JPS61115498A - 粒子凝集を用いた酵素活性の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 投前分封 本発明は孜状恢体中の酵素活性を検出するための板子凝
集に基づく診断方法に関する。

′　背」ｉ七ゴゴとｔト了 酵素ンその基質と反応させると生成物を生ずることｒｉ
矧り才している。酸系は基質との反応で消費さＧずに生
槙勿を更に繰返し目出に生成するので真の触媒である。

生ｂｘ物の生成連層はターンオーバー＆ｌ　（ｔｕｒｎ
ｏｖｅｒ　ｎｕｍｂｅｒ）と呼ばれ。

階ぷごとに異なったｋｌ、値である。実際には、酵素活
性は酵素ターンオーバーの帖釆として変化する基質ｌた
け主成物の分光光度測定法による吸光度を七ニターする
ことにより秘めて都合よく慎重される。一部の天然に存
在する基質２よび／よｌζはそれらの相対応する主成物
は容易に利用しうる吸光度ピークをもたないため静系活
性の分光光度法慎重が田畑となることが知りれている。

場合によっては酢木活性検出のために合成基質を設計す
ることができる。

合成基質は発色性または発榮光性となるよう。

すなわち、酵素によシ触媒された場合に光学的に検出可
能な基質２よび／または生成勿の変化が生じるように設
計することができる。酵素活性慎重目的に合成基質を用
いる際の戚も顕著な制約はかかる基質を所望の酵素に対
し必ずしも製造し得ない点である。有用な合成基ｆ全通
正に設計するには谷々特定の酵素の触媒的諸性質を詳細
に知る必要がある。例えば、トロンビンまたは因子Ｘａ
に対する合成発色性基質がトロンビンまたは因子Ｘａ活
性の伏型用に設ｇｔされている。これらの合成基′Ｒｒ
ｉ、これら酵素の発色に基づく恢定法において天然Ｍ８
質のフイブリノーゲンに置き代わるものでｂる。

板分町＋ｍ　（ａｎａｌｙｔθ）を検出するためのイム
ノアッセイは却られている。いわゆる不均質（ｈｅｔａ
ｒｏｇｅｎｏｕ日）イムノアッセイは当該被分析物と夷
賞的に同じ抗体に対する免疫学的性質を有する標識抗原
の存在下に抗体を被分析物とインキュベートすること’
ｌうことがめる。抗体に結合するかめるいは溶液中に遊
離している標識抗原の童を、適当な分離手順を踏んだ後
に、被分析物の存在量の尺度として測定する。このよう
な恢定法は、破初にＲ，Ｓ、Ｙａｌｏｗおよび８．Ａ。

Ｂｅｒｓｏｎにより１９５９年（［ＮａｔｕｒｅＪ　１
８４　：　１６４８）に報告された。ラジオイムノアッ
セイ（放射免疫測定法）と呼ばれるこの検定法は標識と
して放射性核種を利用した。貯蔵上、取扱い上そして安
全上自明な問題のある放射性核種に代わって標識として
醇索を用いたことがｖａｎ　ｅｓｍθｎおよび５ｃｈｕ
ｕｒｓによりｗ告された（「ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒａ
Ｊ。

１５巻、２５２（１９７１）ｊ？よび米国％計第３，７
９１．９５２号明細４１参照〕。この技術にはｖａｍ　
Ｗｅｅｍｅｎ　　＆よび５ｃｈｕｕｓの基本テーマに基
づく多くのバリエーションがみられる。

多エピトープ性抗原物質□が多エピトープ受谷体を有す
る粒子を凝集して凝集体ｒ生成しうろことは知られてい
る（たとえばそれぞれインフルエンザウィルス２よびヒ
ツジ赤血球）。これらの凝集体は光散乱型測定器を用い
て検出できる。液状検体中の抗原２よびハプテンを検出
するための凝集阻害検足法が刈られている。典型的には
、抗原またはハプテンで被覆された高屈折性粒子と多価
抗体の結合が検体中の抗原またはハブテンにより拮抗的
に阻ｇ１れる（米国→　　　゛許第４，４０１，７６５
号明細舊参照）。これらの恢定法の感度は一般に１０−
７〜１０−９Ｍの幽度範囲の抗原２よびハブテンに限ら
ｎる。

開素を標識として用いるイムノアッセイでな２も問題な
のは　ｔｏ−１０Ｍ以下の濃度の被分析物は比軟的短時
間、典型的には３０分以下、好ましくは１０分以下で検
出できない点である。高ターンオーバー数の酵素が信号
発生を最大にするために標識として用いられている。か
かる酵素にはＩ−ガラクトシターゼ、西洋ワサビベルオ
キノダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオ
キンダーゼ、β−ラクタマーゼ２よびウレアーゼが含ま
れる。発色性基質をこれら酵素を用いれば感度を約１０
−１１１Ｍとすることができる。発螢光性基質を用いれ
ば一段と大きな感度が得しれよう。しかしながら１丁ぺ
ての生物学的仄不は全螢光性基質測定と干渉しうる螢光
物質、例えばポルフィリンを含有する。この欠点は、付
加的な恢体処理、詳細には、結合物を酵素ｍ識コンプレ
ックスから分離することによシ克服できる。干渉性の螢
光物置はこの分離の際に除去されうるが、結合酵素ｇ４
械コンプレックスのみの測定しか行えないという制約が
ある。

酵素便用高感度イムノアッセイは、高ターンオーバ数の
酵素および合成基ばを用いたとしても至適感度を得るの
にｖ′ｉ、検出可Ｈ目なレベルの酵素的に生成する発色
団または螢光発生間の発生に望ましくない時間、すなわ
ち大ざっばにいって３０〜９０分が必要とされる。

当技術分野では検体中の低レベルの酵素活性を短時間、
典型的には１０分以下で検出する方法が常に要請されて
いる。天然または合成基質のいずれからも容易に測定し
うる生成物が生じない場合の酵素活性を測定する方法に
対しても要晶青がある。

発明の開示 前述の要請は本発明によって満たされる。すなわち、本
発明ｄ４１の一点においては、（ＩＨ＋）　　ｌ）ガン
トを上に付着した高屈折性粒子、（ｉｉ）そのリガンド
に対し特異的で少くとも２つのリガンドに結合しうる結
合パートナー（該結合パートナーとリガンドとは凝集を
０Ｔ能にする濃度で存在させる）、および（＋ｉｉｌ　
　酵素の４’ｊ［（酵素、基）Ｘ％　リガンドおよび結
合ノ々−トナーは、ｌ！ｌ）：素と基質との反応により
結合ノ４−トナーに対してリガンドと拮抗する生成物が
生成するようなものとする） よりなる凝集糸を形成し、 （２）　　前記凝集系を検体と接触させて結合パートナ
ーに対しリガンドと拮抗する生成物を生成させ、 （３）　　＋１σ記凝果糸の物性（その力性は凝集の関
数である）を測定し、そして （４）測定頭を検体中に最初に存在していた評索童に関
連づけること よりなる敵状検体中の酵素を検出するための凝集に基づ
く方法である。

第２の観点では、不発明は、 （１）　　酵素と被分析物に結合しうる第１結合パート
ナーとよりなる接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に検体ｆ
！：接触させ、それによって接合体の一部は被分析物に
結合させて複合体を形成させそして接合体の一部は遊離
状態とし、 （２）その遊ＩＩｍ接合体を複合体から分離し、（３）
遊離接合体または複合体のいずれかを、（＋）　　ＩＪ
ガントを上に付着した高屈折性粒子、　　　　（（ｉｉ
）　　少くとも２つのリガンドに結合しうる第２結合パ
ートナー（該第２結合パートナーとリガンドとは凝集を
可能にする一部が存在せしりるン、および （ｉ＋ｉ）　　屏パのｆｊ實（酵素、基質、リガンドお
よび第２結甘パートナーは、酵素と基質との反応によシ
第２結合パートナーに対してリガンドと拮抗する生成物
が生成するようなものとする） よジなる梁果糸を接触させ （４）１縦果禾の力性（その物性は凝集の関数である）
を測定し、そして （５）測定頭を液状検体中に最初に存在していた板分析
物重に関連づける ことよりなる、液状検体中の被分析物を検出するための
凝集に基づく測定方法である。

第６の１説点において１本発明は （１）（ｉｌ　　岬系と反応した際にリガンドに転化さ
れうる示負を上に４覆せしめた制屈折性粒子、および （ｉｉ）少くとも２つのリガンドに超会しつるが基質に
は結会しえない結合パートナー よりなる凝集系を形成し、 （２１該凝集系を検体と接触させて基質をリガンドに転
化し。

（６）該凝集糸の物性（それは凝集の関数である）を測
定し、そして （４）　　測だ埴を検体中に最初に存在していた酵素量
に関連づける ことよりなる液状検体中の酵素を検出するための凝集、
に基づく方法である。

第４の観点において、本発明は （１）酵素と被分析物に結合しうる第１結合パートナー
とよりなる接合体に検不全接触させ、それによって接合
体の一部Ｖｉ被分町吻に結合させて複合体を形成させ、
そして接合体の−部Ｖ′ｉ澄喘状、四とし。

（２１−ｔの遊端接合体を榎曾俸から分離し、（６）遊
離接合体または複合体のいずれかを。

（ｉ）　　Ｉ＃Ｘと成心した際にリガンドに転化されう
る基質を上に４覆せし６ｒ）７と高屈折性粒子。

および （ｉｉ）　　少く七も２つのリガンドに結合しうるが基
質には結合しえない結合パートナー よジなる凝集系を接触させ、 （４）　　凝集系の物性（それは凝集の関数である）を
測定し、そして （５）測定値を検体中に最初に存在していた醇素坩に関
連づける ことよりなる液状検体中の被分析物を検出するｆｃｅｏ
の宣果に基づく方法である。

本発明の評細な−Ｉ述 阻ｄ方式において、不発明は結合ｏＴＮ＠な＊質。

すなわちリガンドを表面に有する高屈折性粒子よりなる
凝集糸上用いる。リガンドに対し特異反応性を有する結
合パートナーを高屈折性粒子と反応させる。その結合パ
ートナーは多価、すなわち、少くとも２つのリガンドと
結合することがでさる。結合パートナーは高屈折性粒子
の実質的凝集を与える濃度で用いられる。凝集が生じる
のは多価結合パートナーが架橋剤として働いて２つの粒
子を連結するからである。凝集系はまた検出すべき酵素
の基質を含有する。基！　、酵素およびリガンドは作用
トリオ（ｏｐｅｒａｔｉｏ狐１ｔｒｉｏ）全１ｔｒｉｏ
うに選択されなければならない。

詳細には、検出すべき酵素が与えられた場合。

そのリガンドは、酵素−基質反応の生成物と実質的に同
じ結合パートナーに対する性ｉｔ有丁　　　　。

るように選択しなければならない。この条件は、酵素−
基質反応の生成物が結合パートナーに対してリガンドと
拮抗し、それによって凝集反応への参画に利用しうる結
合パートナー蓋が減少することを保証する。操作にあた
っては、検体を凝集系と接触させそしてその後の凝集阻
害量を酔素不含対照例と比較して測定する。−観点にお
いて、師累は浴液中遊離状態とすることかで＠、でして
醇素磁は直接凝集かまたは凝集阻害のいずｎかによって
測定できる。あるいｒｉまた。酵素は仇俸分子、抗原ま
たはノ・ブテン分子、ｕｄプローブなどへの標識であっ
てもよく、その場合には、凝集阻害がそれが標識として
働く物質の直接の尺度となる。俊者のケースの一例とし
て、被分析物含有検体を酵素と被分析物と反応性の結合
パートナーとの接合体と、並触させる。この接合体は、
検体と接触させる前に、酵素とそれが標識として作用す
る物質とを共有結合させることにより製造しておくこと
ができる。

この接合体は、酵素をａ合パートナーに対し直接にかま
たは適宜のスペーサ・アーム′ｆ：、通して結合させ、
そして酵素活性、および結合パートナーのその相当する
被分析物を結合する能力を保存する既知の方法によシ製
造される。酵素を抗体に直接共有結合させることが望ま
しくない場合には、アビジン標識酵素とビオチン標識結
合パートナーの特異結合を含む他の手段によシ適宜の接
合体を製造することもできる。このアビジン／ビオチン
標識は、検体と接触させる前かあるいは検体と接触させ
るのと同時に、標識酵素と被分析物結合パートナーとを
インキュベートすることによシ接合体の形成、製造を可
能にする。あるいはまた、酵素と結合ノソートナーの接
合体は、検体、標識結合パートナーおよび標識酵素を任
意の所望の順序で順次に添加することにより形成するこ
とができる。すべての場合に、結合パートナーによシ与
えらｎる結合部筐喘数は被分析物に対してモル過剰であ
る。接合体の一部は被分析物に結合し、そして残シの部
分は遊離したまま残る。結合または遊離接合体のいずれ
かを凝集系と接触させて＃染を阻害するＯ 直接凝集方式では、高屈折性粒子の弐面には、リガンド
よりはむしろ酵素の基質が付着している。それらの粒子
を酵素と反応させると基質はリガンドに転・化される。

次いで結合パートナーは別体粒子を架橋して凝集を生せ
しめることができる。この場合にも、酵素は検体中遊離
状態で存在することができ、その場合には凝集現象はそ
の酵素の直接の測定尺度であ）％あるいは酵素は抗体、
抗原またはハプテン、核酸プローブ等への標識であって
もよく、その場合には硬実現象はそれが標識として作用
する物質の間接的な測定尺度である。

本発明の方法を用いて検出できる酵素にはβ−ガラクト
シダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ｒｌ！ｉ洋ワサ
ビワサビペルオキシダーゼコースオキシダーゼ、ウレア
ーゼおよびβ−ラクタマーゼが含まれるが、これらに限
定されるものではない。

生物学的試料中の物質の間接的−１１定尺度として用い
られる場合、かかる試料としては例えば血液、脳を髄献
、血清、血漿、痰、尿、臭洗浄液、生殖器及び咽喉の綿
棒試料、およびその他の生物学的試料が挙げられる。

適切な高屈折性粒子は例えば、アガロース、ポリデキス
トラン、ポリアクリルアミドおよびポリマーラテックス
などから製造でさる。粒子　　　゛の形状は重要ではな
いが、球状粒子が最も製造しやすく、凝集状態で最大の
格子δ度を与えるので好ましい。粒子の大きさはいく分
重要である。球状粒子の好ｌしい直径は、凝集阻害方式
にメＪ　しては、約３０　ｎｍ−１１００ｎである。最
も好ましい粒子は米国特許第４，４０１，７６５号明細
書に記載されたものである。上記米国特許の開示事項に
ついてここで言及してみる。これらの粒子は、好ましく
は、ポリビニールナフタレンおよびポリスチレンから製
造された高屈折性球状ポリマー・コアを何する。該コア
次面には抗原ノ１ブテン那が共有結合的に結合すること
のできる反応性の殻が付着している。ポリマー粒子の粒
径を川面するだめの都合のよい方法は表面活性剤の使用
量によシ粒径を調節できる種（８θｅｄ）乳陶牧を調製
する方法である。この種乳濁牧を調製埃、付刀ロ的なモ
ノマーおよび表面活性剤を調節されｆｃ運Ｉ貌で添刀口
して種乳濁敵中の粒子のサイズを大さくすることができ
る。

ポリマー粒子の外殻ポリマーは、生１勿字四にＪｉ４に
ある化合吻と反応しうる官能基を有する広い範四のエチ
レン体不飽和七ツマ−から製造することができる。所望
により、外殻は他のエチレン様不飽和七ツマ−を含むこ
ともできる。殻ポリマーのコアへの結合はコアポリマー
中の残留エチレン悼不飽和基に官能性ポリマーをグラフ
ト重合することによシ行うことができるしまた、官能性
七ツマ−をコアの周囲で貞−８−させて連続殻を形成す
ることができる。好ましいモノマーとしては例えばエポ
キシ基を含有するもの、例えばグリシジルメタクリレー
ト、グリシジルアクリレート、ビニールグリシジルエー
テル、およびメタリルグリシジルエーテルなどが挙げら
れる。他の官能性基としては例えばカルボキシル、ヒド
ロキシル、アミンおよびアルデヒドなどが挙げられる。

ｊＯｃｌｎｍ以上、好ましくはＩＣ１（１０ｎｍ　〜ｆ
００．０００ｎｍの範囲の直径を有する粒子を、前述の
方法による肉視凝集試験用に製造できる。これらの大型
直径粒子は、凝集状態の変化による凝集反応の際に容易
に見られる。直接凝集方式は、直接凝集の方が凝集阻害
よシも検出が容易なので、粒子＃楽の肉視検出に好まし
い。

阻害方式では、適宜のリガンドを表面に付着した所望の
組成を有する粒子を製造する。このリガンドは物理的に
吸着してもよいし、あるいは（直接またはいわゆるスイ
ープ・アームを通して）共有結合的に結合してもよい。

誘導された表面への化合物の共有結合による結合法は周
卸である（ＫｉｅｆｅｒＪ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｍｅｔｈｏａｓ　Ｊ、Ｌａｆｋｏｖｉｔｓ＆Ｐｅｒ
ｒｉｓ、ｅｄｓ、、　ニューヨーク：　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃＰｒｅｓｓ、　１９７９．１３７参照］。直接凝集方
式では粒子ｒｉ衣表面基質を付着している。基質を共有
結合的に結合する）５法はリガンドを結合する方法と類
似している。

本発明の凝呆阻害方式をＡ行するには、酵素基質反応が
、結合パートナーに対しリガンドと拮抗する生成物を生
成しなければならない。更に、基質は酵素によって分解
される前に結合ノで一トナーと実質的に反応性のあるも
のであってはなりない。例えばβ−ガラクトシダーゼの
場合には、適当な基質は０−二トロフェニルーβ−ガラ
クトピラノシド（０削）であり、また適当な結合剤は抗
−〇−二トロフェノールまたは抗−ニトロヒドロ牛シ安
息書酸（ＮＨＢ）抗体である。

β−ガラクトシダーゼが０−ニトロフェニル−β−ガラ
クトピラノシドと反応すると、０−二トロフェニル基と
β−ガラクトビ２ノシド部分　　　ｉとの間の結合が開
裂され、遊虐のｏ　−ニトロフェノール分子が生じる。

Ｈ’＋１記抗体は０−ニトロフェノールにｖｉ反応性が
あるが０−ニトロフェニル−Ｉ−ガラクトピラノシドに
は反応性がない。ガラクトピラノシド４は抗−〇−ニト
ロフ工／−ル抗＄Ｌ！−０−ニトロフェニルｆｉｔ　換
分（ＧＮＰ）との結合を立体的に妨督するものと思われ
る。

しかしながら、基質の酵素分解によってその抗体と結甘
しうる生成物が生成する。酵素、　４％。

リガンドおよび結合パートナーの間に必要な機能上の関
係は、基質および生成物により与えられる巣来速度の比
較を示す第１表のデータにより史に説明される。

データは、０ＮＰＧおよびＯＮＰ同族体である６−ニト
ロ−４−ヒドロキシ安息香酸（ＮＨＢ）の、抗−ＮＨＢ
抗体によるＮＨＢ被徨粒子凝集の阻害能を比べすること
により作成した。これらのデータは、０−ニトロフェニ
ルガラクトピラノシドの一度よシ約６桁程度も低いＮＨ
Ｂ碌度が等価の阻害を生じることを示す。ＮＨＢは、β
−ガラクトシダーゼによる０ＮＰＧの加水分解によって
生じた生成物に対する機能的等価物である。従って基質
の酵素分解がなければ、有意な凝集阻害はない。

酵素基質（ＯＮＰＧ）および生成＋ｆ！１Ｊ（ＮＨＢ）
によるＮＥ（Ｂを有する粒子の凝集阻害第１表 １０−’　　　　　　　３６１　　　　　　　４０５１
０−’　　　　　　　　１８　　　　　　　３８４１０
−’　　　　　　　　　０　　　　　　　　２４ｍｓ、
　＃ａおよびリガンドの狂態の作用トリオを用いて最高
感度の定量検定系を実現するには、ある種の要件が満た
されねばならないことは当業者の理解するところであろ
う。基質は酵素の予想濃度に対してモル過剰でなければ
ならない。典型的には、基質濃度は５〜１０Ｋｏ（ミカ
エリス定数）濃度である。この要件によシ一般に、−天
動力学が基質について観察されること。

および反応速度が不充分な基質濃度にょシ制限されない
ことが保証される。当該酵素が検定の際に試薬として存
在する場合は、その酵素が系内に予測された濃度範、囲
にわたって存在することとなるので、適切な基質レベル
の決定は比較的簡明である。当該酵素が検定の被分析物
であって、しかもまれであるか単離し難いものでもある
場合には、定量検定に好ましい動力学を維持するには適
切な基質レベルを一段と経験的に近似させることが必安
かもしれない。先きに論じた酢索と基質の間の関係にお
ける制約は、酵素の有無が重要となシうる定性的結果に
はざほと重大ではない。

もう一つの重要な考慮は結合パートナーの基質との交叉
反応性の濃度である。定量および半定量系で一次動力学
を保証する所定レベルの基質はまた、基質が酵素活性に
よシ生成される生成物よシも一段と高濃度で存在するこ
とを保証する。貞ｉｔ１″ｌ：用の法則によれば有意の
交叉反応性が存在すれば、結合パートナーの基質への結
合が示唆されよう。このため、直接凝集系の場合バック
グラウンド凝集は者しいものとなシ。

また阻害系では凝集の非特異的阻害のレベルは受答され
難いものとなろう。従って、基質と生　　　　゛酸物と
の間に少くとも２〜３次数の大きさの濃度差が存在する
場合には、最高検定窓【を得るに―、基亘との又又反応
性がＶよとんどかあるいは宝くない結付パートナーが選
択される。この女性によジ、直接凝渠系にあっては極め
て低レベルの生成物を検出でき、′！た阻害系にあって
は、襖めて世レベルの生ｂｙ、′ｍは結合ノソートナー
結合部位に対して粒子結合リガンドと効果的に拮抗する
。いずれの系においても結合パートナーの交叉反応性を
最小限度にした場合にのみ襖りて低レベルの生成物に対
して粒子凝集状態の顕著な変化ｔみることができる。大
抵の酵素に対する定−精条件下では、基質１１度は１０
　　〜１０−６Ｍの範囲、生成物はｆＪｌｏ−６〜１０
−１１１Ｍの範囲となろう。

基質全高Ｑバ折性粒子の辰面に付着させることの必要、
を直接凝集方式では、開裂可能な結合が粒子それ自体に
よって酵素から立体障害を受けていないことが重要であ
る。いわゆるスに一す一・アームの使用は、開裂可能な
結合と粒子表面との間に障害を防止するのに充分な距離
を置くことができる。

好ましい結合剤は抗体分子である。抗体がそれぞれの抗
原またはハブテンに対して極って特異的であることは矧
られている。更に、抗体は製造しやすくまた凝集に必要
な多価を与える。

モノクローナルおよびポリクローナル抗体のいずれも本
発明に使用できる。

抗血清またはその他の体液、例えば抗リガンド抗体を含
有する腹水などは、凝集系に直接使用でき、あるいは梢
映して免疫グロブリン画分、ＩｇＧまたはアフイニテイ
梢喪ＩｇＧ画分を提供することができ、そしてそれらも
すべて凝集系の結合パートナーとして使用することかで
さる。

ＩｇＭｍ分を用いることも可能である。Ｉｇ（）の断片
、例えばＦ（ａｂ’）２　も使用できる。

検出式れるべき時定の酵素が選択されｎは。

開裂可能な結合のタイプを確認することができ。

例えばβ−グルコシダーゼの場合、その結合はｌ−カラ
クトビラノシドともう１つの楯（グルコースまたは）２
クトース）または適当な代替物例えｆｉＯＮＰなどとの
間のβ（１−４）エーテル結合である。その結合を含む
天然基質全同定することができ、あるいはその結合を言
む合成基質を設計することができる。次いでその酵素と
基質の反応によシ生じる生成物の化学的本体を定めるこ
とができ、またそのことは、実用的な系が形成されるよ
うに選択されねばならない適当な結合パートナーの本体
を定めることとなる。

詳しくいえば、酵素と基質の反応は結合パートナーｖＣ
対して、リガンドと拮抗する生成物を生成するものでな
ければならない。酵素、基質および結合パートナーの実
用的な系の例全下記の第２辰に示す。

第２表 導体 好ましいシステムは次のとおｐである：（１）β−ガラ
クトシダーゼ、　０ＮＦ−β−ガラクトピラノンド、０
−ニトロフェノールおよび抗−〇−ニトロフェノール抗
体、および （２１’ｒシルカリホスファターゼ、ｐ−ニトロ７エ二
ルーホスフエートｔ　　ｐ−ニトロフェノールおよび抗
−ｐ−ニトロフェノール抗体。

前記ｇｇ２表かられかるように、基質はその酵素によっ
て開裂されて結合・り一トナーと反応性の少くとも１つ
の生成物を生ずることのできる少くとも１つの結合を与
えるものでなければならない。それら生成物の１つはリ
ガンドとして割くように選択される。一般に、リガンド
はハプテン、すなわち、抗−ハブテン抗体には結合しう
るが直接には免疫応答を誘起し得ない小分子である。こ
のリガンドは既知の方法によシ適当な高分子担体に結合
して適宜の免疫原を形成することができる。形成された
免疫原を免疫能のある動物に注射して抗−）・ブテン免
疫応答を誘起することができる。適宜の免疫、ｔＰ画の
後免疫動物から適鋤な抗血清あるいは、認めら扛たモノ
クローナル抗体産生法、例えばＫｏｈｌｅｒ　　とＭｉ
　ｌａ　ｔｏ　ｉｎによる方法［ＮａｔｕｒｅＪ、　２
５６　：　４９５．１９７５）に用いるのに適した免疫
感作純胞を得ることができる。

検出すべき所定の酵素に対し、その結合剤に対するリガ
ンドとして機能しうる分解生成物を与えるよう基質を設
計できれば、抗体以外の多価結合剤を使用することがで
きる。例えば、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が
チロキシンを結合することが知られている。β−ガラク
トシダーゼを検出したいときは、その酵素と基質の反応
からＴＢＧにょシ結合しうるチロキシンが生成するよう
、チロキシンとガラクトピラノシド七の共有結合接合体
よりなる基′Ｒを設計することができる。チロキシンの
ヒビロキンル基とカンクトビラノシドのＣ１炭素のヒド
ロキシル基よシ形成されるエーテル結合が過当な基質を
与えるものと考えられる。本発明にＭ用であることが証
されうる他の多価結合剤にはＣ−反応性タン・ξり、ア
ビジン、およびアミロイドＡタンパクが言まれる。

直接凝集または凝集阻害方式において、系の物性、特に
光学的性質は経時的に変化する。これら検出可能な物性
例には入射光の所定波長における吸光度および、入射光
線に対し所定角度で敢乱される単色光の強度が含まれる
。更に。

＃果した高屈折性粒子の粒度分布を測定することができ
る。

所定波長での吸光度は標準的な分光光度測定器を用いて
測定することができる。散乱光は比濁計を用いて測定す
ることができる。凝集した高屈折＄板子は光学的または
電気的な粒子計数器を用いて側だすることができる。好
ましい方法は、試験系の竹刀目的成分による＾い濁り分
析信号および低い干渉に基づいて選択される所定波長で
吸光度を測測定る方法である。例えば、本発明の系がβ
−ガラクトシダーゼ、　　０ＮＢ−β−ガラクトピラノ
シド、０−ニトロフェノールおよび抗−ニトロフェノー
ル抗体よりなる場合、基質は３４０　ｎｍで顕著な吸光
度極大を胃する。従って１反応系を濁り分析信号の一〇
定に至適な波長である５　４０　ｎｍでモニターした場
合には一１基質によシ干渉源がつくられることになろう
。その結果、基質からの吸光度寄与を低減するために濁
シ分析信号は４０５　ｎｍでモニターされる。

次に本発明を以下の実施例によう説明するが、本発明は
それらに限定されるものではない。

実施例　１ 次の、１ｌｔｉ例は１本発明によシ提供される方法によ
９４分以内に２．５Ｘ１０　　単位／ｍｆｆ１という９
菫のβ−ガラクトシダーゼが測定可能であることを示す
。この実施例で用いた高屈折性粒子は。

ポリビニールナフタレンの中間殻とポリグリシジルメタ
クリレートの外殻を有するポリスチレンコアであった。

結合剤は、ハプテンの３−ニトロ−４−ヒドロキシ安息
香酸に対して調製さ几た抗体とした。この抗体は、ｏ−
ニトロフェノールと順者に交叉反応した。リガンドは３
−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸とし、これをそのカ
ルボキシル基を通して、高屈折性粒子上のポリグリシジ
ルメタクリレートの外殻に共有結合した。β−ガラクト
シダーゼの基質は〇−二トロフェニルーβ−Ｄ−ガラク
トピラノンドとした。この方法は凝集阻害方式で行った
。凝集速度は２つの所定時魚で、吸光度ｔ”４０５ｎｍ
で測定することによシ測定した。

＾、ＮＨＢ：タンパク接合体の合成 キーホール−リンはット・ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌ
ｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、略してＫＬ
Ｈ）（７５Ｑｓｙ、　Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒ
ｉｎｇ）　’ｇ　１０ｍｌ！の０．０５Ｍ重炭戚ナトリ
ウム緩面欣（ｐｉ（９，０）に躊屏し。

そして前記重炭酸塩緩衝液を用いて、徹底的に透析した
。ＯＮＰの同族体である３−ニトロ−４−ヒドロキシ安
息香酸（ＮＨＢ）　（６４■）を５ｍｆｆ１のジメチル
ホルムアミドに溶解しそして４℃に冷却した。この溶液
に、８１■の１−エチル−６−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミドおよび４３〜のＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドを察加した。その溶液を４℃で１８時間
攪拌した。次いで透析済みの瑯溶液をジメチルホルムア
ミド溶成に添加し。

−を０．２Ｎ水酸化ナトリウムで８．５にＡ節し。

そしてその浴？ｉｎ４″Ｃで８時間インキュベートした
。久にその反応混曾吻を脱イオン水で透析して未反応物
質を除去し、そして接合物ｔ４℃で貯蔵する前に凍結乾
燥した。

担体タンパクとして牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用い
る別個の″接会体を５００■のＢＳＡを用いて同じ刀γ
去で調製した。

Ｂ、ポリクローナル抗−ＮＨＢ抗体 ６匹の家兎（Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ％維
）に、１．０峨の児竺７０インドアジュバント中に懸濁
した０、２５■のＮＨＢ　：　ＫＩＪ接合体（前記Ａの
部で合成）を皮下注射した。不完全フロインドアジュバ
ントを用いて前述の如く、約２１日間隔で３回ブースタ
ー注射を行った。各ブースター注射に先立ち、それら尿
兎から採皿し。

そして後述のＤの部に記載のポリマー粒子試剤を用いて
米国時計第４，４０１．７６５号明細書に記載さ扛てい
るような粒子強化比濁分釘式阻誓イムノアッセイにより
１皿清の０−ニトロフェノール父叉反応性抗体′を試験
した。

ホリスチレン乳ｍｇを４１エレンマイエルフラスコ中室
温（２０℃）で製造した。次の成分を順次添加した。す
なわち、４００９のＤｕｐａｎｏｌＷＡＱＫ　（３０チ
ドデシル＠酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液のＤｕ　Ｆｏｎ
ｔグレード）を２，５，１の脱イオン水に添加し、仄い
て５０ｍ１のスチレン、２０ｊｌのメタ重亜硫酸ナトリ
ウム、１０Ｆの過硫酸カリウム（２００ｍｇの水に溶解
）、そして１２５ｍｇの硫酸第一鉄溶液（０，６９の（
ＩｉｌＣ酸第−鉄・五水和物および０．２５　ｊ）の硫
酸を５００峨の窒素パージ済み脱イオン水に溶解）を添
加し比。

その乳濁液混合物を攪拌しそして画素で榎つ／こ。１０
分１／ｉ、　　５７５ｒｎＱのスチレンに溶解した２５
９のＡｅｒｏｓｏｌ　Ｏ’ｌ’−１００（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｃｙｎａｍｉｄ仕侠）を５（Ｊｒｎｔ／分の速度
で添ガロした。その混合物を一夜攪拌した。１：１００
に希釈したその乳濁欣のサンプルは３４０　ｎｍでＣ１
，１７１の光学・ｄ度を有していた。

ポリビニールナフタレンｒｉ％磁気攪拌器および還流凝
縮器を設けた２５０１１Ｌｔ丸底フラスコ中で嗅遺した
。その九ｊ底７ラス；を沸騰水溶に人ｎだ。ポリスチレ
ンコア粒子上にポリビニールナフタレン中間殻を与える
ために、上記のよりに＃遺した１、　８　ｍＱのポリス
チレン乳濁欣を９８側の水に添〃ａしそして９５℃に加
熱した。この混合物を仄いて１１．７９の２−ビニール
ナフタレン（Ａ］４ｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社製、
昇化およびジクロロメタン溶ｌ夜中塩基性アルミナでの
クロマトグラフィによりｌＬｍ）、５００〜の重炭酸ナ
トリウムンよび９０〜の過硫酸カリウムに添カロした。

２−ビニールナフタレンの融解後直ちにその混合物に４
　ｍＭの１０％ドデシル５＆酸ナトリウムを０．５　ｍ
ｉｔ　７分の速度で混入させた。ＳＤＳ混入開始の１時
間泌に重合は完了した。水に１：５０００希釈した後の
生成物の５４０　ａｍでの光学密度はａ１５５であった
。

平均粒子直径は電子顕微鏡により７４　ｎｍと副ボされ
た。モノマーのポリマーへの転化４は。

残留モノマーのガスクロマトグラフィ測定により、９９
．６％であることがわかった。

そのポリビニールナフタレン／ポリスチレン粒子上にポ
リグリシジルメタクリレートの外殻を形成した。グリシ
ジルメタクリレートの重合は前記と同じ装置で行った。

１０４１のポリビニールナフタレン／ポリスチレン粒子
を沸騰水浴中で加熱した。１００うの過硫酸カリウムお
よび２．０６ｍＱのグリンシルメタクリレート（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社製）を添〃口した。

２０分故にその混合物を冷却した。グリシジルメタクリ
レートモノマーのポリマーへの転化率は、未反応上ツマ
ー濃度の測定によシ９９０％であることがわかった。水
に１：５０００希釈した後の生成物の３４　Ｑ　ｎｍで
測ボした光学蜜１隻は０１５４であった。

Ｄ、　　ＮＨＢのポリマー粒子への結合Ｏ−ニトロフェ
ノールの同族体である３−ニトロ−４−ヒドロキシ安息
香酸（ＮＨＢ、　１４４Ｗ１９）および１−エテル−５
−Ｃ５−：）メチルアミノプロピル）カルボジイミド（
１５６１１５＋）ｆ　５　ｍＱのジメチルスルホキシド
に溶解しそして室温で２時間放置した。もう一つの５蛾
答のジメチルスルホキシドに４２０■の２，２′−オキ
ソビス（エチルアミン）・ジ塩酸塩を添加した。仄にそ
れら２つの溶液を合一しそして室温で約７２時間インキ
ュベートした。

前述の如く製造したＮＨＢ接合体溶液（０，，５３３ｍ
１　）および０．０６ｍｆｆ１の１０％Ｗ／ｖＣ）ＡＦ
ＡＣ■ＲＫ　−６１０＝水溶欣（ＧＡＦＡＣ■Ｒｊ！ニ
ー６１０はＧＡＦＣｏｒｐ、　ｇの陰イオン表面活性剤
である）を４．４　ｍｌの５−燐酸ナトリウム緩ＬａＩ
液（ｐＨ８，０）に希釈した。

この溶液の−を−１０，０〜１０．１に調螢しそして１
、２　ｍｌのコア／殻ポリマー粒子（前記Ｃの部参照）
を反応系に添加した。その混合物を３時間７０℃に加熱
しそして室温まで放冷した。

その粒子剤？：　０．１　％　ＧＡＦＡｃ（＠含有の１
５ｎＭ燐酸す）　ｌ）ラム緩衝液（ｐＨ７，０）で希釈
した。それら粒子を９０分間２０．０００　ｒｐｍで遠
心分離してベレットを形成し、そして上澄を捨てた。

粒子を前記燐酸塩／　ＧＡＦ’ＡＯ■溶欣に再懸濁しそ
して再遠心分離した。その遠心分離と再懸濁を全部で４
回繰返して未反応ＮＨＥ接合体を味去した。最終洗浄の
後、その粒子剤を０．１ｃｓ　ＧＡＦＡｃ’Ｄ含有の１
５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０ン中で全容量
をｉｏｍｔとした。

Ｅ、β−ガラクトシダーゼ活性（従来技術）すべての検
定はａｃａ■個別（１ｉｓｃｒｅｔｅ）　　臨床分析器
ＣＤｕ　ｐｏｎｔ社製）で３７℃で行った。

＃系β−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａ１社製）の原１便を製造元の測定した活性基準で４．
５×１０６単反／　ｒｎＱの濃度でＡ製した。そのβ−
ガラクトシダーゼ原液の連続希釈液を４，５ｘ１０５〜
４．５Ｘ１０−５単位／叫の範囲にわたってＡ製した。

谷β−ガラクト７ダーゼ希釈液の０、Ｑ５ｍｌ試料をａ
ｃａ［有］分析試暎パックに自動的に注入し仄いて３チ
のポリエチレングリコール８０００、ｏ、　１　％　ｏ
ＡＦＡｃ’！９および２！ｎＭの塩化マグネシウムを含
む０．１５Ｍホスフェート緩衝ｇ（ｐ！４７．８　）　
４．９５＋Ｒ１’ｅ圧注入た。次に七のパックのＦ’：
Ｊ谷ＪｌｊｌＪを６７℃に刀口隔し、でして酵累反［ｔ
”Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（
０ＮＰＧ）を０．１　ｍＭの最終濃度となるよう添加す
ることによシ開始した。酵素活性は０ＮＰＧ添加の２９
秒後および４６抄後における４　０５　ｎｍでの吸光度
差（変化速度ンを測定することにより測定した。

Ｅの部で調製したβ−ガラクトシダーゼ運Ｍ希釈液をこ
れらの実験にも用いた。各β−ガラクトシダーゼ希釈液
のＱ、Ｑ５ｍＱ試料をａｃａ■゛　分析試験パックに自
動的に注入し、久いて３チポリエチレングリコール８０
００．０．１％ＧＡＦＡ−および２戚塩化マグネ７ウム
ｌｒ、含有する０、１５Ｍホスフェート稜Ｕｆｌｔｉ、
＜ｍ７．８）４．９５ｍＱｆ７王人した。そのパックの
内容物を６７℃に〃口熱し、でして厳初０４つのパック
凹部の試剤を放出した。この時点での反応混合物は０．
１　ｍＭ　０ＮＰＣ）と、前記りの部で合成されたＮＩ
Ｂ　＆子試剤の固体分０．０１６％からなっていた。比
濁分析阻否反＋ｃｌ；ｒｔ、３．５分後に前記Ｂの部で
調製した学鬼抗−ＮＨＢ抗血清ｏ、ｏｏａｍｉを添加す
ることにより開始した。粒子凝集による１ｍ度増加は、
抗体添加の２９秒後および４６秒後の４０５　ｎｍにお
ける吸光度差（ｆ比速度）として測定された。第３表は
従来技術の方法と本発明の方法とよりなるβ−ガラクト
シダーゼ活性のデータを示す。

第３戎のデータは、従来技術の方法が０．２５〜２．５
単位／　ｍｌの感度を有したのに対し１本発明によシ提
供される方法は約２．５　Ｘ　１０−’単位ン′ｍＱの
感ｅを何する（これはほぼ１０００倍の増加に相当する
）こと金示している。

／ｉｇ６表 ２５　　　　　　　６４７　　　　　　　　ｎｃＬ２．
５　　　　　　　５５　　　　　　　　ｎｄＯ，２５２
１２ ０，０２５０５６ ０，００２５０１５１ ０，０００２５０１８４ ００１８（Ｓ ｎｄ＝測疋されず 実施例　２ ジゴキシンの測定 以下の実施例ａ、本発明によシ提供される方法が検体中
の０．５　ｎｇ／ｍｌ！という９扉のジゴキシンｔ　（
ＩＪ１１定できることを示す。本発明の第２の一点を例
示するこの実施例では、被分析物はジゴキシンである。

第１結合パートナーは抗−ジゴキシンＦ（ａｂ’）２抗
体断片とし、これを酵素β−ガラクトシダーゼに結合し
て接合体を形成した。

結合接曾体の遊離接合体からの分離は、ウワパインで被
覆架橋デキストランのビーズを用いたアフイニテイ力ラ
ムを用いて行った。高屈折性板子は、ポリビニールナフ
タレンの中間殻とポリグリンジルメタクリレートの外殻
を有するポリスチレンコアを含有した。そのリガンドは
４−７ミノー２−二トロフェノールトシタ。第２ｉ１５
合’ｈナーはキーホール・リン深ット・ヘモシアニンに
結合された６−ニトロ−４−ヒドロキシ安恩杏酸よりな
る免疫原に対して調製されたモノクローナル抗体とした
。この抗体は〇−ニトロフェノールに対し高い交叉反応
性を示シタ。基質ｕ、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドとした。この方法は凝集阻沓方式で行
った。凝集速度は、２つの所定の時点で４０５　ｎＨに
おける光学密度を測定することによシ測定した。

Ａ、抗体−酵素接合体の合成 ジゴキシン−特異抗体をウワパインーヒト血清アルブミ
ン（Ｈ８Ａ）免疫収Ｍ剤を用いて家兎全血清から直接免
疫梢製した。

ウワバインは、タンパク（Ｈ８Ａ）スは−サー・アーム
を通してアガロースマ）　ＩＪラックス結合した。第１
段階ではウワバインーアルブミン接合体を合成した。ウ
ワパイン（０，５６ミリモルを２ＱｍＱの水に溶解）を
メタ過沃素酸ナトリウム（１，０２：”　ｌ）モル）ｆ
！：用い室温で１時間暗所で酸化した。定量的な酸化は
、酢酸エチル：メタノール：　Ｈ２Ｏ（７５：２５：１
）中で展開されるンリカゲルＧプレートでの薄層クロマ
トグラフィによシ確認した。過剰の過沃素酸塩はその水
性混合物をＤＯＷαＡＧ−ＩＸ８イオンの５ｍ！ｅカラ
ムに通すことによって除去した。クワパインの定量的回
収は次の放射標識（トリチウム化した）クワパインによ
シ確認した。酸化されたクワパインの溶液を０，４峨の
５チＮａ２ＣＯ３の添加により−９５に緩衝し、そして
２０峨のＨ８Ａ　＠液（２８■／峨）と合一した。４５
分後、接合体を２０ｆｆｔ１の水に用時溶解した０、　
３１水素化ホウ素ナトリウムの添加によシ還元した。６
時間後、　８ｆｆｌｊの１Ｍ蟻酸を添加してその−を６
．５まで下げた。ｐＨ６，５で１時間後、そのｐｉ（ｔ
ｌ−Ｉ　Ｍ　ＮＨ４ＯＨでｐＨ１５まで上げた。全反応
溶成を徹底的に蒸留水に対して透析し、欠いて最終的に
、０．０１５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，８、０
，１５Ｍ　Ｎａ１ｆｔ　に対して透析した。での接合体
をＡｍ１ｃｏｎ　ＰＭ−３０膜で４．２町／峨まで濃縮
した。タン７セク嬢度ｒｉ。

当該技術分野において周知のＬｏｗｒｙ法により測定し
た。

そのクワパイン−Ｈ８Ａ　接合体をＢｉｂ−Ｒａｄマニ
ュアルに記載の手順を用いてｌ’ｆｉ−Ｇｅｍ’！’１
０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｗ　
）に固定した。

Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ＠１０　（２５ｒｎｌ　）を７５ｍ１
の氷冷水で洗浄し友。そのゲルを透析済みのウワパイン
ーＨＯＡ接合体に添加しセして揺動器上で４℃で一夜混
合した。過剰の活性エステル基は室温で１時間０．１１
１Ｌｇの１Ｍエタノールアミン（−８，０）を添加する
ことにエフクエンチした。

最後にそのゲルを蒸留水で充分洗１争し、仄いで順次５
０叫のＱ、５　Ｍ　Ｎａ（：Ｊｌ、４００ｍＱの０．１
　Ｍ　　　　　　。

グリシン（ｐｆ（２，５）、３００ｍ１の２．５　Ｍ　
ＮＨ４ＳＣＮ　。

１０１００Ｏのホスフェート緩衝食塩水で洗浄した。ウ
ワ、Ｓイン・アフイニテイ樹脂を６唾の床各重となるま
でカラム（０，７Ｘ１５０）内に充填し、そしてホスフ
ェート緩衝食塩水で平衡した。抗Ｒ清（単因子抗体濃度
４．５ｗ９／峨のＣａ　ｐｐｅ　１抗ジゴキシ’皿ｆｌ
ｔ　１０　ｍｇ　）を１ｍｔ１分の流速でカラムにかけ
た。そのカラムを２８０　ｎｍにおける吸光度が基線（
０，０１）に達するまでホスフェート緩衝食塩水で促浄
した。次に６０ｒｎＱの６ＭＮＨ４ＳＣＮ　（ｐｉ４７
５　）を用いて抗体をカラーから溶出しそして直ちに４
×２℃入れ換えのホスフェート１衝食塩水に対し４℃で
透析した。

アクイニテイ祠製抗ジゴキシン抗体Ｃ２７ｍ１）をＡｍ
１ｃｏｎ９ｊ拌セル装置（ＰＭ−６０＋Ｍ　）で２．７
　ｍｅに濃縮した。最終タンパク濃度は１ａｍｙ／ｍｅ
であった。その試料ｅ１０００ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナト
リクム（１））１４．５）に対して４″Ｇで４時間透析
した。透析後、同じ酢酸ナトリクム棧爾液に浴屏したは
プシンの１０■／ｍ溶欣α’０２ｍ９．全添加し、そし
て温度？：　３７　’Ｃ里で２ａ時間高めた。この消化
時間後、試料を手短かに遠心分離することによシ＃筐化
し１次いで０．０１５Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，４）
　、　　ｃＬｌ　５Ｍ　ＮａＣｊ！　（ホスフェート緩
衝食塩水ンで平衡した５ｅｐｈａｄθＸＧ１５０カラム
（１，５Ｘ９０副）でのクロマトグラフィにかけた。ゲ
ル電気泳動によジ同定されるＦ（ａｂ’）２　Ｆ！ｆｒ
片含有カラム画分をプールしく１９２ｍ）次いで加圧濾
過（ＰＭ−３０Ａｍ１ＣＯｎ膜）によシ２．７峨まで濃
縮した。

１ｍｌの７フイニテイｂＩ製抗ジゴ牛シンＦ（ａｂ’）
２断片（０，０１５Ｍ燐酸ナトリウム、０．１５Ｍ　Ｎ
ａＣｎ、ｊ　ｍＭ　ＫＤＴＡ、（ｐｉ（７０）中タンパ
ク濃度２．８５〜／ｍＱ）ｆジメチルホルムアミドにｍ
ｍしたスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル
）フクロヘキサン−１−カルホキシレート＜ｘｃ＞０６
０　ｍＭ＄ｇ　Ｏ，００９１ｍＱと２３〜２５℃で混合
した。６０分吹、その浴γ’＆を同じ燐酸ナトリウム−
ＮａＣｆＡ　−ＥＤＴＡ　＠　液中で平衡した５ｅｐｈ
ａｄｅｘＧ−２５カラム（１，５Ｘ３０ｃｒｎ）で脱塩
することによって反応を止めた。ボイド（ｖｏｉｄ）４
童で溶出した蛋白を果め、　Ａｍ１ｃｏｎ攪拌セル濃縮
器（ＰＭ−６ｏｇ）を用いて１ｍｅまでｍＭした。１　
ｍＱの０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　Ｈ（Ｊ、　０．１５Ｍ　
Ｎａ０ｎ、１　ｍＭ　ＭｇＣｊ１２（ｐＨ７，５）に尋
解した２４■のβ−ガラクトシダーゼをＦ（ａｂ’）２
−８ＭＣＣアダクトに添加しそして４℃で２０時間反応
させた。２−メルカプトエタノールの０．１Ｍ溶液Ｑ、
　Ｑ　１　ｍｌを４℃で１時間奈ガロすることにより反
応を止めた。Ｆ（＆ｂ’）２−β−がラクトシダーゼ接
合体は、４℃で０、０５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ、０．
１５　Ｍ　Ｎａ０ｊ！、１　ｍＭ　ＭｇＣ４２（ｐＨ７
，５）中で平衡した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂカラム
（１，５Ｘ９０３）でのクロマトグツフィにより未反応
β−ガラクトシダーゼから分離した。

ウワバインを牛血嘴アルブミン（ＢＳＡ）　ｋ介して５
ｓｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−ｆ　Ｑに至適割合で結合した。

ウワパインーＢＳＡ　を５９のウワパイン・１０水和物
を５００ｍ１の熱蒸留水（７０℃）に溶解することによ
シｖＪ４裂し次。その溶液を２５℃まで放冷し、Ｚ３９
のメタ過沃素酸ナトリウムを添加した後暗所で２時間２
５℃で連続的に混合した。次にその混合物を２５０ａ＋
ｅのＤｏｖｒｅｘ（ＩＸ８）陰イオン交換樹脂床に刈す
ことによシ酸化を止めた。溶出液を集めそして１Ｍ燐酸
ナトリウム緩＃液（ｐＨ７，０）に溶解した牛血清アル
ブミンの溶液（１０９１５００ｗｅ）と合一した。

２５℃で１時間後、　　０．６４ｊｌのナトリウムシア
ノボロハイドライドを攪拌しなから添刀ａしでしてその
混合物ｔ２５℃で７２時間インキュベートさせた。未結
合ウワバインはそのウワパインーＢＳＡ接合体ｍ液を蒸
留水の流水に対し２４時間、？：にいて２０容の０．０
１５Ｍ燐咳ナ燐酸ナトリウム緩ｐｋ４７．ａ＞に対し４
　’Ｃで透釘することによシ混合物から除去した。その
接合体浴液の最終イオン強度を、　　５ｅｐｈａｄｅｘ
樹脂に結合する前にｊ４．６ｊｌのＮａＣｊｌ　を添カ
ロすることによシ０．２５Ｍに調節した。

５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−１０（４２０９）　（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉｅ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ　ｇ　）　
ｔ　２００　ＱｍＱの蒸留水中で１時間＃潤させた。樹
脂微細物を５ｘ２０００ｍＭ　の水を用いて傾瀉および
再懸濁を行うことによシ味去した。次に２０夕の溶存メ
タ過沃素酸ナトリウムを含む１０１００Ｏの水に再懸濁
准により酸化した。１０分後に、樹脂を５Ｘ２０００ｍ
Ｑの水１次いで４０００ｍＱの０．２５　Ｍ燐酸ナトリ
ウム緩備孜（ｐＨ７，０）を用いて仇伊した。傾瀉した
樹脂ｆｔｆｔ１００ＯのウワバインーＢＥＪＡ饅？［（
前記の如＜ａｔ１棧したもの）に再懸濁し、２５℃で１
時間混合させ、択いて０．６６９のナトリウムシアノボ
ロハイ。ドライドと混合した。７２時間後、その樹脂を
４００ａ城の０．１チドデシル硫酸ナトリウムの水溶ｉ
、１２ｘの蒸留水。

次いで４０００ｍ１の０．１５Ｍ燐酸す）　ＩＪウム緩
備液（ｐｉ（７，１）１に用いて充分流降した。最終的
な樹脂は、　Ｄｕ　Ｐａｎｔ　ａｃａ■個別臨床分析器
での自動分析に用いるため小カラム（０，５Ｘ７ｃ！ｎ
）に充填したスラリーとした。

Ｃ，モノクローナル抗・ＮＨＢ抗体 ０−ニトロフェノールに対し又又反応性を示す抗体の産
生に用いられる５−ニトロ−４−とドロヤシ安息ｆ酸／
　ＫＬＨ接合体の合成は実施例１のＡの部に記載されて
いる。

１、　マウス兄役 ２匹のＨＡＬＢ１０糸マウスにそｊＬぞれ、０．１９の
、先金７０インドアジュバント０．２５ｍｊＬに乳１こ
されたＮＨＢ−ＫＬＨ（全容量はマウス１匹あたり０．
５　ｍＱ）金膜腔内注射した。２１日間隔でブースター
注射を５回行った（不完全７０インドアジユバント中に
０．ＩＷＩｇのＮＨＢ−ＫＬＨを含む）。

６回目のブーストは５回目のブースターから４９日袋に
投与した。最終的な（７回目ンのブーストは６回目のブ
ーストの２１日後とした。融合は最終的ブーストの４日
後に行った。

２、融合 牌Ｐ６を無菌的に商去し、そしてそれら肺臓をソイヤー
メツンユを通すことによって単−細胞懸濁液を調製した
。肺臓細胞を３．５Ｘ１０７個のＰ　、５Ａｇ　８．６
５５ネズミ骨髄朧細胞（＃細胞：骨髄腫細胞＝４．５１
の比）と融合した。１．８目のポリエチレングリコール
（ＰＨ１））溶鏝（４２％Ｖ／、　ＰＥＧ　３６５０．
４５．２％培地２よび７．５　％ジメチルスルホキシド
）ヲ、皿ｔＵ不含培地で況＃済みの骨髄腫および肺細胞
のベレットに添加することにより＝合七行った。その混
合物を１分間放置した。次に１　ｍＱの進言不含培地を
１分間かけてゆつくシとＩＳ　７１（ｌした。仄に４０
１ｎＱの血清不含培２２１１５分間かけて添加した。Ｈ
ＡＴ　（ヒボキ丈ンチン、アミノプテリンおよびチミジ
ン）と牛胎児血清を言む４０ｍｔの工５ｃｏｖｅ培地中
のフィーダー細胞（腹腔浸出液マクロファージ）を添加
した。痣ｉｔｓ。

−を２０個の９６ウ工ルｔａ量滴定プレートにとった。

１週間の培養後（７チＣＯ２インキユベータ）にクロー
ンが検出された。　　　　　　　　　）３、　スクリー
ニング 融合の４週間後に上澄を収捜した。板子増強比濁分桁イ
ムノアッセイ（米国時１ｆｆ−第４，４０１，７６５号
明細薔参照）を用いてそれらを抗体活性についてスクリ
ーニングした。ＮＨ８粒子試剤（央厖例１のＤの部で得
た０、０５ｍ１の粒子試剤ｉ１Ｑｍｊの緩衝液に添加）
を含む０．Ｑ７５ｍｆｆｉのａｒｍ（１５０ｍＭホスフ
ェ−）、３％ＰＫ（）８０００．０．１　％　ＧＡＦＡ
Ｏ■、２　ｍＭ　ＭｇＣｊ１２　）　（ｐＨ７，８）を
入れた微量滴定ウェルに上置（０，０２５緘）を添１１
０した。そのプレートの内容物？：６７℃で５分間イン
キュベートし、仄いて粒子の凝集を調べた。７００クロ
ーンのうちから全部で９個の陽性セルラインが検出され
た。次にこれら上置を、その培養土筐の添加前にＮＥ（
Ｂ−ＢＳＡ全微責滴にウェル内の粒子試剤緩衝液に添加
することにより遊離ＮＨＢ−ＢＳＡを結合する能力につ
いてスクリーニングした。９１面のクローンはすべて、
凝集を行った際凝集阻害（濁シの欠Ｖ）を示した。

４、クローニング それらのセルラインを半制限（ｓｅｍｉ−１ｉｍｉｔｉ
ｎｇ）希釈（ウェルあたり略１個の細胞）でクローンし
た。更にアリコートの細胞を亡失に対するセーフガード
として欣体蓋素中で凍結しておい友。フィーダー細胞（
腹腔マクロファージ）を用いて増殖を促進した。クロー
ンが光分大きくなったら、培養上置を前述のＣ（６）の
部に記載の如く抗体について再試験した。

次に興味ある細胞を散密なポアッソン統計を用い、制限
希釈でのクローニングに対し選択した。ウェル内に充分
な数の細胞が存在するようになったら、上澄５ｃ再び抗
体について区域した。次にリフローンを貯蔵のため凍結
した。

５、鎖組戊 仄のセルラインにより産生された抗体のＨ浦組成２特異
試剤を用いた摩天ケ゛ルでの二重拡散により測定した。

２／１　　　　　　　　　　ｒ５ ｊ　　　　　　　　　γ１ ２／３ｒ１ Ｚ／４　　　　　　　　　　ｒｌ υ′５　　　　　　　　　γ１ ｖ６　　　　　　　　　γｂ ２／７　　　　　　　　　　ｒｌ ２／８　　　　　　　　　　ｒｌ ４−アミノ−２−ニトロフェノール（ＡＮＰ）（７）　
０．５　Ｍ俗液を３８５ｇ　ｆ　５　ｍｌのジメテ／ｌ
／　ｘ　ルホキンドに溶解することによＱＦＡ製した。

その０．５　Ｍ　ＡＮＰ　浴液（０，２ｍりを、０．１
２１ｄの１０チＧＡＦＡＣ■を含む９．７５　ｍｌの５
ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐｆ４８．０）に添カロした。そ
の混合１勿のｐｉ（を１０．０〜１０．１に画歪した。

次に１．９５　ｍＱのコア／殻ポリマー粒子（＊ｍ例１
、Ｃの部ンをＡＲＰ混合物に添刀口しそして７０　’Ｃ
ｉで６時間加熱した。

得られた粒子試剤’ｔ、１５ｍＭ燐酸ナトリウム。

０、１　％　（）ＡＦＡＣ！■（ｐｔ（７，０）　Ｋ希
釈シソｔ、　テ冷ａ遠心器で２０．０００　ｒｐｍで９
０分間遠心分離することによ！：Ｊｆ！ｃ浄した。この
洗浄手順は全部で５回行った。最終洗浄の後、その粒子
試剤ペレットを、１５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液。

０゜１％ＧＡＦＡＣ■（ｐＨ７，０）中で全ｔを１ｏｍ
Ｑとした。その粒子試剤を２Ｊ１のホスフェート／ＧＡ
Ｆ’ＡＯ■洗争用緩衝液に対して一夜透析した。

すゝてのアッセイはａＣａ（！り個別臨床分析器で３７
℃で行った。等容のジゴキシン貧有ヒトｍ　？＃試７糾
と前記Ａの部でｉ１４襄した抗体−酵素接合体を混合し
そして２５℃で１５分間インキュベートした。インキュ
ベーション後。

０．４峨アリコートのその試料混合物ｆ、　ａｃａ■分
析試験パックに自動注入しそしてパックヘッダー〇カラ
ム（前記Ｂの部）全通して浴出した。試料の後に２ｍｅ
の０．１５Ｍホスフェート緩ＩＭ５液（Ｐｉ（７，８）
が続いた。カラム溶出速度は０．０３４ｍ＋！／抄とし
た。次にそのパックにニードル位置緩 において更に２．６０１１１Ｎの水を充填した。次にそ
のパンクの内容物を３７℃に力り熱し、そして最初の４
個の・ぐツク凹部中の試剤を放出した。

この時点での反応混合物は１００　ｍＭ　ＨＥＰＪＩＣ
３緩衛版、５０酬ホスフ工−ト稜衝ＱＣｍ７．６）およ
び２酬塩化マグネシウムからなっていた。

６．５分後に０ＮＰＧを反応混合物に最終濃度が２−と
なるよう添加することによシ酵素反応を開始した。酵素
活性は、　０ＮＰＣ）添加の２９秒および４６秒後の４
０５　ｎｍでの吸光度差（変化速度）を測定することに
よシ測定した。

１０粒子凝集阻害を用い九ジゴキシン検定の増幅すべて
のアッセイｒｉａｃａ＠個別臨床分析器で３７℃で行っ
た。血清試料とＡの部でｖｆ４！！された抗体−酵素接
合体とを等容ずつ混合しそして２５℃で１５分間インキ
ュベートした。

インキュベーション後、　　０．０４ｍｆｆ１アリコー
トのその試料混合物をａｃａ［株］分析試験・ξツクに
自動注入し、そしてパックヘッダーのカラム（前記Ｂの
部ンを通して溶出した。試料の後に２ｍＱの０．１５Ｍ
ホスフェート緩衝液（ｐＩ（７８）が続いた。カラム溶
出速度は０．０６４ｍＱ／秒とした。

次にその、Ｊツクにニードル位置２（これはカラムをバ
イパスする）において更に２．９６ｍｅの０．１５Ｍホ
スフェート緩１＃孜（ｐｉ４７．８）を充填した。仄に
七の、＜ツクの内容物を３７℃に加熱しそして最初の４
個のパック凹部中の試剤を放出した。この時点での反応
混合物は４．９６雌（７）ホ、＋Ｃ７！−）ｍｕｇ　（
ｐＨ７，８）、ｏ、　１ｓ　ＧＡＦＡｃ（３１，４６％
（”／ｖ）ＰｉＧ８０００お工び０．０２％（”／ｖ）
ポリマーＳ子固体分（前記ｐの部）からなっていた。

３．５分後にモノクローナル抗−ＮＨＢ腹水液（０，０
０９ｍｇ、クローン２／４　）の添刀口によ勺比濁ｍｌ
Ｊ定阻害反応を開始した。粒子凝集による濁度増力日を
、抗体添加の２９秒および４６秒後の４０５ｎｍに２け
る吸光度差（変化速度）として測定した。第４表は未増
幅イムノアッセイ結果および本発明の方法を用いた増幅
結果の比較データを示す。この比較によシ本発明は試料
のサイズ”１０に減少させることができると同時に信号
生成を約５倍増大させることができること金示している
。

第４狭 （Ｌ５　　　　　　５４　　　　　　　３９４１．５　
　　　　　９８　　　　　　　２１２五５　　　　　　
０８　　　　　　　１２７畳　試料サイズ４００μＬ 骨畳　試料サイズ４０μβ 実施例　３ 次の実施例は本発明により提供される方法が検体中の臨
床上有意レベルの被分析物ヒト絨毛　　　・ゴナドトロ
ピン（ｈｃＧ）を測定できることを示す。

第１結合パートナーは抗−β−ｈＣＧ抗体とした。結合
接合体の遊虐接曾体からの分離は、　ｈｃＧで板積され
た固体支持体を含むアフイニテイ力ラムを用いて行った
。高層街性粒子はポリビニールナフタレンの中間殻およ
びポリグリシジルメタクリレートの外殻を有するポリス
チレンコアを含有した。リガンドは４−アミノ−２−二
トロフェノールとした。第２結合パートナーは。

キーホール・リンにット・ヘモシアニンに結合されｆｃ
３−ニトロ−４−ヒドロキシ′ｆｚ：息香酸よりなる兄
疫原に対して調製されたモノクローナル抗体とした。そ
の抗体は０−ニトロフェノールおよび４−アミノ−２−
ニトロフェノールに対して極めて交叉反応性であった。

基質はｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドとした。この方法は凝集阻害方式で行った。凝集速度
は２つの所定時間における４０５ｎｍでの光学密度を測
定することによシ測定した。

Ａ、抗体−醇索接合体の合成 ６ダの７−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＥＸＡグレード、　
　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社襄）’＆
：５ｍＱ。

の０．０５Ｔｒｉｓ　Ｈ（Ｊｌ　（ｐＨ７，０）、　０
．１４Ｍ　ＮａＣＪｌ、１ｍＭ’Ｍｇ０Ｊ１２　、５　
ｍＭ　ＫＤＴＡに溶解し、　次いで１．１μβのＮ、Ｎ
’−ジメチルホルムアミドに溶解した１４．７℃ｇｆ）
ｏ−フェニレン−シマレイミドと混合した。４℃で１６
時間後、その混合物を前述と同じＴｒｉｓ−ＮａＯｎ−
ＭｇＣＪ１２−ｇＤＴＡ緩備液を用いて３ｅｐｈａｄｅ
ｘ　Ｇ　−２５カラム（１，５Ｘ４０ｔＭ）でのクロマ
トグラフィにかけた。重合したβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼをボイド容を画分からプールした。

β−ヒト絨毛ゴナドトロピン（β−ｈｃｏ　。

Ｈ１ｂｒｉｔｅｃｈ社装）を１ぶの０．０１５Ｍ燐酸ナ
トリウム（ｐｉ（７，Ｑ）、０．１５　Ｍ　ＮａＣＡ　
、　１　ｍＭ　ＫＤＴＡに対して４℃で１６時間透析し
た。透析の説、抗１４ｃＴ：５．９μ２のＮ、Ｎ’−ジ
メチルホルムアミドに浴解し／ヒ５９μｇのスクンンイ
ミジル−４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサ
ン−１−カルボキシレートと２０〜２６℃で１時間反応
させた。その混合ｍ’ｔ、０．０１５Ｍ１１ｔ１１ナト
リウム（ｐｌ（７，０八〇、　１５　Ｍ　Ｎａ０Ａ、ｉ
　ｍＭ　ＥＤＴＡ　　中で平衡させた５ｅｐｈａｄｅｘ
　Ｇ　−２５カラム（ｔ５Ｘ　４０　ｃｍ　）に遡すこ
とによって反応を止めた。

カラムのボイド′＃量に溶出するマレイミド−ＩｇＧア
ダクトをプールしそして加圧濾過によ、ｊ７１．１３ｍ
１！Ｋｄ縮した。

１．１６峨（α６１ｔ９／峨）のそのマレイミド−ｒｇ
Ｇを５．７３ｍＪ！の前記の重合させたβ−Ｄ−ガラク
トシダーセ（０゜８７■／ｍｔ）と組み合わせそして４
℃で２０時間行った。その混合物を加圧濾過により２．
０　ｍＱ　Ｋ　濃縮しそして次に０．０５　ＭＴｒｉｓ
　ＨＯＪＩ（ｐＨ７，５）、　０．１５ＭＮａＣ１，０
，０００１ＭＭｇ０ｆ１２中で平衡させた５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　４　Ｂカラム（１，５Ｘ　９０ｃｎ）でのクロ
マトグラフィに４″Ｃでかケ友。ＩｇＧ−β−ガ２クト
シダーゼ接合体はカラムのボイド８’４にとして溶出し
た（β−ｈｃｏに対する微量滴定プレー）　ｆｆ１ＬＩ
ｓＡ検定によシ確認ン。

Ｂ、　　ｈｃＧ樹脂の合成 ヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＯＧ）　（Ｏｒｇａｎｏｎ
Ｉｎｃ、製）を１．１′−カルボニルジイミダゾール活
性化Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　Ｔ８Ｋ　ＨＷ−／）　５Ｆ　
（Ｐｉｅｒｃｅ　（Ｔｈｅｍｉｃａ１社製）に結合し九
。ｈＣ（）（１９，２１１ｄｌ）を４ｏｍｔの０．１Ｍ
炭酸ナトリウム緩衝ｇ（Ｐｉ−１８，５）に溶解しそし
てこの緩衝液に対して透析した。４０峨の樹脂固体分を
１１の冷炭酸塩緩衛欧で洗浄した。透析したｈｃＧ溶ｇ
を前記ゲルに添加しそして回転器上で４℃で一夜混合し
た。次にそのゲルを前記炭酸塩緩衝液で洗浄して禾粕合
ｈｃＧを［去した。樹脂上のすべての残留活性基１に０
．０５　Ｍ　Ｔｒｉｓ緩＃ｇ（ＰＨ７，５）中０．１Ｍ
グリンン８０ｄ？施加しそして４℃で一夜インキユベー
トすることによってブロックした。

最後に、その樹脂を０．０１係アジ化ナトリウム言有０
．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｉｉ１１４７，５）で徹底的に洗
浄した。

Ａの部で得た抗体−酵素接合体（０，０１５ｍｆｉ）金
谷撞閾匿のｈＣＧを含有する個別試料１．２　ｍｌに隙
加した。０．５％ヒト血清アルブミン含有０、［］５　
Ｍ　Ｔｒｉｓ緩伽ｄ（ｐＨ７，２）にｈｃｃ）を、溶解
することによりキャリブレータ（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ
ｓ）　ｔ″調製した。１時間室温でインキュベーション
した後に、５峨のその混合物を１．２峨の０．１５Ｍホ
スフェート緩衝液（ｐＨ７ｊ）を用いて０．０１ｒｎｅ
／抄の流速で２　ｍｅ　ｈＣＧカラム（前記Ｂの部参照
）に通した。そのカラムに結合しなかったすべての仇体
＃嬌接合体を含有する１、　７　ｍｇ。

−分を集め友。

抗体−酵素接合体活性の測定は丁べてＤｕＰｏｎｔ　ａ
ｃａ■　個別臨床分析器で３７℃で行った。前記ｉ、７
ｍ１画分を１ｍＭ塩化マグネシウム含有０．１Ｍ燐酸ナ
トリウム（ｐｉ（７，８）３．３鍼に添加した。１．５
分間インキュベーションを行ったｆｆｌ、２．８１１１
ｆの０ＮＰＧおよび０．１１ｍＱの６．４Ｍβ−メルカ
プトエタノールを添加することによって反応を開始させ
た。抗体−酵素接合体による０−ニトロフェノールの生
成に起因する吸光度を反応開始の３．５分後に４Ｑ５ｎ
ｍでの吸光度から６００　ｎｍでの吸光度を差引いた差
として測定した（終点測定）。

Ｄ１粒子凝集阻害を用いたｈＣＧアッセイのＪａ幅抗体
−酵素接合体のインキュベーションおよびｈｅＧ榴脂で
の分離葡Ｃの部に記載のとおり行った。抗体−酵素接合
体活性の測定はすべてＤｕ　Ｆｏｎｔ　ａｃａ（！９個
別臨床分析器で６７℃で行った。その１．７ｍ１ｌカラ
ム画分金集め、そして０．０２謔アリコートを、１．４
６％１Ｇ８０００．０、１　％　Ｃ）ＡＦＡＣ篭０．０
６　％　０ＮＰＧおよび’ｌ　ｍＭ　Ｍｇ０Ｊ２２を含
有する０、１５Ｍホスフェート緩衝液（１））１７．８
）４．９８ｍ１に添加した。マウスモノクローナル抗−
ＮＨＢ膿水Ｍ（０，０２＋１１ｆｆｉ、クローンＶ８）
全添加し、そして６．５分間のインキュベーションの後
、２．４チ固体分を含有するＡＮＰ　ａ子試剤（実施例
２．　Ｄの部参照）０．０５ｍ１の添加によシ反応を開
始させた。粒子凝集による濁度増加を反応開始の２９秒
および４６秒後の４０６　ｎｍでの吸光度差（変化速度
）として測定した。

第５表 ０　　　　　　　　０．２５７９　　　　　　　　　　
２４４５　　　　　　　　０．２６７９　　　　　　　
　　　　２４１１０　　　　　　　　０．２９９７　　
　　　　　　　　２１４２５　　　　　　　　０．３７
９４　　　　　　　　　　１６１５０　　　　　　　　
０．５９９８　　　　　　　　　　　８２１００　　　
　　　　　１．０５０Ｇ　　　　　　　　　　　　１３
４）１．７ｍ１ｌのカラム溶出ａｔ検定にｄ用。

１４）０．０２−のカラム溶出液を検定に使用。

この表は、至適化された終点測定からのデータと、至適
化された粒子凝集検定（すなわち速度測定〕からのデー
タを比較している。

この比較デー示すように・本発明０方法　　　　１は、
未増幅反応に参画する抗体−酵素接合体よジも８５倍も
低い濃度の抗体−醇累接合体ｋｍ果反応に参ＵＭ避せた
場合であってさえ。

艮好な感度を与える。

実施例　４ ヒト絨毛レナドトロピン（ｈｃＧ）の測定次の実施例に
首まれる抗体−酵素接合体の合成は実施例３．Ａの部に
記載されている。ＡＮＰ程子粒子および抗−ＮＨＢ抗体
はそれぞれ：５４！施例２、ＣおよびＤの部に記載され
ている。

Ａ、　　ｈＣＧサンドイッチ検定（従来技術）ｈＣ（）
分子の抗原部位に対するモノクローナル抗体で仮覆され
たプラスチックビーズをＨｌｂｒｉｔｅｃｈ　Ｉｎｃｏ
ｒｐｏｒａｔｅｄから商業的に入手しうるＴａｎｄｅｍ
　　−１２）（ＣＧキットから得た。ｈｃＧ標準は、２
００　ｍｌＵ／ｍｅのＴＡＮＤＪ！ＸＭＴＭ−Ｊ！ｉキ
ャリブレータを前記ＴＡＮＤＦ４　−Ｊｌｉキットと共
に供与されるゼロ希釈剤で希釈することにより調製した
。抗体−Ｆ酵素接接合体Ｑ、００５ｍｅ）および０．１
鍼の血清−ｈＣＧ試料またはｈＣＧ標準を０．１チＧＡ
Ｆ’ＡＣ’！’言有０．１５Ｍホスフェート緩衝液（−
７、８）で予め洗浄したＴａｎａｅ＋ｎＴＭ−Ｅ抗体ビ
ーズ１個を含有するプラスチック管に添加した。

室温で６０分間１７０　ｒｐｍで回転させることによシ
混合を行った。次にそのビーズをその管内で０．１５Ｍ
＊スフｚ−ト、ａ、　１　％　ＧＡＦＡｃ’ａ緩衝液ｔ
２峨緩衝液−２峨回連続的に洗浄し、次いで１　ｍＭ　
Ｍｇ（Ｊ２含有０．１５Ｍホスフェート（ｐｉ（７，８
）を２．０鍼ずつ用いて６回洗浄した。

最終洗浄液を傾瀉しＳｏ、１５Ｍホスフェート。

１、２　ｍＭ　ＭｇＣＪＩ　２緩衝漱に溶解した０、０
６％　　０ＮＰＣ）１、０　ｉＮをそのビーズに添〃口
した。６０分間室温でインキュベーションした後、液体
をビーズから除去することによｐ反応を止めた。そのビ
ーズに結合した抗体−酵素接合体によるＯＮＦの生成に
起因する吸光度ｆ−、ＨｅｖｌｅしをＰａｃｋａｒｄ８
４５０Ａ分元光度計を用い４０６　ｎｍで測定した。

Ｂ、　　Ｍ子凝集阻ｇを用いたｈｃＧ？ンドイツチ検足
の壇１鴫 ０．１係Ｌ）ｆｉＦＭＥ■＠有０．１５Ｍホスフェート
緩１；Ｕｌｔ（ｐ）＋７８）で予め玩浄したＴａｎｄｅ
ｍ　　−ＩＣ抗体ビーズ１１固を含むプラスチック試験
管に抗体−酵索受合体（０，００２＋１１ｆｆｉ）およ
び血清ｈＯＧ試料（０，１ｍ１ｌ）を添加した。室温で
９０分間１７０ｒｐｍで回転させることによシ混合を行
った。

そのビーズを試験管内で、０．１５Ｍホスフェート、０
．１％ＧＡＦＡＣ［有］緩衝液を２．０−ずつ用いて６
回連続的に洗浄し１次に１．２　ｍＭ　Ｍｇ０ｊｉ　２
含１ｏ、ｏ９Ｍホスフェート（ｐｉ４７．８　）を２．
　Ｏｍｔずつ用いて５回洗浄した。最終洗＃液を頑瀉後
。

０．０９Ｍホスフェート、１．２　ｍＭ　ＭｇＣｆ１２
緩衝液に俗解した０、　２　ｍｆｆ１の０．０６チ０Ｎ
ＰＧをそのビーズに添〃口し九。ヱ温で１０分間インキ
ュベーションしている間に結合接合体によるＱＮＦへの
基貞ターンオーバーが生じた。１０分間のインキュベー
ションの後ビーズから液体を除くことによシＯＮＰ試料
を得た。（試料中のｔ）ＮＰ濃度はｈｃｏ　６度に正比
例した）。ｈＣＧ　ｇ４準はＡの部に記載のとおシにＡ
ｌ１製した。

ビーズ上筐中のｏＮｐａ［の測定はすべて０ｏｂａａ　
Ｂｉｏ　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　０ｅｎｔｒｉｆ’ｕｇａ
ｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏａｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍａ製）で行った。

前記ＯＮＰ試料（０，０８ｍ１）を、１．５チＰＥＧ　
８０００．０．１％ＧＡＪ’ＡＯ懺２　ｍＭ　Ｍｇ（Ａ
２および０．０５チ餅Ｐ粒子試剤固体分（実施例２．Ｄ
の部）を含む０．１２ｍｆｆ１の０．１５Ｍホスフェー
ト緩衝液（ｐｉ４７．８）に添加した。６０秒間のイン
キュベーション時間の後、ｏ、　ａ　ｏ　ｉ　ｍｅの抗
−ＮＨＢマウスモノクローナル腹水液（クローンｚ／７
）を４ガロすることにより反応を開始した。粒子凝集に
よるＰＡ度壇加Ｊｒ、反応開始の１０秒から２０秒後の
４０５　ｎｍでの吸光度差（Ｋ比速度）として側層した
。第６表は、サンドインチ法と粒子増幅サンドイツチ法
よりなる血清ｈＣＧ標準曲線のデータを示す。

第６表 ０．２　　　　　　　ｎａ　　　　　　　４４２Ｑ、５
　　　　　　　ｎｄ　　　　　　　３４２１、Ｏｎｄ　
　　　　　　５０５ ２、Ｏｎｄ　　　　　　　２１８ ５．０　　　　　　６２　　　　　　　５６１０．０　
　　　　　６８　　　　　　　１６２５．０　　　　　
　１０１　　　　　　　　ｎｄ５０．０　　　　　　１
７０　　　　　　　　ｎｄｌｏｏ　　　　　　　２５９
　　　　　　　　ｎｄ２００　　　　　　４０８　　　
　’　　　　ｎｄｎｄ　＝測定されず サンドインチ検定は、まず、板験ｈＣＧ嬢度範囲にわた
って最高の感度を生じるように至適化し１次に粒子増幅
系を同じｈＣＧ範囲にわたって最大の収子凝集阻害が得
られるよう至適化した。データから示されるように、サ
ンドインチ終点検定によシ１０〜２５　ｍＩＵ　ｈＣＧ
に相当する有意の吸光度変化が生じ、一方１粒子増幅系
により、０．２〜０．５　ｍｌＵ　ｈＣＧに相当する有
意の吸光度変化が得られる。このことは発色原信号検出
に対して至適化されたサンドインチ終点検定に対し約５
０倍の感度向上を意味する。

実施例　５ 次の実施例は１本発明によシ提供される直接凝集法を酢
索活性測度に用いた例である。この実弛例において、高
屈折性粒子はポリビニールナフタレンの中間殻とポリグ
リシジルメタクリレートの外、ａｖ：有するポリスチレ
ンコアを有する。結合却」はノ１ブテンの６−ニトロ−
４−ヒドロキ７安息ｆ　ＩＲＶこ対して調製された抗体
が用いらｎよう。ｆｉｌは前記高屈折性粒子の外殻に共
有績せ的に結合し９る６−ニトロ−４−０−（β−Ｄ−
ガラクトピラノシル）安息香酸が用いられよう。酵累β
−ガラクトシダーゼは粒子表面のガラクトピラノシル縛
導体を原水分解することになろう。次いで結合剤の存在
下に直接粒子鍜果が生起しよう。凝集度は肉眼的に観察
して＃′：Ｊｇ活性の定性的な測定足置を得ることがで
き。

あるいは８液の重性変化を機器によシ測定して定置的結
果を得ることができよう。

この実施例では高屈折性粒子に結合しうるβ−ガラクト
シダーゼの基質を必要とする。

リガンドの３−ニトロ−４−ＩＪ−（ｓ−Ｄ−ガラクト
ピラノフル）女息含酸（ＮＧＢ）はこの要件をイ屑たす
であろう。このアナログの合成に適合し得る手順の一例
はり、Ｈ，Ｌｅａｂａｃｋにより　、　　Ｊ　、Ｗ、Ｗ
ｏｏｌｌｅｎおよびＰ、Ｇ、Ｗａｌｋｅｒによる論文の
アはンデイクスに与えられている（１’−０１１ｎ。

Ｃｈｅｍ、Ａｃｔａ、Ｊ（１９６５）１２，６４７．６
５８８照〕。

アセトブロモガラクトース（１ｊｌ、２．４４　ミリモ
ル）および３−ニトロ−４−ヒドロキ７安息査酸（０，
４１，２，２０ミリモル）をメタノール（Ｉ　Ｑｍｉ）
にａ解しそして１Ｎ水酸化ナトリクム（２，２１１１）
を攪拌しながら徐々に添加する。その混合物を室温で１
６時間放置してからメタノールを減圧下に除去するとシ
ロップが残る。久に、そのＮＧＢ物貞は、前記引用文献
に記載の手順と同様によシ、ブロック除去および精製さ
れよう。

Ｂ、アミン変性ポリマー粒子の合成 ジアミン２，２−オキシビス（エチルアミンンジ狐酸堰
（４２０１１Ｐ）および０．０６峨の１０チＶ７ＧＡＦ
ＡＣの／水溶液を４．７１１１１の５ｆｆ１Ｍ燐酸ナト
リウム緩ｗＩ孜（ｐｉ４８．０）に添加することができ
る。

その浴欧の州を−１０，０〜１０．１に調節しそして１
．２−のコア／殻ポリマー粒子（実施例１゜Ｃの部）を
その混合物に添刀口する。その溶液を７０°Ｃに３時間
／７Ｇ熱しそして室温まで放冷する。その変性粒子ｔ０
．１％Ｃ）ＡＦ’ＡＯ■含有１５吐燐酸ナトリウムＭ衝
孜（ｐｉ（７，０）で希釈する。

それら粒子を１ｓ、ｏｏｏｒｐｍで９０分間遠心分離し
てはレットを形成し、そして上澄を傾瀉する。それら粒
子をホスフェート／　ＧＡＦＡＣ［株］溶液に再碓濁し
そして再度遠心分離する。この遠心分離および再懸濁過
程を全部で４回繰り返して未反応ジアミンを除去する。

最終的況浄の後、父性粒子をホスフェート／ＧＡＦＡＣ
”緩１Ｉｉｉ′ｇ、中で全容１１１ｍ１ｉとする。

Ｃ，Ｎ（）ＢＩＪガントのアミン変性ポリマー粒子への
結合 Ａの部に記載したＮＧＢ基質（９，１ｗ９．０．０２ｃ
ｉミリモル）を１−エチル−６−（３−ジメチルアミノ
プロピルフカルボジイミド（５，２〜、０．０２７ミリ
モル）を含有する０、１７ＩＩＩｅのジ）ｆルスルホキ
シドに溶解し、そして室温で２時間放置する。そのＮＧ
Ｂ溶液と０．０６１！Ｉｔの１０％”／ｖ　ＧＡＦＡＯ
■／水溶液は次に２．　Ｏｍｌの５ｍＭ燐酸ナトリウム
緩衝液（ｐ８７．０）に希釈されることになろう。その
溶液の−を−ＺＯ〜Ｚ１にＡＩし、セしてｉ、　ｏ　ａ
ｔのアミン変性コア／殻枝子（前記Ｂの部）を反応系に
添加する。その混合物を４°Ｃに冷却しそして１６時間
インキュベートする。その粒子試剤ヲ０．１％ＧＡＦＡ
Ｃ＠’Ｂ！　１５　ｍ　５Ａ酸ナトリウム緩面販（ｐｉ
４７．０）で希釈する。それし粒子に：、　１８．００
　Ｏｒｐｍで９０分開運心分離してはレットを形成し、
そして上澄を１頃瀉する。それら粒子をホスフェート／
（）ＡＪ’ＡＣ［有］溶液に再懸濁しそして再度遠心分
離する。この遠心分離および再懸濁過程を全部で４回様
り返して未反応ＮＧＢ　を除去する。最終的洗浄の後、
リガンド（基質ン粒子をホスフェ−）　／　ＧＡＦＡＣ
■緩備液中で全容量１０ｍ１とする。

実施例１（、Ｉの部参照）でａｌｌ製されたβ−ガラク
トシダーゼ遵続希釈液は検定に用いるのに適切であろう
。好都合の竜の谷β−力゛ラクトンダーゼ希釈液を、０
．１５Ｍホスホスフェートｄｕ？［（ｐＨ７，８）、０
．１チＧＡＦＡＯ■、１．４６　％’！為ＰＫＧ８００
０および０．０２％固体分Ｗ／ｖのリガンド粒子（前記
Ｃの部参照）よりなる混脅物に添加する。反応温度はす
べての検定に対して等しくしなければならず、そして便
宜上選択されるが、２５°〜３７℃が好ましい。β−ガ
ラクトシダーゼの検定混せ物への添加によシ、粒子表面
の３−ニトロ−４−０−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル
）安息香酸は５−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸に加
水分解される。次に、粒子上の原水分解生成物は結合す
るが未加水分解リガンドは結合しない適宜ＯＫの抗体の
存在下に直接粒子凝集が行われることになろう。前記実
施例１および２で調製された抗−ＮＨＢ抗体は、前記実
施例において３−ニトロ−４−ヒドロキシ安恩査酸結合
ポリマー　　　　１粒子の凝集を生起させることが示さ
れているので、これらの検定に用いるのに適切であろう
。仇−ＮＨＢ抗体がＩ−ガラクトシダーゼの添）ＩＱ　
＝＋１または添加と同時に存在していれば直接粒子凝集
はリガンド訓水分解と同時に生起しうる。あるいはまた
、その凝集反応は、抗−ＮＨＢ抗体の麻〃ロヲ遅らせる
ことによシ、β−ガラクトシダーゼ麻加後、任意の都合
のよい時点で開始させることができる。板子凝集屁は、
足性的または定量的結果の要請に応じて、内眼的にある
いは機器的に測定することができる。

外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）（１）（ｉ）リガンドを上に付着した高屈折性粒子
   、（ｉｉ）そのリガンドに対し特異的で少くとも２つの
   リガンドに結合しうる結合パートナー（該結合パートナ
   ーとリガンドとは凝集を可能にする濃度で存在せしめる
   ）、および （ｉｉｉ）酵素の基質（酵素、基質、リガンドおよび結
   合パートナーは、酵素と基質との反応により結合パート
   ナーに対してリガンドと拮抗する生成物が生成するよう
   なものとする） よりなる凝集系を形成し、 （２）その凝集系を検体と接触させて結合パートナーに
   対しリガンドと拮抗する生成物を生成せしめ、 （３）その凝集系の物性（その物性は凝集の関数である
   ）を測定し、そして （４）測定値を検体中に最初に存在していた酵素量に関
   連づける ことよりなる液状検体中の酵素を検出するための凝集に
   基づく方法。 ２）酵素がβ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファ
   ターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキ
   シダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ラクタマーゼよりなる
   群から選択される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）高屈折性粒子が本質的に球状である特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ４）本質的に球状の粒子が３０ｎｍ〜１００，０００ｎ
   ｍの範囲の直径を有する特許請求の範囲第３項記載の方
   法。 ５）直径が３０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である特許請求
   の範囲第４項記載の方法。 ６）高屈折性粒子がアガロース、ポリデキストラン、ポ
   リアクリルアミド、ポリスチレンおよびポリビニルナフ
   タレンよりなる群から選択された物質よりなる特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ７）結合パートナーが少くとも２つのリガンド結合部位
   を有する抗体である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８）酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、基質がｏ−ニ
   トロフェニル−β−ガラクトピラノシドであり、リガン
   ドが３−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸またはｏ−ニ
   トロフェノールであり、そして結合剤が抗−３−ニトロ
   −４−ヒドロキシ安息香酸抗体である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ９）酵素がアルカリ性ホスファターゼであり、基質がｐ
   −ニトロフェニルホスフェートであり、リガンドがｐ−
   ニトロフェノールであり、そして結合剤が抗−ｐ−ニト
   ロフェノール抗体である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 １０）物性が光学的性質である特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 １１）（１）酵素と被分析物に結合しうる第１結合パー
   トナーとよりなる接合体に検体を接触させ、それによつ
   て接合体の一部を被分析物に結合させて複合体を形成さ
   せそして接合体の一部は遊離（フリー）状態とし、 （２）その遊離接合体を複合体から分離し、 （３）遊離接合体または複合体のいずれかを、 （ｉ）リガンドを上に付着した高屈折性粒子、 （ｉｉ）少くとも２つのリガンドに結合しうる第２結合
   パートナー（該第２結合パート ナーとリガンドとは凝集を可能にする濃度で存在せしめ
   る）、および （ｉｉｉ）酵素の基質（酵素、基質、リガンドおよび第
   ２結合パートナーは、酵素と基質との反応により第２結
   合パートナーに対してリガンドと拮抗する生成物が生成
   するようなものとする） よりなる凝集系と接触させ、 （４）凝集系の物性（その物性は凝集の関数である）を
   測定し、そして （５）測定値を液状横体中に最初に存在していた被分析
   物量に関連づける ことよりなる液状検体中の被分析物を検出するための凝
   集に基づく測定方法。 １２）酵素がβ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスフ
   ァターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオ
   キシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ラクタマーゼよりな
   る群より選択される特許請求の範囲第１１項記載の方法
   。 １３）第１結合パートナーが抗被分析物抗体である特許
   請求の範囲第１１項記載の方法。 １４）高屈折性粒子が本質的に球状である特許請求の範
   囲第１１項記載の方法。 １５）本質的に球状の粒子が３０ｎｍ〜１００，０００
   ｎｍの範囲の直径を有する特許請求の範囲第１４項記載
   の方法。 １６）直径が３０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲にある特許請
   求の範囲第１５項記載の方法。 １７）高屈折性粒子がアガロース、ポリデキストラン、
   ポリアクリルアミド、ポリスチレンおよびポリビニルナ
   フタレンよりなる群より選択された物質よりなる特許請
   求の範囲第１１項記載の方法。 １８）第２結合パートナーが少くとも２つのリガンド結
   合部位を有する抗体である特許請求の範囲第１１項記載
   の方法。 １９）酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、基質がｏ−
   ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシドであり、リガ
   ンドが３−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸またはｏ−
   ニトロフェノールであり、そして第２結合パートナーが
   抗−３−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸抗体である特
   許請求の範囲第１１項記載の方法。 ２０）酵素がアルカリ性ホスファターゼであり、基質が
   ｐ−ニトロフェニルホスファターゼであり、リガンドが
   ｐ−ニトロフェノールであり、そして結合剤が抗−ｐ−
   ニトロフェノール抗体である特許請求の範囲第１１項記
   載の方法。 ２１）物性が光学的性質である特許請求の範囲第１１項
   記載の方法。 ２２）（１）（ｉ）酵素と反応した際にリガンドに転化
   されうる基質を上に被覆せしめた高屈折性粒子、および （ｉｉ）少くとも２つのリガンドに結合しうるが基質に
   は結合しえない結合パートナー よりなる凝集系を形成し、 （２）その凝集系を検体と接触させて基質をリガンドに
   転化し、 （３）凝集の関数である凝集系の物性を測定し、そして （４）測定値を検体中に最初に存在していた酵素量に関
   連づける ことよりなる液状検体中の酵素を検出するための凝集に
   基づく方法。 ２３）酵素がβ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスフ
   ァターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオ
   キシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ラクタマーゼよりな
   る群より選択される特許請求の範囲第２２項記載の方法
   。 ２４）高屈折性粒子が本質的に球状である特許請求の範
   囲第２２項記載の方法。 ２５）本質的に球状の粒子が３０ｎｍ〜１００，０００
   ｎｍの範囲の直径を有する特許請求の範囲第２４項記載
   の方法。 ２６）直径が３０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲にある特許請
   求の範囲第２５項記載の方法。 ２７）結合パートナーが少くとも２つの結合部位を有す
   る抗体である特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２８）酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、基質が３−
   ニトロ−４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）安息
   香酸であり、そして結合パートナーが抗−（３−ニトロ
   ）−４−ヒドロキシ安息香酸抗体である特許請求の範囲
   第２２項記載の方法。 ２９）（１）酵素と被分析物に結合しうる第１結合パー
   トナーとよりなる接合体に検体を接触させ、それによつ
   て接合体の一部を被分析物に結合させて複合体を形成さ
   せ、そして接合体の一部を遊離状態とし、 （２）その遊離接合体を複合体から分離し、 （３）遊離接合体または複合体のいずれかを （ｉ）酵素と反応した際にリガンドに転化されうる基質
   を上に被覆せしめた高屈折性粒子、および （ｉｉ）少くとも２つのリガンドに結合しうるが基質に
   は結合しえない結合パートナーよりなる凝集系と接触さ
   せ、 （４）凝集の関数である凝集系の物性を測定し、そして （５）測定値を検体中に最初に存在していた酵素量に関
   連づける ことよりなる液体検体中の被分析物を検出するための凝
   集に基づく方法。 ３０）第１結合パートナーが抗被分析物抗体である特許
   請求の範囲第２９項記載の方法。 ３１）酵素がβ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスフ
   ァターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオ
   キシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ラクタマーゼよりな
   る群より選択される特許請求の範囲第２９項記載の方法
   。 ３２）高屈折性粒子が本質的に球状である特許請求の範
   囲第２９項記載の方法。 ３３）本質的に球状の粒子が３０ｎｍ〜１００，０００
   ｎｍの範囲の直径を有する特許請求の範囲第３２項記載
   の方法。 ３４）直径が３０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲にある特許請
   求の範囲第３３項記載の方法。 ３５）高屈折性粒子がアガロース、ポリデキストラン、
   ポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびポリビニル
   ナフタレンよりなる群から選択される物質よりなる特許
   請求の範囲第２９項記載の方法。 ３６）第２結合パートナーが少くとも２つのリガンド結
   合部位を有する抗体である特許請求の範囲第２９項記載
   の方法。 ３７）酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、基質が３−
   ニトロ−４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）安息
   香酸であり、そして結合パートナーが抗−（３−ニトロ
   −４−ヒドロキシ）安息香酸抗体である特許請求の範囲
   第２９項記載の方法。 ３８）物性が光学的性質である特許請求の範囲第２９項
   記載の方法。