoffer også brukes innenfor oppfinnelsen. Også hele halvmolekylet istedenfor bare F(c') delen kan brukes. Utbytte kan forbedres litt ved å bruke som ditiol-komplekseringsmiddel 0,25 mM fenylarsinoksyd istedenfor natriumarsenitt.
Claims (10)
1. Framgangsmåte ved fremstilling av en bispesifikk monoklonal antistoff-determinant,
karakterisert vedtrinnene
å kombinere to forskjellige monoklonale antistofff-determinanter hvori én er en monoklonal IgG determinant eller F(ab)2-delen derav inneholdende to identiske L-H-halvmolekyler sammenbundet med én eller flere disulfid-bindinger,
bryte disulfidbindingene som binder sammen L-H-halvmolekylene til de to forskjellige antistoff-determinanter, idet dannelse av disulfidbindinger i H-kjedene forhindres ved å utføre spaltingen i nærvær av et ditiolkomplekseringsmiddel såsom arsenitt eller kadmiumklorid eller ved å utføre spaltningen ved en ikke høyere pH enn 4,2; eller etter spaltingen fjerner alle unntatt én redusert cysteinrest ved bruk av et proteolytisk enzym, hvorved hver determinant spaltes i et par identiske halvmolekyler, idet de to forskjellige antistoffer eller antistoff-fragmenter derivatiseres med et tiolaktiverende middel såsom 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzosyre) eller dipyridin-disulf id, og danner et derivat som reagerer raskt med frie tioler under dannelse av disulfider, og overføring av ett av halvmolekylene av de tiol-aktiverte F(ab') til den fri tiol, eller alternativt, hvor de fri tiol-halvmolekyler som dannes ved spaltingsreaksjonen av én av antistoff-determinantene, anvendes direkte uten forutgående omsetning med et tiolaktiverende reagens og påfølgende reduksjon, og blanding av de tiolaktiverte halvmolekyler med de fri tiolhalvmolekyler og eventuelt separeres alle ikke-omsatte halvmolekyler fra de bispesifikke antistoff-determinanter på grunnlag av molekyl-størrelse som f.eks. ved gelfiltrering.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert vedat de to forskjellige antistoff-determinanter er IgG eller IgA.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,
karakterisert vedat hvert forskjellig halvmolekyl består av F(ab') delen av et IgG antistoff.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert vedat det ditiol-komplekserende reagens omfatter et arsenitt.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert vedat det tiolaktiverende reagens omfatter et aromatisk disulfid.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,
karakterisert vedat det aromatiske disulfid er 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzosyre).
7. Fremgangsmåte ifølge krav 5,
karakterisert vedat det aromatiske disulfid er 2,2'-dipyridin-disulfid.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 5,
karakterisert vedat det aromatiske disulfid er 4,4-dipyridin-disulfid.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert vedat det tiolaktiverende reagens omfatter en blanding av sulfitt og tetrationat.
10. Anvendelse av en bispesifikk monoklonal antistoff-determinant fremstilt i fremgangsmåten ifølge krav 1-9 for immunologisk bestemmelse av mengden av en ukjent substans i en væskeprøve.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US60312584A | 1984-04-23 | 1984-04-23 | |
| PCT/US1985/000737 WO1985004811A1 (en) | 1984-04-23 | 1985-04-22 | Bispecific antibody determinants |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO855200L NO855200L (no) | 1985-12-20 |
| NO166383B true NO166383B (no) | 1991-04-02 |
| NO166383C NO166383C (no) | 1991-07-10 |
Family
ID=24414191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO85855200A NO166383C (no) | 1984-04-23 | 1985-12-20 | Fremgangsmaate ved fremstilling av bispesifikke antistoff-determinanter. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0179872B1 (no) |
| JP (1) | JPH0617909B2 (no) |
| AT (1) | ATE64622T1 (no) |
| AU (1) | AU595159B2 (no) |
| CA (1) | CA1338828C (no) |
| DE (1) | DE3583278D1 (no) |
| DK (1) | DK169153B1 (no) |
| FI (1) | FI85946C (no) |
| IT (1) | IT1183798B (no) |
| NO (1) | NO166383C (no) |
| WO (1) | WO1985004811A1 (no) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987004164A1 (en) * | 1986-01-06 | 1987-07-16 | The University Of Melbourne | Technetium-antibody conjugate |
| FR2604092B1 (fr) * | 1986-09-19 | 1990-04-13 | Immunotech Sa | Immunoreactifs destines a cibler les cellules animales pour leur visualisation ou leur destruction in vivo |
| FR2608445B1 (fr) * | 1986-12-19 | 1989-04-21 | Muraour Renaud | Embout pour manche de raquette de tennis et autres similaires, et raquette equipee de cet embout |
| EP0301333A3 (en) * | 1987-07-29 | 1992-07-01 | Abbott Laboratories | Liposome based homogeneous immunoassay for diagnostic tests |
| US4971916A (en) * | 1987-07-29 | 1990-11-20 | Abbott Laboratories | Liposome based homogeneous immunoassay for diagnostic tests |
| US5086002A (en) * | 1987-09-07 | 1992-02-04 | Agen Biomedical, Ltd. | Erythrocyte agglutination assay |
| IL87768A (en) * | 1987-09-17 | 1994-12-29 | Agen Ltd | Blood assay including erythrocyte agglutination and reagent for the assay comprising conjugate of erythrocyte binding molecule and analyte binding molecule |
| FI105320B (fi) * | 1988-04-04 | 2000-07-31 | Oncogen | Menetelmä vasta-aineheterokonjugaattien valmistamiseksi, joita käytetään imusoluaktiivisuuden säätelyssä ja diagnoosissa |
| US6010902A (en) * | 1988-04-04 | 2000-01-04 | Bristol-Meyers Squibb Company | Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity |
| SE8804074D0 (sv) * | 1988-11-10 | 1988-11-10 | Pharmacia Ab | Sensorenhet och dess anvaendning i biosensorsystem |
| IT1235349B (it) * | 1988-12-23 | 1992-06-30 | Biodata Spa | Saggio immunologico per determinazioni in fase omogenea |
| US5583003A (en) * | 1989-09-25 | 1996-12-10 | Agen Limited | Agglutination assay |
| TW212184B (no) * | 1990-04-02 | 1993-09-01 | Takeda Pharm Industry Co Ltd | |
| WO2008036802A2 (en) * | 2006-09-21 | 2008-03-27 | Prometheus Laboratories Inc. | Antibody-based arrays for detecting multiple signal transducers in rare circulating cells |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU531777B2 (en) * | 1978-04-05 | 1983-09-08 | Syva Co. | Label/solid conjugate immunoassay system |
| US4233402A (en) * | 1978-04-05 | 1980-11-11 | Syva Company | Reagents and method employing channeling |
| US4474893A (en) * | 1981-07-01 | 1984-10-02 | The University of Texas System Cancer Center | Recombinant monoclonal antibodies |
| US4433859A (en) * | 1981-07-16 | 1984-02-28 | Nl Industries, Inc. | Wellhead connector with release mechanism |
| US4433059A (en) * | 1981-09-08 | 1984-02-21 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Double antibody conjugate |
| DE3262442D1 (en) * | 1981-10-06 | 1985-03-28 | Univ Leland Stanford Junior | Fluorescent conjugates for analysis of molecules and cells |
| US4520110A (en) * | 1981-10-06 | 1985-05-28 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescent immunoassay employing a phycobiliprotein labeled ligand or receptor |
| ES521370A0 (es) * | 1982-04-12 | 1985-04-16 | Hybritech Inc | Un procedimiento para obtener un polidoma. |
| US4470925A (en) * | 1982-05-05 | 1984-09-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies |
| CA1194415A (en) * | 1982-05-05 | 1985-10-01 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies |
| US4446233A (en) * | 1982-05-05 | 1984-05-01 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Homogeneous immunoassay using covalent hybrid antibodies |
-
1985
- 1985-04-22 WO PCT/US1985/000737 patent/WO1985004811A1/en active IP Right Grant
- 1985-04-22 AT AT85902341T patent/ATE64622T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-04-22 AU AU42901/85A patent/AU595159B2/en not_active Expired
- 1985-04-22 EP EP85902341A patent/EP0179872B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-22 DE DE8585902341T patent/DE3583278D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-22 JP JP60501961A patent/JPH0617909B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-23 CA CA000479784A patent/CA1338828C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-04-23 IT IT67383/85A patent/IT1183798B/it active
- 1985-12-19 FI FI855086A patent/FI85946C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-12-20 NO NO85855200A patent/NO166383C/no unknown
- 1985-12-23 DK DK601985A patent/DK169153B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU4290185A (en) | 1985-11-15 |
| DK601985D0 (da) | 1985-12-23 |
| FI855086A0 (fi) | 1985-12-19 |
| DK169153B1 (da) | 1994-08-29 |
| JPH0617909B2 (ja) | 1994-03-09 |
| IT8567383A0 (it) | 1985-04-23 |
| ATE64622T1 (de) | 1991-07-15 |
| FI855086A (fi) | 1985-12-19 |
| CA1338828C (en) | 1997-01-07 |
| FI85946B (fi) | 1992-03-13 |
| EP0179872A1 (en) | 1986-05-07 |
| EP0179872B1 (en) | 1991-06-19 |
| IT8567383A1 (it) | 1986-10-23 |
| EP0179872A4 (en) | 1988-12-22 |
| DK601985A (da) | 1985-12-23 |
| NO166383C (no) | 1991-07-10 |
| NO855200L (no) | 1985-12-20 |
| FI85946C (fi) | 1992-06-25 |
| WO1985004811A1 (en) | 1985-11-07 |
| IT1183798B (it) | 1987-10-22 |
| AU595159B2 (en) | 1990-03-29 |
| DE3583278D1 (de) | 1991-07-25 |
| JPS61501418A (ja) | 1986-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5523210A (en) | Bispecific antibody determinants | |
| CA1216231A (en) | Bispecific antibody determinants | |
| US4470925A (en) | Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies | |
| US4479895A (en) | Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies | |
| NO166383B (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av bispesifikke antistoff-determinanter. | |
| DK167825B1 (da) | Fremgangsmaade og reagenssystem til immunobestemmelse af glycoprotein-analyten hb alc. | |
| JPS58203919A (ja) | 免疫グロブリン半分子および交雑種抗体を製造する方法 | |
| JPH01114758A (ja) | パパインを含まない抗体フラグメント調製物の製造方法 | |
| JPH0322946B2 (no) | ||
| EP0096463B1 (en) | Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies | |
| MXPA06000944A (es) | Composiciones para purificar y cristalizar moleculas de interes. | |
| NO830712L (no) | Homogen immunoproeve med merket monoklonal anti-analytt | |
| JPH04504664A (ja) | 化学反応速度を増進する自己抗体 | |
| JPS63117253A (ja) | 免疫センサ− | |
| JP4780405B2 (ja) | 結合親和性を利用する被検物質の測定方法、及び被検物質の測定のための結合親和性解析の制御方法 | |
| JPS63222257A (ja) | 多抗原同時測定用免疫センサ− | |
| WO1987007147A1 (en) | Method for producing monoclonal antibodies to an immunogenic antibody-antigen conjunction | |
| JPH021555A (ja) | ヒトプロティンｓの免疫学的測定方法、それに用いる測定試薬及びキット | |
| JPH0283398A (ja) | 合成ペプチド、それを用いたヒトＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼの測定キットおよび測定法 | |
| FR2645647A1 (fr) | Procede de dosage de complexes antithrombine-proteases | |
| JPS63151856A (ja) | ヒトプロテインｓに対するモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキット | |
| JPH04131092A (ja) | モノクローナル抗体とこれを産生するハイブリドーマ細胞株、およびこれを用いる免疫学的測定法 | |
| Delkeskamp et al. | Physicochemical and Immunological Basis of Immunoglobulin Heterogeneity | |
| NO171643B (no) | Antistoffer med dobbelte spesifisiteter, deres fremstilling og anvendelse |