JPH021555A - ヒトプロティンｓの免疫学的測定方法、それに用いる測定試薬及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は溶液状態にあるヒト・プロテインＳを免疫学的
に測定する方法、それに用いる測定試薬及びキットに関
する。

更に詳しくは、ヒト補体系制御因子のＣ４ｂｐとプロテ
ィンＳとの複合体を測定することなく、フリーのプロテ
ィンＳのみを特異的且つ高感度に測定することのできる
ヒト・プロテインＳの免疫学的測定方法、それに用いる
測定試薬及びキラ１〜に関する。

（０）従来技術 プロティンＳはプロティンＣと同様にビタミンに依存性
タンパクで、１９７７年ＤｉＳＣｉｐｉＯらによりウシ
とヒトから分離された［ＤｉＳＣｉｌ）１０．　Ｒ，Ｇ
。

Ｈｅｒｍｏｄｓｏｎ、Ｈ，Ａ、　Ｙａｔｅｓ、Ｓ、Ｇ、
　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅ、Ｅ、Ｗ、　；Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、　１６．６９８〜７０６（１９７７）参照］
。ヒト・プロテインＳは血漿中に約１０ｍＭ１含まれ、
分子量６９，０００の一本鎖の糖タンパクである。また
その構造は、他のビタミンに依存性因子の構造とよく似
ており、ＮＨｚ末端に約１０個のγ−カルボキシグルタ
ミン酸（Ｇｌａ）を有している。ヒト・プロテインＳは
血中では２つの形で存在し、１つはフリーのプロティン
Ｓであり、このフリーのものが、活性化プロティンＣの
補助因子として動く。もう１つは、補体系の制御因子で
ある高分子Ｃ４ｂ結合タンパク（ｃ４ｂｐ）と非共有結
合して存在する。このパフリーのプロティンＳ　１１と
“結合しているプロティンＳ　ＩＩの比率はほぼ１：１
とされている。

Ｃ４ｂｐ−プロティンＳ複合体におけるプロティンＳの
機能の重要性は、リン脂質の陰性荷電表面と非常に親和
力が強イｔ−とにある［Ｎｅ　ｌ　５ｅｓｔｕｅｎ、　
Ｇ、　Ｌ。

、Ｋ１５ｉｅｌ、　Ｗ、　ａｎｄ　ＤｉＳｃｉｐｉｏ、
　Ｒ，Ｇ、：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１７・２１３４〜２１３８．　（１９７８）］。細胞が
傷害されたり活性化を受けると、Ｃａ””（７）存在下
でプロティンＳのＧｌａ−ｄｏｍａｉｎはリン脂質に結
合し、更にこのプロティンＳにＣ４ｂｐが複合体を形成
して結合してその機能を発揮するものと考えられている
［Ｄａｈｌｂａｃｋ。

Ｂ、　：　Ｓｅｍ１ｎ、　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏ
ｓｔａｓ、、１０　；　１３９〜１４８（１９８４）］
。

プロティンＳ、プロティンＣの凝固、線溶系に関する機
能については、最近の研究からその制御数構に関して極
めて重要な動きをしていることが解明され、その生理的
意義についても血栓症との関わりで注目されている。プ
ロティンＳの先天性欠乏は血栓症の原因となり得ること
が報告されている［Ｃｏｍｐ、Ｐ、Ｃ，、Ｎ１ｘｏｎ、
Ｒ，Ｒ，、Ｃｏｏｐｅｒ、Ｈ，Ｒ，ａｎｄＥｓｍｏｎ　
　Ｃ，王、：　　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、、
７４　：　２０８２〜２０８８゜（１９８４）］。

したがって、プロティンＳの作用機構を明らかにするこ
と、また、プロティンＳの血中における抗原量、活性量
を測定し、その同行を把握することができれば、それは
基礎医学、臨床医学の領域において非常に重要な意味を
持つと考えられる。

従来知られたプロティンＳの測定方法として、プロティ
ンＳに対する抗血清を用いるローレル法。

ポリクローナル抗体を用いるＩ　ＲＭＡ　（ｉｍｍｕｎ
ｏ−ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙ）及びＥ　Ｉ　
Ａ　（ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏ−ａｓｓａｙ）をあ
げることができるが、これらの方法によって得られた測
定値は、フリーのプロティンＳと、Ｃ４ｂｐと複合体を
形成しているプロティンＳの両者を含めて測定している
ことになる。

そのため従来フリーのプロティンＳのみを測定する方法
においては、検体をポリエチレングリコール水溶液等で
処理しＣ４ｂｐとプロティンＳとの複合体を沈澱させて
除去する必要があった。しかしながら、この測定方法は
、操作が極めて頻雑であるという欠点を有している。

また、モノクローナル抗体は単一の抗原決定基にたいし
て特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗体を安定
的に産生できるという利点から抗原タンパク質の機能及
び構造の解析、あるいは免疫測定（ＥＩＡ、ＲＩＡ）に
近年、−役向に広く利用されるようになってきた。特に
抗原タンパク貿の機能解析２分子解析には抗原タンパク
質の機能に関与する部位、又は特殊な構造部位を認識す
る抗体を見出すことが有力な手段となり得る。

そして、フリーのヒト・プロテインＳの測定方法におい
ても、フリーのプロティンＳと、複合体を形成している
プロティンＳとを区別して認識する２種のモノクローナ
ル抗体を用いて、極めて高い特異性でフリーのヒト・プ
ロテインＳの抗原１等を測定する方法が行われている（
特願昭６１−２９８８８１号参照）。

（ハ）発明が解決しようとする問題点 しかしながら、２種のモノクローナル抗体を用いたフリ
ーのヒト・プロテインＳの測定方法においては、抗原の
特定部位以外とは反応しないというモノクローナル抗体
の特性故に、抗原との親和性が必ずしも十分に高くない
場合があり、より高い感度で、フリーのプロティンＳを
測定することのできるプロティンＳの免疫学的測定方法
が望まれていた。

（−）問題点を解決するための手段 そこで本発明者らは、かかる従来技術の問題点に鑑みて
、溶液状態にあるフリーのヒト・プロテインＳを容易に
且つ高感度で測定し得る測定方法。

測定試薬及びキットを開発するべく鋭意検討した結果、
Ｃ４ｂｐとプロティンＳとの複合体は認識せず、フリー
のヒト・プロテインＳを特異的に認識して結合し得るモ
ノクローナル抗体と、ヒト・プロテインＳを特異的に認
識し、抗原との親和性が高いポリクローナル抗体とを組
合せることにより、高い特異性及び高感度でフリーのヒ
ト・プロテインＳを容易に測定しくｑることを見出し本
発明に到達した。

すなわち本発明は、 １、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とを用いてヒ
ト・プロテインＳの免疫学的測定を行うに際し、いずれ
か一方の抗体としてヒト・プロテインＳを特異的に認識
するポリクローナル抗体を用い、他方の抗体としてヒト
補体系制御因子のＣ４ｂｐとプロティンＳとの複合体は
認識せず、フリーのヒト・プロテインＳを特異的に認識
して結合し得るモノクローナル抗体を用いることを特徴
とするヒト・プロテインＳの免疫学的測定方法。

２、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とからなり、
いずれか一方の抗体がヒト・プロテインＳを特異的に認
識するポリクローナル抗体であり、他方の抗体がヒト補
体系制御因子のＣ４ｂｌ）とプロティンＳの複合体は認
識せず、フリーのヒト・プロテインＳを特異的に認識し
て結合し得るモノクローナル抗体であるヒト・プロテイ
ンＳの免疫学的測定用の測定試薬、及び ３、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とからなり、
いずれか一方の抗体がヒト・プロテインＳを特異的に認
識するポリクローナル抗体であり、他方の抗体がヒト補
体系制御因子のＣ４ｂｐとプロティンＳとの複合体は認
識せず、フリーのヒト・プロテインＳを特異的に認識し
て結合し得るモノクローナル抗体であるヒト・プロテイ
ンＳの免疫学的測定用の測定試薬と、これに（ａ）溶解
剤、（ｂ）洗浄剤及び酵素で標識化した抗体を用いる場
合には、（ｃ）酵素活性を測定するための基質及びその
反応停止剤を組合せてなるヒト・プロテインＳの免疫学
的測定用のキラである。

一般に抗原の２つの異なる部位に結合する抗体を用いて
抗原の有無又はその量を測定する方法は、リンドイッチ
法と呼ばれ、例えばワイド（Ｗｉｄｅ）の「放射線免疫
検定法（Ｒａｄ　ｉｏ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙＭｅｔ
ｈｏｄｓ）ｊ　１９９〜２０Ｂ（１９７０）に記載され
ている。

本発明のヒト・プロテインＳの免疫学的測定方法におい
ては、抗原の２つの異なる部位に結合する２種類の抗体
として、ヒト・プロテインＳを特異的に認識するモノク
ローナル抗体とポリクローナル抗体を使用し、そのモノ
クローナル抗体としてはヒト補体系制御因子の１つであ
るヒトＣ４ｂ結合タンパク（ｃａｂｐ）とヒト・プロテ
インＳの複合体を認識せず、フリーのヒト・プロテイン
Ｓを特異的に認識して結合し得るモノクローナル抗体を
使用し、ポリクローナル抗体としてはヒト・プロテイン
Ｓを特異的に認識して結合する抗ヒト・プロテインＳ抗
血清の抗体成分を使用する。

次に本発明によるヒト・プロテインＳの免疫学的測定方
法、それに用いる測定試薬及びキットを具体的に説明す
る。

ヒト・プロテインＳの免疫学内側　方法；ヒト・プロテ
インＳに対するポリクローナル抗体（第１抗体）を適当
な不溶性担体（例えばプラスチック容器）に固定化する
（以下これを“固定化抗体″という）。ついで不溶性担
体と測定しようとする試薬又は検体試料との非特異的結
合を避けるために適当な物質（例えば牛血清アルブミン
）で不溶性担体の表面を被覆する。

このようにして得られた第１抗体が固定化された不溶性
担体を検体試料と一定時間及び温度で接触させ反応させ
る。この間に固定化抗体（第１抗体）と検体試料中のヒ
ト・プロテインＳが結合する。ついで適当な洗浄液で洗
った後、適当な標識物質（例えば酵素）で標識したヒト
・プロテインＳに対するモノクローナル抗体（第２抗体
）の溶液（例えば水溶液）を、不溶性担体における固定
化抗体に結合したヒト・プロテインＳと一定時間及び温
度で接触させ第２抗体と反応させる。これを適当な洗浄
液で洗い、次いで不溶性担体上に存在する第２抗体に標
識された標識物質の量を測定する。

なお上記反応は、固定化抗体、標識抗体及びヒト・プロ
テインＳを含有する検体試料を同時に混合し、一定時間
及び温度でこれら王者を同時に接触させて反応させるこ
ともできる。

かくしてその値から検体試料中のフリーのヒト・プロテ
インＳの量を算出することができる。

測−試薬及びキットの構成 ヒト・プロテインＳの免疫学的測定用の測定試薬は、上
述した不溶性担体に結合した抗体と、標識抗体とからな
る。

また、ヒト・プロテインＳの免疫学的測定用のキットは
、上記の測定試薬と、これら測定試薬を能率よく且つ簡
便に利用するための補助剤として、例えば固体状の試薬
又は液状の検体を溶解させるための溶解剤、不溶性担体
に結合した抗体を洗浄するために使用される洗浄剤、及
び酵素で標識化した抗体を用いる場合には、酵素活性を
測定するための基質及びその反応停止剤、その他の免疫
学的測定用のキットとして通常使用されるものが挙げら
れる。本発明の測定方法、測定試薬、又は測定用キット
には、非特異的反応を低下させ高感度に測定するために
、界面活性剤１体液ないしはタンパク溶液、スキムミル
ク等、なかでもスキムミルクを添加することができる。

本発明のヒト・プロテインＳの免疫学的測定方法等に使
用される不溶性担体としては、例えばポリスチレン、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアク
リルニトリル、弗素樹脂。

架橋デキストラン、ポリサンカライドなどの高分子、そ
の他紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合せ
などを例示することができる。

また不溶性担体の形状としては、例えばトレイ状６球状
、ｌ雄状、棒状、盤状、容器状、セル。

試験管などの種々の形状であることができる。

また、標識抗体の標識物質としては放射性物質。

酵素又は蛍光物質を使用するのが有利である。放射性物
質としては　　１．１．Ｃ，Ｈなどを、酵素としてはア
ルカリ性フォスフ？ターゼ。

パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなと、ま
た蛍光物質としてはフルオレッセインイソチオシアネー
ト、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどを
使用することができるが、これらは例示したものに限ら
ず、免疫学的測定方法に使用されているものであれば、
他のものでも使用できる。

本発明のポリクロルナル抗体は、従来公知の方法でヒト
・プロテインＳを抗原として動物に免疫して得られる抗
ヒト・プロテ、ｒンＳ抗血清の抗体成分として得られる
ものが挙げられる。なかでも例えば山羊抗ヒト・プロテ
インＳ−ポリクローナル抗体、兎抗ヒト・プロテインＳ
−ポリクローナル抗体等が好ましく挙げられる。

本発明に使用されるモノクローナル抗体及びその製造方
法については、先に出願された特願昭６１−２９６７６
６号（昭和６１年１２月１５日出願：発明の名称“モノ
クローナル抗体、ハイブリドーマ。

モノクローナル抗体の製造方法及びヒト・プロテインＳ
の分離方法°′）の特許出願明細書に詳細に説明されて
いる。

（ホ）発明の効果 本発明により、溶液状態（例えば血漿中）のフリーのヒ
ト・プロテインＳを挟雑物の影響を受けることなく高い
特異性及び高い感度で容易に測定することができる。

また、本発明によりＣ４ｂｐとプロティンＳとの複合体
の共存下においてもフリーのヒト・プロテインＳを正確
かつ迅速に測定し得るという、従来には存在しなかった
試薬及びキットが提供される。

へ）実施例 以下、実施例により本発明を詳述する。実施例中の％は
重量％を意味する。

参考例１　抗ヒト・プロテイン５（ＰＳ）モノクローナ
ル抗体の製造及び精製 Ｍ製したヒト・ＰＳを雌のＢａ１ｂ／Ｃマウス（４回前
）２匹に対して１４日間隔で４回免疫した。初回の免疫
はＰＢＳに溶解した。５０μｇのヒト・ＰＳを等量の７
０インドの完全アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒ
ｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合し、そのエマ
ルジョンを、腹腔内に投与した（０．５ｍＱ　／ｈｅａ
ｄ）　、２回目、３回目は、同じ＜５０／ｌのヒト・Ｐ
Ｓをフロイントの不完全アジュバンＩ〜（Ｆｒｅｕｎｄ
’ｓ　ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕＶａｎｔ）と混
合し、同じく腹腔内に投与した。最終免疫は３０μ０の
ヒト・ＰＳｆｊ：ＰＢＳ溶液のまま、マウス尾静脈から
追加投与した。最終免疫の３日後に免疫したマウスの牌
臓細胞を細胞融合に用いた。

免疫したマウスのｍｆｌｉｌ細胞と、同系マウスの骨髄
１１ｉｉ１　（Ｐ２Ｏ３）　ヲ約２：１〜約１５：１の
割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５４０
　（和光紬薬（製））を融合促進剤としてＫｏｈｌｅｒ
とＨｉｌｓｔｅｎの方法に従い細胞融合を行った。融合
復の細胞は、Ｉ　Ｘ１０６　ｃｅｌｌｓ　／ｄの細胞濃
度となるように１０％ＦＣ３−−ＲＰＨＩ−１６４０培
地に懸濁し、９６ｗｅ　Ｉ　ｌ　ｓマイクロプレート（
ｃｏｓｔｅｒ）に１ウエルあたり１００μβずつ分注し
た。

融合細胞は、ＣＯ２インキユベータ−（５％Ｃ０２。

３７°Ｃ）中で培養し、ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン；チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で培地交換を行
い、）−ＩＡＴ培地中で増殖させて、牌臓細胞と、骨髄
腫細胞から成るハイブリドーマのスクリーニングを行っ
た。

ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ヒト・ＰＳを
コーティングしたマイクロタイタープレートを用いＥＬ
ＩＳＡ法により検出した。第２抗体には、アルカリホス
ファターゼ標識ウリ゛ギ抗マウスＩｇＧ抗体を用い、抗
原ＰＳに対する結合性を調べた。融合細胞をまいた合計
４９４のウェルのうち、４８７のウェルにコロニーの形
成が認められ、このうち抗原ＰＳに対して結合性を示す
抗体産生陽性ウェルは９４ウエルであった。

これらの抗体産生陽性ウェルのうち４つのウェルについ
て限界希釈法によるクローニングを２回繰り返して行い
、６個のクローンを得た。得られたクローンは、９０％
ＦＣ３−ｔｏ％ＤＭＳＯ中に懸濁させ液体窒素中に保存
した。

各クローンの産生ずるモノクローナル抗体をりローンを
Ｂａ１ｂ／Ｃマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプ
ロティンＡ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂカラムを用
いて精製した。

第　１　表　（細胞融合） 参考例２　精製したモノクローナル抗体の性質マウス腹
水から精製した各クローンのＩＱＧについてクラス及び
ヒト・プロテインＳに対する結合性を調べた。

マウスモノクローナル抗体のクラスは、各クラス特異性
の抗マウス抗血清を用いて、オフタロ二法により決定し
た。

この結果を下記第２表に示した。

ヒト・プロテインＳに対する結合性は、マイクロタイタ
ープレートに固相化したヒト・プロテインＳと適当な濃
度になるように希釈したモノクローナル抗体とを反応さ
せ、アルカリ性フオスファクタービ標識化したヤギ抗マ
ウスＩｇＧで検出することにより評価した。

その結果６種類のモノクローナル抗体のヒト・プロテイ
ンＳに対する結合の強さは、２８９Ｆ１２〜２Ｂ９Ｃ１
０＞３Ｃ３Ｇ８　＞３Ｃ４Ｇ４　＞２８９Ｇ３　＞＞２
Ｅ１２Ｃ７であることが判明した。

第２表　モノクローナル抗体のクラス 参考例３　ヒトＣ４ＢとプロティンＳ複合体に対する反
応性 精製した前記６種類のモノクローナル抗体を１０μｇ／
ｍｆｌの濃度でマイクロタイタブレートにコテイングし
、１％ＢＳＡでＢｌｏｃｋｉｎｇ後、適当な濃度になる
ように希釈したヒト健常人血漿を加え、血漿中のＣ４ｂ
ｐ−プロティンＳ複合体とモノクローナル抗体とを反応
させた。次に、アルカリ性フォスファターゼ標識化した
抗Ｃ４ｂｐ抗体を加え、６種類のモノクローナル抗体の
Ｃ４ｂｐ−プロティンＳ複合体に対する結合性を検出し
、調べた。

その結果、モノクローナル抗体２Ｅ１２Ｃ７は、フリー
のプロティンＳに対しては非常に結合性が弱いが、Ｃ４
ｂｐ−プロティンＳ複合対に対しては、高度に特異的に
結合性を示し、６種類のモノクローナル抗体のＣ４ｂｐ
−プロティンＳ複合体に対する結合の強さは、２Ｅ１２
Ｃ７＞　＞　２８９Ｆ１０〜２Ｂ９Ｃ１２＞３Ｃ３Ｇ８
　＞３Ｃ４Ｇ４　＞２８９Ｇ３であることが判明した。

参考例２及び３で示されるように、Ｃ４ｂｐとプロティ
ンＳとの複合体は認識せず、フリーのヒト・プロテイン
Ｓを特異的に認識して結合し得るモノクローナル抗体と
して２８９Ｆ１２及び２８９Ｃ１０が得られた。

実施例１ （１）抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ（直径５ｍｍ）を、山羊抗ヒト・
プロテインＳ抗体（ポリクローナル抗体：ＡｍｅｒｉＣ
ａｎ　ＤｉａｇｎＯＳｔｉＣａ社製）の２０ｕｇ／ｒｒ
ｄ；ｌの濃度を有するｐＨ７，４の０．０１）１リン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に４°Ｃの温度で１昼
夜放置した後、ＰＢＳで洗浄してから０．５％牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）水溶液中に４℃の温度で１昼夜放置
してポストコーティング処理を実施することにより抗体
固定化ビーズを得た。

（２）ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ＃！識モノ
クローナル抗体の調製 フリーのヒト・プロテインＳを特異的に認識するモノク
ローナル抗体（２８９Ｆ１２）の１．０１＋１（１／１
ａｌｌのＰＢＳ溶液１．Ｏｄに、Ｎ−（ｍ−マレイミド
安息香１）　−Ｎ−サクシンイミドエステル（Ｍｉｓ）
の１０ｍ０／ｄのジメチルホルムアミド溶液５０μｌを
添加し、２５℃の温度で３０分間反応させた後、セファ
デックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１）１
リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）でゲルか過を行い、マレイ
ミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した
。

一方、ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
）の１．０ＩＩｌｌＪ　／ｒｎ１のＰＢＳ溶液２．Ｏｄ
に、Ｎ−サクシンイミジルー３−（２−ピリジルチオ）
プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１０１１０１ｌ１エタノ
ール溶液を添加し、２５℃で３０分間反応させた後、セ
ファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．０
１Ｈ酢酸緩衝液（１）８４．５）でゲル濾過して精製し
、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する両分を採取
してコロジオンバック中で水冷下に約１０倍に濃縮した
。次に、これに０．８５％ＨａｃＩ！と０．１８ジチオ
スレイトールとを含有する０、　１８酢酸緩衝液（ｐＨ
４，５）１７！を添加して、２５℃で３０分間攪拌して
ＨＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元
した後、セファデックスＧ−２５カラムを用い、０．１
）１リンｒ！ｉ緩衝液（ｐＨ６，０）でゲルン濾過して
、チオール化ＨＲＰを含有する両分を得た。

次に、得られたマレイミド化モノクローナル抗体とチオ
ール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて水
冷下に４ｍＱ／ｒｒｄｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃
で１昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４　　（仏
、ＬＫＢ社製）を充填したカラムを用いてＰＢＳでゲル
濾過することによりＨＲＰ標識モノクローナル抗体を得
た。

（３）ヒト・プロテインＳの測定 山羊抗ヒト・プロテインＳ抗体を固定化したビーズ６１
個と精製したヒト・プロテインＳを０゜５０、１００．
２００．４００ｎｇ／ｄの各濃度で含有する０、１％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳ溶液（１）８７．４）２００μｌと、Ｈ
ＲＰ標識モノクローナル抗体を含有する０、１％ＢＳＡ
含有ＰＢＳ溶液（１）Ｈ７，４）　２００μｌとを各試
験管（ｎ＝２＞に添加して３７℃の温度で１時間インキ
ュベートした。

次に、試験管内の溶液を吸引除去した後、ＰＢＳで２回
洗浄し、試験管を交換してから、テトラメチルベンジジ
ン塩酸塩０．０２％及び過酸化水素０．００５％を含有
する０、１）１リン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ４，０）
を４００μβずつ各試験管に加え、３７℃の温度で３０
分間インキュベートした後、反応停止剤として０．１％
ＮａＦ及び２％酢酸を含有する水溶液１ｍｉを各試験管
に加えて酵素反応を停止させた。

次いで、この溶液を分光光度計を用いて６５０ｎｍの波
長の吸収強度を測定し、これをヒト・プロテインＳ抗体
度とプロットすることにより、濃度依存性を有するヒト
・プロテインＳ濃度測定用の検量線を得た（第１図参照
）。

血漿検体中のヒト・プロテインＳの濃度測定として、正
常混合人血漿を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐ１１
７．４）で５０倍に希釈した溶液２００μｌを、抗体固
定ビーズ及び１（ＲＰＩ識モノクローナル抗体溶液２０
０μｌと共に試験管に加え、上記と同様にして免疫反応
及び発色反応を行った後、分光光度計にて吸光光度を測
定した。この値を第１図の検量線を用いて血漿中の濃度
に換算したヒト・プロテインＳ濃度を求めた結果、血漿
中濃度は１０．４μ（］　／ｍｇであった。

実施例２ 山羊抗ヒト・プロテインＳ抗体の代りに兎抗ヒト・プロ
テインＳ抗体（ポリクローナル抗体：Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃａ　ｓｔａｇｏ社製）を用いた伯は実施例１と同様
の方法で調製した、兎抗ヒト・プロテインＳ抗体固定ビ
ー１８１個と精製したヒト・プロテインＳｉ、　５０．
１００．２００．４００ｎＭｄの各濃度で含有する０、
５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐｉｆ７．４）２００μｌ
と、実施例１と同様の方法で調製したＨＲＰ標識マウス
抗ヒト・プロテインＳ−モノクローナル抗体を含有する
０、５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ７，４）　２００
μ、（とを各試験管（ｎ＝２＞に添加して３７℃の温度
で１時間インキュベートした。

以降、実施例１（３）と同様に処理してテトラメチルベ
ンジジン塩蔵塩０．．０２％及び過酸化水素０．００５
％を含有する０、１Ｈリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ４
，’ｏ）を４００μβずつ各試験管に加え、３７℃の温
度で３０分間インキュベートした後、反応停止剤として
０．１％ＮａＦ及び２％酢酸を含有する水溶液１ｄを各
試験管に加えて酵素反応を停止させた。

次いで、この溶液を分光光度計を用いて６５０ｎ…の波
長の吸収強度を測定し、これをヒト・プロテイン８８度
に対してプロットすることにより、基線の吸収強度が０
．１５と若干高いものの濃度依存性の良い検量線が得ら
れた。

実施例３ ヒト・プロテインＳを夫々４．０．８．０μｇ／ｄの濃
度で含有する試料を、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（
１）Ｈ７，４）で５０倍に希釈する際にＤａｈｌｂａｃ
ｋ［Ｄａｈｌｂａｃｋ、Ｂ、、　Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　ｉ
ｎ　　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　＆Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ
　；　１０　：　１３９〜１４８　（１９８４）］の方
法で分離したＣ４ｂｐ−プロティンＳ−複合体を、希釈
前のＳ度が夫／？６０．１２０．２４０．３６０．４８
０／ｌ　／ｄ（７）濃度になるように添加した。

次に、この各溶液を試料に用いて実施例１と同様の方法
でヒト・プロテインＳの濃度を測定した。

その結果、試料中のヒト・プロテインＳの濃度はＣ４ｂ
ｌ）〜プロティンＳ−複合体の存在しない場合の濃度と
測定誤差範囲内で同一であり、本測定方法はＣ４ｂｐ−
プロティンＳ−複合体を測定することなく、フリーのヒ
ト・プロテインＳのみを選択的に測定することが認めら
れた（第２図参照）。

比較例１ 実施例１における抗体固定ビーズの作製において、山羊
抗ヒト・プロテインＳ−ポリクローナル抗体の代りにマ
ウス抗ヒト・プロテインＳ−モノクローナル抗体（２８
９Ｃ１０）を用いる他は実施例１と同様の方法で作製し
た、マウス抗ヒト・プロテインＳ−モノクローナル抗体
を固定したビー１８１個と精製したヒト・プロテインＳ
を、０．５０゜１００、２００．　４００ｎ（１／ｍ＋
２の各濃度で含有する０、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（
１）ｌ−１７，４）　２００μｌと、実施例１と同様の
方法で作製したＨＲＰ標識マウス抗ヒト・プロテインＳ
−モノクローナル抗体（２８９Ｆ１２）を含有する０、
１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（１）Ｈ７，４）　２００１
１１とを各試験管（ｎ＝２）に添加して３７°Ｃの温度
で１時間インキュベートした。

以降、実施例１（３）と同様に処理して、テトラメチル
ベンジジン塩蔵塩０．０２％及び過酸化水素０、００５
％を含有する。、　ｉＨリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ
４，０）を４００μｌずつ各試験管に加え、３７℃の温
度で３０分間インキュベートした後、反応停止剤として
０．１％ＮａＦ及び２％酢酸を含有する水溶液１ｍｌを
各試験管に加えて酵素反応を停止させた。

次いで、この溶液について分光光度計を用いて６５０止
の波長の吸収強度を測定し、これをヒト・１０７４２８
ｍ度に対してプロットして、プロティンＳ測定用検量線
を得た（第３図参照）。

本発明の第１図と比較すると明らかなように、この検量
線は基線が吸光度０．２と高く、また１０７４２８ｍ度
２００ｒｌ（１／ｄの吸光度は０．３８と比較的に低い
値を示している。そして検温線の勾配が極めて緩やかな
ために、プロティンＳ測定の測定感度が不十分になって
しまうので、測定系としては好ましくないと判断される
。これはプロティンＳに対するモノクローナル抗体の抗
原親和性が十分には高くないためと考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の測定方法（実施例１）におけるヒト
・プロテインＳ測定用の検量線を示している。 第２図は本発明の測定方法（実施例３）におけるヒト・
プロテインＳの測定において、Ｃ４ｂｐ−プロティンＳ
−複合体を共存させて測定した結果を示している。図中
、−〇−は、試料中のヒト・プロテインＳ濃度　８．０
μＧ　／ｄ、−・−は試料中のヒト・１０７４２８８度
　４、ＯμＯ／ｄを表わす。 第３図は、本発明のポリクローナル抗体の代りにマウス
抗ヒト・プロテインＳモノクローナル抗体を用いた測定
方法（比較例１）におけるヒト・プロテインＳ測定用の
検量線を示している。 ０４−４Ｐ−１’５Ｃｏｄムベ漆加ｔ　９ａｑ／−１）
′＄目η ヒ４−アＯティン５ＣＰ！；”）’ラリ１１り二［ｆｌ
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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とを用いてヒ
   ト・プロテインＳの免疫学的測定を行うに際し、いずれ
   か一方の抗体としてヒト・プロテインＳを特異的に認識
   するポリクローナル抗体を用い、他方の抗体としてヒト
   補体系制御因子のＣ４ｂｐとプロテインＳとの複合体は
   認識せず、フリーのヒト・プロテインＳを特異的に認識
   して結合し得るモノクローナル抗体を用いることを特徴
   とするヒト・プロテインＳの免疫学的測定方法。 ２、不溶性担体に結合した抗体が、山羊及び／又は兎抗
   ヒト・プロテインＳ−ポリクローナル抗体であり、標識
   抗体がマウス抗ヒト・プロテインＳ−モノクローナル抗
   体であることを特徴とする請求項１記載のヒト・プロテ
   インＳの免疫学的測定方法。 ３、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とからなり、
   いずれか一方の抗体がヒト・プロテインＳを特異的に認
   識するポリクローナル抗体であり、他方の抗体がヒト補
   体系制御因子のＣ４ｂｐとプロテインＳの複合体は認識
   せず、フリーのヒト・プロテインＳを特異的に認識して
   結合し得るモノクローナル抗体であるヒト・プロテイン
   Ｓの免疫学的測定用の測定試薬。 ４、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とからなり、
   いずれか一方の抗体がヒト・プロテインＳを特異的に認
   識するポリクローナル抗体であり、他方の抗体がヒト補
   体系制御因子のＣ４ｂｐとプロテインＳとの複合体は認
   識せず、フリーのヒト・プロテインＳを特異的に認識し
   て結合し得るモノクローナル抗体であるヒト・プロテイ
   ンＳの免疫学的測定用の測定試薬と、これに（ａ）溶解
   剤、（ｂ）洗浄剤及び酵素で標識化した抗体を用いる場
   合には、（ｃ）酵素活性を測定するための基質及びその
   反応停止剤を組合せてなるヒト・プロテインＳの免疫学
   的測定用のキット。