NO171643B - Antistoffer med dobbelte spesifisiteter, deres fremstilling og anvendelse - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et hybrid monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro, idet antistoffet har dobbelt spesifisitet og er fremstilt fra et polydom, og det særegne ved antistoffet i henhold til oppfinnelsen er at nevnte hybride antistoff er fremstilt ved fusjon av to hybridomer, eller et hybridom og en miltcelle (B-lymfocytt), eller fremstilt ved å fjerne kjernen fra et første hybridom og innføre den i cytoplasmaet av et annet hybridom, idet antistoffet er en komponent av en blanding av antistoffer omfattende det hybride antistoff og to species av mono-spesifikke antistoffer i et forhold på omtrent 2:1:1.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av det nevnte monoklonale antistoff til immunokjemiske analyser.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.

Antigen-antistoffreaksjonen utnyttes allerede rutinemessig ved en rekke praktiske anvendelser og det undersøkes intenst for å etablere dens verdi for andre hittil ikke påviste anvendelser. F.eks. kan serumantistoffer frembragt av et vertsdyrs immunrespons til et immunogen anvendes ved affinitets-renseprosesser for å isolere immunogenet fra oppløsninger hvori det bare foreligger i små mengder.

Under andre omstendigheter, hvis immunogenet er et sykdoms-assosiert antigen, kan dets nærvær i en pasients serum eller annen kroppsvæske påvises under anvendelse av immunoanalyse eller immunometriske metoder. F.eks. er påvisning av HBsAg under anvendelse av en radioimmunometrisk teknikk den for tiden valgte metode. På en annen front er serumantistoffer til ferritin, oppnådd fra New Zealand hvite kaniner og merket med <131>I, rapportert som lovende for behandling av lever-tumorer (se Order at al., International Journal of Radiation Oncology, Biology and Physics, 6, 703 (1980)). Serum-antistoffer, f.eks. dem som oppnås fra kaniner, murine species eller andre pattedyr, er "polyklonale" av natur da immunsystemet i verten stimuleres til å frembringe en blanding av spesifikke antistoffer rettet på de forskjellige antigeniske determinanter eller epitoper på det immunogen som verten reagerer på. De individuelle antistoffer som utgjør blandingen er alle et produkt av et B-celleklon; videre utskiller hver B-celle bare ett spesielt antistoff. Det antistoff som produseres av et klon er forskjellig fra et antistoff mot det samme antigen fremstilt av et annet klon ved at det har minst en subtil forskjell mellom sin peptidsekvens og peptidsekvensen for det annet antistoff. Hvert antistoffspecies er derfor faktisk et distinkt molekyl og forskjellene i peptidsekvens mellom forskjellige species påvirker deres generelle spesifisiteter såvel som de spesielle epitoper som de gjenkjenner og deres affiniteter for antigenet.

En individuell B-celle kan ikke dyrkes uendelig under anvendelse av for tiden tilgjengelig vevdyrkingsteknikk for å oppnå det spesielle antistoff den utskiller som en ren forbindelse. Forholdsvis nylig oppdaget Kohler og Milstein og rapporterte en prosess hvorved et monoklonalt antistoff kan oppnås på grei måte som utskillingsproduktet av en hybrid celle omtalt som et "hybridom". (G. Kohler og C. Milstein, Nature, 256, 495 (1975)). I grunntrekkene innbefatter prosessen fusjon av miltceller tatt fra en immunisert mus med muse-myelomceller til å danne hybridomet. Myelomceller som ikke fremstiller eller i det minste ikke utskiller sitt eget immunoglobulin eller deler derav, foretrekkes. Kulturer av celler oppnådd ved kloning av et enkelt hybridom vil utskille identiske antistoffmolekyler som deretter lett kan oppnås som en ren kjemisk forbindelse. Dette er i motsetning til de konvensjonelle antistoff preparater oppnådd f. eks. fra serum, hvori det enkelte antistoff er bare en av komponentene i en hovedsakelig ikke-separerbar antistoffblanding av beslektede, men likevel distinkte kjemiske forbindelser.

Da det er en ren forbindelse, vil et monoklonalt antistoff ha en konstant spesifisitet for et enkelt sete på antigen-molekylene og en godt definert affinitet. Således kan kloner av forskjellige hybridomer behandles for selektering av dem som frembringer det monoklonale antistoff med de mest ønskelige egenskaper for en gitt anvendelse. Udødeligheten av hybridomet garanterer en nesten ubegrenset forsyning av det antistoff som det utskiller og eliminerer problemer forbundet med varians i antistoff-titer og total affinitet fra dyr til dyr anvendt for fremstilling av serum-antistoffer. Monoklonale antistoffer oppnådd fra hybridomer har f.eks. vært praktisk anvendt i diagnose-sett.

Et antistoffmolekyl kan generelt anses å uttrykke en enkelt spesifisitet som fremvises overfor det immunogen hvortil vertens immunsystem reagerte ved fremstilling av antistoffet. Antistoffet er sammensatt av to identiske halvdeler hvorav hver omfatter et tungt og lett kjedepar og hvorav hver gjenkjenner den samme antigeniske determinant som den annen.

En -S-S- disulfid-bro som knytter sammen de to tunge kjeder ved stedet for cystein-andelene, kan vanligvis spaltes selektivt in vitro ved hjelp av en forsiktig reduksjon og de to halve molekyler disassosieres ved etterfølgende surgjøring. De halve molekyler kan så rekombineres (re-natureres), også in vitro, ved nøytral pH, idet re-assosieringen foregår ved ikke-kovalent interaksjon.

Hvis antistoffer av forskjellige spesifisiteter underkastes en selektiv spaltning av disulfid-broene mellom de tunge kjeder og betingelser som fører til renaturering deretter etableres, kan reassosiering mellom halve molekyler foregå tilfeldig til å frembringe en populasjon av antistoffer, hvorav i det minste noen er hybrider ved at en halvdel av et antistoffmolekyl med en spesifisitet kombinerer med en halvdel av et antistoffmolekyl med en forskjellig spesifisitet. F.eks. beskriver Nisonoff et al. "The Antibody Molecule", Academic Press, New York (1975) på sidene 260-261 en in vitro produksjon av et polyklonalt antistoffhybrid av kanin-antiovalbumin og anti-BGG antistoffer. Hybride monoklonale antistoffer er også oppnådd under anvendelse av en analog prosess. Se D.M. Kranz et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, 5807 (1981). I det minste teoretisk vil det hybride antistoff fremvise en dobbelt spesifisitet ved at en halvdel av antistoffet vil gjenkjenne og binde til en antigenisk determinant eller epitop, mens den annen halvdel vil gjenkjenne en forskjellig epitop på det samme eller et forskjellig antigen.

Selv om hybride antistoffer kan oppnås på den måte som er

beskrevet i det foregående, er utbyttene ofte meget lave, de reaksjoner som anvendes for å fremstille dem er vanskelige å reprodusere og de hybride antistoffer utsettes vanligvis for tydelig, irreversibel denaturering. Slik denaturering kan

redusere immuno-reaktiviteten og ville forventes å resultere i forskjellige metaboliske egenskaper in vivo. Som et resultat er det hybride antistoff hittil stort sett forblitt en laboratorie-kuriositet som er vanskelig å oppnå.

Antistoffer med dobbelte spesifisiteter kan også fremstilles ved konjugering av par av intakte antistoffer, monoklonale eller ikke, under anvendelse av en rekke koblings- eller fornetningsmidler som protein A (fra Staphylococcus aureus), karbodiimid og bifunksjonelle forbindelser som f.eks. N-succinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat for å oppnå dimere og høyere antistoff-multimerer hvortil hvert medlem av antistoffparet bidrar med sin spesifisitet. F.eks. har Mandoche et al. rapportert dannelse av multivalente antistoffer med dobbelte spesifisiteter ved hjelp av en sekvensmessig reaksjon av antistoffer med protein A, som er blitt vist å være i stand til påvisning av celleoverflate-antigener in vitro. Se J. Immunological Methods, 42, 355, (1981). Ved denne metode binder antistoffer med en spesifisitet til overflate-antigenet og de andre til en andel som tillater påvisning.

Syntesen av antistoffer med dobbelt spesifisitet ved hjelp av de foregående metoder er komplisert og ingen kommersiell utøvelse av dem er hittil foretatt.

De hybride monoklonale antistoffer i henhold til oppfinnelsen kan fremstilles i gode utbytter uten denaturering. I denne fremstilling vil betegnelsen "hybrid antistoff" anvendes for å betegne et enkelt antistoffmolekyl med to forskjellige spesifisiteter. De individuelle spesifisiteter kan være til antigeniske determinanter på to forskjellige antigener eller til forskjellige antigeniske determinanter (epitoper) på det samme antigen. Videre omfatter også betegnelsen "antigen" også haptener hvis ikke annet er angitt.

De hybride antistoffer med en dobbelt spesifisitet i henhold til oppfinnelsen oppnås ved fusjon av et hybridom, foretrukket et selektivt destruerbart hybridom, som utskiller et antistoff mot en forhåndsselektert antigenisk determinant med en fusjonerbar B-lymfocytt eller et annet hybridom, idet B-lymfocytten eller det annet hybridom utskiller et annet antistoff mot en annen antigenisk determinant, til å danne et annen generasjons hybridom (i det følgende "polydom"). Som anvendt heri betyr betegnelsen "selektivt destruerbart hybridom" et hybridom som mangler eller i det minste hovedsakelig mangler evne til å overleve i det medium hvori polydomet dyrkes. Det er uventet funnet at til forskjell fra opphavshybridomet eller den B-lymfocytt hvorfra det er avledet, som hver utskiller en populasjon av identiske antistoffer med en enkelt spesifisitet, utskiller polydomet i tillegg en høy %andel av et monoklonalt hybrid antistoff med en dobbelt spesifisitet, dvs. en evne til å binde med hvilken som helst av de antigeniske determinanter som gjenkjennes av de individuelle antistoffer produsert av opphavscellene eller med begge determinanter samtidig. Det hybride monoklonale antistoff som oppnådd på denne måte, har ikke vært utsatt for den uønskede denaturering som karakteriserer hybrider oppnådd fra prosessen med kjemisk rekombinering av antistoff-halvmolekyler. Videre tillater den her anvendte metode at hybridet kan oppnås sikkert og i store mengder.

De hybride monoklonale antistoffer i henhold til oppfinnelsen kan anvendes for immunodiagnose. Generelt anvender slike prosesser et monoklonalt antistoff eller polyklonale antistoffer med en første spesifisitet mot et målantigen og en annen spesifisitet mot en substans, f.eks. et annet antigen eller hapten, som tillater at en diagnose kan foretas for målantigenet eller som tillater tilveiebringelse av eller er i seg selv et middel som er letalt overfor målantigenet eller det vev som det er assosiert med.

Ved en passende seleksjon av opphavsceller kan således et polydom oppnås som vil utskille et antistoff med en spesifisitet for et målantigen og en annen spesifisitet for en andel nyttig ved diagnose. Alternativt kan antistoff-halvmolekyler rekombineres under anvendelse av in vitro kjemiske midler eller individuelle intakte monospesifikke antistoffer kan kobles eller fornettes ved hjel? av kjemiske midler til å gi antistoff-multimerer (som kan være en dimer, trimer eller høyere multimer) med en dobbelt spesifisitet og med samme eller en lignende anvendelighet som det hybride monoklonale antistoff med den samme dobbelte spesifisitet i henhold til den foreliggende oppfinnelse.

Som anvendt heri inkluderer betegnelsen "antistoff" anti-stof fragmenter med immunokjemiske egenskaper som Fab eller F(ab)2 fragmenter.

Et formål for den foreliggende oppfinnelse er følgelig hybride monoklonale antistoffer som ikke er blitt denaturert ved fremstillingsprosessen. Anvendbare fremstillingsprosesser vil fremgå av det følgende sammen med eksempler på anvendelser av de hybride monoklonale antistoffer i henhold til oppfinnelsen.

Den måte hvorpå disse og andre formål kan oppnås vil fremgå ved betraktning av den etterfølgende beskrivelse av foretrukne utførelsesformer.

Som angitt i det foregående krever fremgangsmåten for fremstilling av et hybrid monoklonalt antistoff i henhold til oppfinnelsen som en opphavscelle et hybridom, og foretrukket et selektivt destruerbart hybridom, som utskiller et monoklonalt antistoff mot en forhåndsselektert antigenisk determinant eller epitop. Bruken av et selektivt destruerbart hybridom som opphavscelle har den fordel at den forhindrer at cellene som oppnås ved fusjon av det selektivt destruerbare hybridom med en B-lymfocytt eller et annet hybridom, dvs. polydomet, kan bli fortrengt av en populasjon av opphavshybridomet når cellene oppnådd ved fusjonsprossen dyrkes og til å tilveiebringe et middel hvormed polydomcellene kan isoleres fra opphavshybridomcellene.

Selektivt destruerbare hybridomer kan oppnås fra hybridomer som utskiller et antistoff med en av de ønskede spesifisiteter fremstilt ved den klassiske Kohler-Milstein prosess, dvs. hybridomer oppnådd ved fusjon av en myelomcelle og en B-lymfocytt som finnes i miltcellene i mus. Ved en utførelses-form underkastes et slikt hybridom for en tilbakeseleksjonsprosess for oppnåelse av et hybridom som er selektivt destruerbart.

Generelt kan selektiv destruerbarhet oppnås ved tilbakeseleksjon til et hybridom som mangler en genetisk komponent som er nødvendig for dets overleving i et valgt medium hvori polydomet fremstilt ved fusjonen kan dyrkes på grunn av et genetisk bidrag fra fusjonspartneren av det selektivt destruerbare hybridom, dvs. B-lymfocytten eller det annet hybridom.

Den hittil foretrukne tilbakeseleksjonsprosess innbefatter dyrking av et hybridom som utskiller et antistoff med en av de ønskede spesifisiteter for innlemmelse i det hybride antistoff i et dyrkingsmedium inneholdende 8-azaguanin. I et slikt medium er en hvilken som helst celle som innlemmer 8-azaguanin og derfor kan vokse i mediet, de celler som mangler enzymet hypoxantinguaninfosforibosyltransferase (HPRT). Kloner av celler som mangler dette enzym kan ikke vokse i medium inneholdende hypoxantinaminopterintymidin (HAT). De kan således selektivt ødelegges i dette medium.

En meget lignende prosess for tilbakeseleksjon innbefatter dyrking av hybridomene som utskiller det ønskede antistoff i et medium inneholdende 6-tioguanin, en annen analog av guanin som er giftig for cellene hvis den innlemmes i DNA. Også her mangler visse celler som vil vokse i dette medium HPRT-enzymet, og kloner av disse cellene vil nødvendigvis være sensitive overfor HAT-medium.

Ennå en prosess for tilbakeseleksjon som kan anvendes innbefatter dyrking av celler av den selekterte hybridom-cellelinje i et medium inneholdende hvilken som helst av tyminanalogene 5-bromuracyldecksyribose (BUdR) eller 2-aminopurin. Bare de celler som mangler enzymet tymidin-kinase (TK) kan vokse i et medium inneholdende hvilken som helst av disse to inhibitorer. Som i tilfellet av celler som mangler enzymet HPRT vil celler som mangler TK ikke vokse i HAT-medium.

En forskjellig fremgangsmåte for oppnåelse av et selektivt destruerbart opphavshybridom innbefatter irreversibel enzyminhibering under anvendelse av metaboliske inhibitorer. Blant disse foretrekkes de såkalte Kcat inhibitorer. Disse inhibitorer er analoger av et enzyms substrat som omdannes ved hjelp av målenzymet til et høyt reaktivt molekyl som reagerer med enzymet ved dets aktive sete og resulterer i irreversibel inhibering av enzymet. F.eks. vil behandling av det selekterte hybridom med en analog av glutamin som azaserin eller 5-diazo-5-oksa-L-norleucin (DON) irreversibelt inhibere enzymet formylglycinamidribonukleotidamido-transferase ved dannelse av en kovalent binding med en cysteinrest ved enzymets aktive sete. Denne inhibering vil til slutt resultere i celledød. Hybridomet kan imidlertid reddes ved fusjon med det annet av opphavet til polydomet som tilveiebringer det nødvendige enzym.

Ved en foretrukket utførelsesform fusjoneres det selektivt destruerbare hybridom med komplementære B-lymfocytter, typisk oppnådd som miltceller tatt fra en vert som på forhånd er blitt immunisert med et antigen, som kan være et hapten bundet til et bærerprotein, selektert til å få verten til å generere en immunreaksjon som frembringer antistoffer med den annen spesifisitet som ønskes i hybridantistoffet. Verten er vanligvis en mus, men species av kaniner, mennesker eller andre dyr kan også anvendes selv om interspeciesfunksjonen kan fremvise en lav grad av stabilitet. Fremgangsmåten for immunisering av en slik vert er selvfølgelig vel kjent og detaljer behøver ikke gis her.

Fusjon av det selektivt destruerbare hybridom med B-lymfocyttene til å gi polydomet kan gjennomføres ved å kombinere de to grupper av celler i et medium inneholdende et middel til å fremme cellefusjon som f.eks. polyetylenglykol eller Sendi-virus i henhold til kjente metoder.

Etter fusjon overføres cellene til et medium som f.eks. HAT-medium for dyrking. B-lymfocyttene vil overleve bare i en kort tid og opphavshybridomcellene kan ikke vokse i dette medium. Populasjonen av polydomer dannet som et resultat av fusjonen, kan imidlertid dyrkes i dette medium, på grunn av komplementas j onen av opphavshybridomet med f. eks. B-lymfocytten, ved hjelp av et genetisk bidrag av evnen til å danne et manglende enzym som HPRT eller TK eller ved et direkte bidrag av et enzym som er inhibert i opphavshybridomet. Kloner av individuelle polydomer dyrkes og de selekteres som utskiller antistoffer med den ønskede dobbelte spesifisitet. Kloner av polydomer med antistoffer som fremviser den ønskede dobbelte spesifisitet for seleksjon av dem som har den annen spesifisitet, dvs. den som oppnås fra B-lymfocyttene, og affinitet er høyst ønskelig.

Ved en ytterligere utførelsesform oppnås polydomet ved å fusjonere det selektivt destruerbare hybridom under anvendelse av et passende fusjonsmiddel med et annet hybridom som også er selektivt destruerbart. Det annet opphavshybridom oppnås på den samme måte som det første, dvs. ved en prosess med tilbakeseleksjon, irreversibel enzyminhibering eller ved hjelp av en hvilken som helst annen passende teknikk. I et slikt tilfelle må det annet hybridom være i stand til å komplementere.det første. Hvis f.eks. det første selektivt destruerbare hybridom mangler enzymet HPRT må det annet være i stand til å bidra til polydomet et gen som vil sette polydomet i stand til å uttrykke HPRT. Tilsvarende hvis det annet selektivt destruerbare hybridom- mangler enzymet TK

må det første bidra med et gen for TK til polydomet. Lignende komplementæritet mellom de to hybridomer må være tilstede hvis irreversibel inhibering av et enzym er blitt gjennomført for å meddele selektiv destruerbarhet til dem. Det er også mulighet å anvende som et av hybridomopphavene et hybridom som er blitt underkastet en tilbakeseleksjonsprosess, og som det annet et hybridom som er blitt underkastet en prosess med enzyminhibering.

Bruken av komplementære selektivt destruerbare hybridomer som opphav for polydomet har den fordel at begge opphav kan selekteres på basis av spesifisiteter og affiniteter i det monoklonale antistoff som de fremstiller, mens i tilfellet av fusjon av et enkelt hybridom med B-lymfocytter kan ingen prefusjon-seleksjon blant B-lymfocyttene foretas til å oppnå dem som produserer et antistoff med den ønskede spesifisitet og affinitet. Fusjon av de to selektivt destruerbare hybridomer kan gjen-nomføres under anvendelse av polyetylenglykol eller ved å anvende andre fusjonsmidler, også her ved hjelp av kjente metoder. Etter fusjon overføres cellene til et dyrkingsmedium hvori de to opphav kan vokse, men hvori de polydomer som resulterer fra fusjonen er i stand til vekst på grunn av de komplementære bidrag fra opphavene.

Det er hittil drøftet seleksjonsprosesser for oppnåelse av selektivt destruerbare hybridomer for bruk som begge hybridompartnere i en hybridom-hybridomfusjon til å danne et polydom. Nødvendigheten for at det annet av hybridomopphavene skal være selektivt destruerbart kan imidlertid unngås ved å meddele både en dominant og en recessiv markering til det første av hybridomopphavene. En hittil foretrukket metode er HAT-ouabain-seleksjon. Ouabain er en spesifikk inhibitor for den Na<+->K<+> aktiverte ATPase i plasmamembranen. Dette enzym er ansvarlig for innføring av K<+> i en celle og utføring av Na<+ >fra cellen.

Celler av et hybridom som på forhånd er tilbakeselektert for f.eks. å meddele selektiv destruerbarhet, HAT-sensitivitet, dyrkes i ouabain-medium for seleksjon av ouabain-resistente celler. Kloner av disse celler vil være HAT-sensitive, men ouabain-resistente. I motsetning hertil vil det hybridom som er selektert for fusjon med dette være ouabain-sensitivt, men kan overleve og vokse i HAT. Alternativt kan seleksjon for ouabain-resistens foretas først enten på opphavsmyelomlinjen eller hybridomet avledet derfra, etterfulgt av tilbake-seleks jon eller annen teknikk for å meddele selektiv destruerbarhet.

Celler oppnådd ved fusjon av de to hybridomer i polyetylenglykol eller annet fusjonsmiddel overføres til HAT-medium inneholdende ouabain i en konsentrasjon som er letal for det annet av hybridomopphavene. Det selektivt destruerbare av hybridomopphavene kan ikke overleve i HAT-medium som enten f.eks. mangler HPRT eller annet enzym, selv om det er ouabain-resistent. Polydomcellene kan imidlertid vokse i mediet da de vil ha enzymene og ouabain-resistens nødvendig for overleving. Den foregående metode har den fordel at det er mulig å oppnå et polydom ved direkte fusjon av et selektivt destruerbart av hybridomopphavene som utskiller et antistoff med en av de spesifisiteter som ønskes i hybridet med et annet "tilgjengelig" hybridom som utskiller et antistoff med den annen spesifisitet som ønskes i hybridet, og ingen bruk av teknikk for å meddele selektivt destruerbarhet til det annet av hybridomopphavene er da nødvendig.

Ennå en ytterligere metode for oppnåelse av et polydom som anvender en universal opphavstype, dvs. en som har både en positiv og en negativ markør, som kan fusjoneres med et hvilket som helst "tilgjengelig" hybridom, innbefatter bruk av rekombinante DNA vektorer som bærer forskjellige medisin-resistens-markører. F.eks. kan det anvendes SV40 som bærer et gen for neomycin-resistens.

En hittil foretrukket universal opphavstype er den som er HAT sensitiv-neomycin-resistent. Den valgte opphavstype tilbake-selekteres til HAT-sensitivitet og transfekteres så med SV40 vektor som bærer et gen for neomycin-resistens. Denne metode kan også reverseres idet transfeksjon gjennomføres først.

Det resulterende hybridom kan vokse i nærvær av neomycin, som normalt er giftig for mammale celler, men vil dø i nærvær av HAT. Tilgjengelige hybridomer vokser imidlertid i HAT, men dør i nærvær av neomycin.

Produkter fra fusjonen av opphavene overlever derfor i nærvær av HAT og neomycin. Mens bruken av vektorer for å meddele resistens til neomycin foretrekkes hittil kan vektorer som bærer gener som vil meddele resistens for mammale celler overfor andre medisiner også anvendes.

Selv om det hittil er foretrukket, er det ikke vesentlig for den foreliggende fremgangsmåte for oppnåelse av polydomer fra par av hybridomer at minst en av opphavscellelinjene er selektivt destruerbar. Det er innenfor rammen av denne teknikk å fusjonere et par hybridomer, hvorav ingen er selektivt destruerbare, men som utskiller et antistoff med en av de spesifisiteter som ønskes i det hybride antistoff, i nærvær av et passende fusjonsmiddel etterfulgt av subkloning av alle celler før populasjonen av ufusjonerte opphavshybridomer øker i en grad slik at seleksjon av subklonene for identifisering av polydomer ikke er praktisk. Subklonene blir deretter selektert for å fastslå hvilke sekret-antistoffer har en dobbelt spesifisitet.

Denne prosess er best egnet for oppnåelse av polydomer når fusjonsfrekvensen av opphavscellelinjene er høy. I alle fall, og spesielt når cellefusjonsfrekvensen er lav, kan cellene oppnådd fra fusjonen av hybridomer med monoklonale antistoffer overfor forskjellige antigener, selekteres under anvendelse av en cytofluorograf for identifisering av polydomene. For oppnåelse av dette blir prøver'av de to antigener merket med forskjellige fluorescerende deler hvis fluorescens synes ved forskjellige bølgelengder. F.eks. kan et antigen markeres med fluorescein og det annet antigen med rodamin. Populasjonen av celler fra fusjonen, som foretrukket er blitt dyrket over natten eller i en annen passende tidsperiode for å øke derés antall, inkuberes med de to merkede antigener. Cellene blir så selektert under anvendelse av cytofluorografen. De celler som fluorescerer ved bare en av de to bølgelengder vil være fra cellelinjene av opphavshybridomene: Celler som fremviser fluorescens ved begge bølgelengder vil imidlertid være polydomer som kan isoleres og subklones.

Ved ennå en ytterligere utførelsesform kan et polydom oppnås direkte ved å fjerne kjernen fra et første hybridom som utskiller et monoklonalt antistoff med en av de spesifisiteter som ønskes i hybridet og innføring av denne i cytoplasmaet av et annet hybridom som utskillet et monoklonalt antistoff med den annen ønskede spesifisitet. Selvfølgelig behøver ingen av opphavshybridomene å være selektivt destruerbare for å kunne anvendes ved denne prosess. Etter innføring av kjernematrialet klones cellen til å oppnå en populasjon av polydomet.

Det er funnet at til forskjell fra opphavshybridomene eller B-lymfocyttene som utskiller et enkelt antistoff, utskiller polydomceller oppnådd ved de ovennevnte metoder en blanding av antistoffer, hvorav minst ett er et hybrid antistoff med en dobbelt spesifisitet. Av polydomene fremstilles også forholdsvis mindre mengder av antistoffer med samme spesifisitet som de som fremstilles av opphavscellene anvendt for oppnåelse av polydomet. Forholdet mellom hybride og monospesifikke antistoffer synes å være omtrent 2:1:1 som er det forhold som forventes hvis polydomet produserer like mengder av alle de mulige (H) kjeder sem syntetiseres av opphavscellene som er tilfeldig kombinert i selve polydomet.

Polydomene kan dyrkes in vitro eller vokse in vivo i hvilke som helst genetisk forlikelige dyr eller hårløse mus til å gi større mengder av det hybride antistoff som utvinnes fra dyrkningsmediet eller ascitin-fluidet av dyret under anvendelse av kjente prosesser. Se f.eks. protokollene i "Monoclonal Antibodies", utgitt av Kennett et al., Plenum Press, New York (1980) sidene 336-418.

Blandingen av antistoffer fremstilt av polydomet kan separeres til å gi hybridet. F.eks. tillater sekvensmessig affinitetskromatografering mot først det ene og deretter det annet antigen som hybridet er spesifikt overfor, dets separering fra de monospesifikke antistoff-forurensninger. Det er også funnet at enkel ionebyttingskromatografering og elektroforetiske metoder også kan anvendes i det minste under visse forhold. Om nødvendig kan ladningsforskjellen for ionebytting være en av egenskapene for antistoffet som tas i betraktning ved selektering av opphavslinjene.

Eksempel 1

Et hybrid monoklonalt antistoff i samsvar med oppfinnelsen med dobbelt spesifisitet for hepatitt B overflateantigen (HBsAg) og prostatasur fosfatase (PAP) ble fremstilt på følgende måte: Et hybridom som utskiller et monoklonalt antistoff til PAP ble dyrket i HAT-medium i 1 uke og deretter overført til og dyrket i et ikke-selektivt medium. Etter forskjellige lengder av voksetid under ikke-selektive betingelser ble 2 ml porsjoner av celler anbragt i medium inneholdende 10~<4> M 8-azaguanin som forhindrer cellene fra å vokse ved å innlemme 8-azaguanin i deres DNA i stedet for guanin. Cellene som mangler HPRT-enzymet overlevde og vokste i dette medium og disse celler overlevde ikke nødvendigvis i HAT.

Kloner som vokste i mediet inneholdende 8-azaguanin ble testet for sensitivitet til HAT og anti-PAP produksjon. Et klon som fremdeles fremstilte anti-PAP og fremviste HAT-sensitivitet med en reversjonsfrekvens på mindre enn 4 x 10-^ ble subklonet. Alle subklonene oppførte seg lik opphavsklonet.

Celler fra en av de HAT-sensitive subkloner ble fusjonert i polyetylenglykol med miltceller oppnådd fra Balb/c mus hyperimmunisert med HBsAg til å gi polydomer under anvendelse av fusjonsteknikken til Gerhard. Se "Monoclonal Antibodies", supra, side 370. Fusjonen frembragte 220 polydomer som ble selektert for å bestemme hvilke som utskilte antistoffer med spesifisitet for både PAP og HBsAg. Kloner av to slike polydomer ble funnet å fremstille antistoff og kunne utvinnes fra ascites og fremviste begge spesifisiteter.

Subkloner av begge polydomer fortsatte å produsere ascites som fremviste begge spesifisiteter og ga trippelbånd på Orstein-Davis PAGE lik de tilsvarende for opphavsklonet. Ascitene fra begge kloner ble funnet å binde <125>I-HBsAg og 12 5I_PAp ved radioimmunoanalyse og ga Ka-verdier på omtrent 10^ for hver og antydet således dannelse av antistoffer med to spesifisiteter.

Data i tabell I i det følgende viser resultatene oppnådd ved immunoanalyse under anvendelse av ascites oppnådd fra et klon av en av polydomene sammenlignet med ascites oppnådd fra hybridomer som utskiller monoklonale antistoffer, henholdsvis mot IgE (anvendt som en kontroll), PAP og HBsAg under anvendelse av immobilisert HBsAg som en fast fase og en rekke radiomerkede antigener som oppløsningsfase.

En 200 mikroliter prøve av ascites fra polydomet og hver av de tre hybridomer ble hver inkubert over natten med 12 polystyrenkuler som HBsAg var bundet til. HBsAg kulene ble oppnådd fra Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois. Etter vasking ble triplikatprøver inkubert i 4 timer med 100,000 cm av det indikerte <l25>i merkede antigen. Etter en annen vasking ble kulene tellet for å bestemme mengden av merket antigen bundet til kulene. Ved et sett av tester under anvendelse av radiomerket PAP som oppløsningsfase-antigen ble anti-PAP tilsatt til antigenet før det ble inkubert med kulen. Antistoffet til PAP anvendt for dette formål er det monoklonale antistoff som fremstilles av opphavshybridomet anvendt for å fremstille polydomet og er derfor mot den samme PAP epitop som den som forventes å utvises av det hybride antistoff.

Data i tabell I indikerer at bare den stråling som forventes fra ikke-spesifikk binding måles for anti-PAP ascites ved sammenligning med strålingen for IgE kontrollen.

Ascitene inneholdende HBsAg antistoffet, på den annen side, bandt det merkede HBsAg antigen som forventet, men fremviste ikke-spesifikk binding når de andre merkede antigener ble testet. Ascitene fra polydom-klonec bandt imidlertid både merket HBsAg og merket PAP, idet førstnevnte skyldes nærværet av noe ikke-hybrid, monospesifikt antistoff til KBsAg i ascitene og sistnevnte kan tilskrives et hybrid som kan binde og brodanne HBsAg på kulen og det spormerkede PAP i opp-løsning. Forsøket under anvendelse av en blanding av merket PAP og anti-PAP fra opphavshybridomet bekrefter at anti-PAP spesifisiteten av hybridet er for den samme epitop som det antistoff som utskilles opphavshybridomet, da bare bakgrunns-stråling iakttas ved inhibering av binding av merket PAP til det hybride antistoff på grunn av opphavsantistoffet.

Analyse av ascitene fra polydomklonet anvendt ved den sammen-lignende radiobedømmelse ble gjennomført under anvendelse av polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) og immunoelektroforese (IEP) . Begge indikerte nærvær av minst tre antistoffspecies.

DEAE ionebyttingskromatografi i preparativ målestokk ga tre velseparerte topper hvorav den midtre hadde en skulder. Hver av de tre topper var homogene ved analyse med PAGE og IEP og hver tilsvarte et av båndene i den opprinnelige ascites.

Material som representerer hver av DEAE toppene ble testet for antigen-binding under .anvendelse av radiomerket HBsAg og PAP. Den første topp bandt HBsAg, men ikke PAP. Den midtre topp og dens skulder bandt til både HBsAg og PAP og den siste topp bandt bare PAP. Den midtre topp er således et hybrid-antistoff med en dobbelt spesifisitet til HBsAg cg PAP bestående av minst to subspecies.

Det hybride antistoff oppnådd som den midtre topp ved DE AS kromatografering ble radiomerket med <125>j> Etter merking ville 85 % av det merkede antistoff binde til PAP og 88 ville binde til HEsAg. Affiniteten av hybridet for PAP ble funnet å være noe mindre enn for det monoklonale antistoff til PAP produsert av opphavslinjen. Denne forskjell i affinitet var omtrent den samme som iakttatt mellom et monoklonalt antistoff og dets Fab fragment.

DEAE kromatografering indikerer at hybrid antistoff omfatter mer enn 50 % av antistoffene produsert av polydomet og utgjør omtrent forholdet 2:1:1 forutsagt på statistisk basis hvis polydomet skulle syntetisere alle de mulige tunge antistoff-kjeder, dvs. de som fremviser enten PAP eller HBsAg spesifisitet, som er kombinert inne i cellen på et tilfeldig grunnlag til å danne hybrid-antistoff blandet med mindre mengder av ce to monospesifikke antistoffer med den samme spesifisitet som de som frembringes av opphavscellene. Eksistensen av subspecies av hybrid antistoff antyder at de kan være forskjellige med hensyn til deres lette kjedesamnen-setning.

Eksempel 2

Hybride monoklonale antistoffer i samsvar med oppfinnelsen med dobbelt spesifisitet for human IgD og prolactin ble fremstilt ved fusjonen av to hybridomer, hvorav en var bygget opp til å inneholde to selekterbare genetiske markører: sensitivitet til HAT-medium og resistens til ouabain. Dette dobbelt markerte hybridom eller såkalte "universale opphavshybridom" kunne så fusjoneres til et hvilket som helst annet hybridom. De resulterende polydomer vokser i nærvær av HAT og ouabain, mens eventuelle ufusjonerte opphavsceller.dør. Fordelene med å anvende "universale opphav" er beskrevet andre steder heri.

For oppbygging av slike universalopphav ble begge selekterbare markører innført under den initiale oppbygning av hybridomet. For å oppnå denne opphavslinje ble det lett tilgjengelige HAT-sensitive musemyelom p3.653 selektert for en annen genetisk markør, ouabainresistens, ved innføring av 1 mM ouabain i dyrkingsmediet. Mens de fleste celler døde hadde omtrent 1/100,000 celler ved tilfeldig mutasjon oppnådd resistens overfor den nevnte substans og overlevde således og formerte seg til å danne den nye myelompopulasjon som var HAT-sensitiv og ouabainresistent.

Dette HAT-sensitive ouabainresistente myelom ble så fusjonert med miltceller oppnådd fra Balb/c mus hyperimmunisert med IgD under anvendelse av den tidligere angitte teknikk til Gerhard. Hybrider ble selektert i HAT-medium (uten ouabain) og kloner ble selektert for produksjon av monoklonalt antistoff rettet mot IgD. Fra de positive kloner ble den som produserte et IgG mot IgD selektert for videre studium. Dette klon ble testet for rentensjon av trekket med ouabain-resistens ved å tilsette 1 mM ouabain til dyrkningsmediet. Omtrent 1/3 av cellene bibeholdt denne genetiske markør. Når kulturen ble dyrket eksponentielt i ouabain ble cellene subklonet. Ouabainresistente subkloner ble testet for fortsatt produksjon av det monoklonale anti IgD antistoff. Et av subklonene ble videre tilbakeselektert ved metoden i eksempel 1 til å gi en populasjon av celler sensitive til HAT. Dette subklon ble dyrket i 2 uker under ikke-selektive betingelser og deretter anbragt i medium inneholdende 6-tioguanin. Som tidligere bemerket er virkningsmekanismen for 6-tioguanin lignende virkningen av 8-azaguanin. Celler som innlemmer 6-tioguanin i sitt DNA i stedet for guanin, vil ikke vokse. Celler som mangler HPRT-enzym vil ikke utnytte 6-tioguanin fra mediet og kan derfor vokse, men-er følgelig sensitive overfor HAT. Denne populasjon av det tilbake-selekterte subklon ble så selv subklonet i 6-tioguanin og ouabainholdig medium. Subkloner ble bedømt for fortsatt produksjon av det monoklonale anti-IgD antistoff. Et klon som viste alle de ønskede egenskaper - vekst i ouabain og 6-tioguanin såvel som fremstilling av monoklonalt anti-IgD, ble selektert som såkalt "universalopphav". Disse universalopphav kunne så fusjoneres til et hvilket som helst annet HAT-resistent ouabainsensitivt hybdidom til å danne et polydom som ville uttrykke et hybridantistoff og en spesifisitet av dette ville være anti-IgD. For dette formål ble det initialt selektert et musehybridom som utskiller et monoklonalt antistoff rettet mot prolactin. Det anti-prolactinmonoklonale antistoff er av den samme underklasse (IgGi) som det anti-IgD som opphavslinjen uttrykker og det separeres lett fra antistoffet på Ornstein-Davis geler. En slik separering indikerer meget forskjellig ladning på antistoffene og skulle således tillate lett isolering av et hybridantistoff ved hjelp av DEAE-Sephadex-kromatografering.

IO<7> celler av den HAT-sensitive, ouabainresistente cellelinje ble fusjonert i polyetylenglykol med IO<7> celler som fremstiller antiprolactin. De fusjonerte celler ble først dyrket i 3 døgn og til slutt anbragt på nytt i HAT-medium. Mer enn 600 kloner oppsto fra denne fusjon: 66 kloner ble tilfeldig selektert for analyse. Av disse kloner fremviste 3 6 både anti-IgD og antiprolactin aktivitet.

Disse klonsupernatanter ble bedømt med hensyn til nærvær av hybridantistoff ved hjelp av følgende bedømmelse. En polystyrenkule belagt med et annet antiprolactin monoklonalt antistoff ble inkubert i 5 timer med 200 mikroliter av en 100 ng/ml prolactinoppløsning. Det anvendte antistoff binder prolactin ved et distinkt sete i forhold til tilsvarende for det antistoff som frembringes av den fusjonerte hybridor.-cellelinje. Kulen ble vasket og deretter inkubert over natten med klonsupernatantene. Den neste dag etter flere vaskinger ble <!25>i merket IgD tilsatt. Hybridantistoff bundet til kulen med en funksjonell binding kunne binde det radiomerkede IgD med den fri anti-IgD funksjonalitet mens hverken opphavstype antistoff IgD-IgD eller prolactin-prolactin kunne danne denne bro mellom prolactinkulen og <125>i IgD sporstoff. Resultater av en typisk bedømmelse for kloner som frembringer hybrid bifunksjonelt antistoff er gjengitt i den etterfølgende tabell 2. 21 av 36 kloner fremviste vesentlig bifunksjonell aktivitet ved denne bedømmelse. Ascites utviklet fra 2 hittil til-gjengeligé kloner er blitt vist å reagerer i den bifunksjonelle bedømmelse. Disse ascites inneholder antistoffer som separerer de tre distinkte bånd på Orstein-Davis geler: To bånd faller nøyaktig sammen med antistoffer produsert av opphavshybridomer (Anti-IgD og antiprolactin). Det tredje bånd vandrer midtveis mellom de opphavsmonoklonale antistoff-bånd som forventet for det hybride antistoff.

At et hybrid monoklonalt antistoff mot IgD og prolactin fremviser en doserespons når mengden av prolactin varieres ved analysen anvendt for å utvikle dataene i tabell 2, er vist ved dataene i tabell 3 under anvendelse av antistoffet i klonat nr. 2 og, som kontroller, antistoffer fra opphavs-cellelinjen (anti-IgD og antiprolactin).

Disse data viser at mengden av prolactin bundet av det hybride antistoff er doseresponsivt ved at mengden av merket IgD som bindes økes når dosen av prolactin økes. I motsetning hertil iakttas ingen doserespons under anvendelse av opphavsantistoffene mot IgD og prolactin da de ikke kan danne broen mellom prolactin bundet til kulen og det merkede IgD. Det hybride antistoff kan således anvendes som en komponent ved en bedømmelse av prolactin. Skreddersying av andre hybride antistoffer frembyr lignende muligheter for andre bedømmelser.

Eksempel 3

Ved en liknende teknikk som eksempel 2 ble et universalt opphavshybridom utviklet som utskiller monoklonalt antistoff rettet mot haptenarsenat-arsenat-dimeren og som er både resistent mot ouabain og sensitivt til HAT. Dette hybridom ble fusjonert til et hybridom som utskiller et monoklonalt antistoff med spesifisitet for carcinoembryonisk antigen (CEA), et antigen som uttrykkes både av embryoniske vev og flere typer av carcinom. Også her resulterte mer enn 600 kloner fra fusjonen. Av 7 2 kloner testet for evnen til å binde både CEA og arsenat hadde 69 begge bindingsaktiviteter. De kloner som fremviste den største binding ble selektert for enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) av hybrid antistoff. For hver analyse fikk CEA oppløsning (600 ng eller 250 ng) absorbere over natten i hver brønn i en mikrotiter plastplate med 96 brønner. Den neste dag ble uabsorbert material vasket ut av brønnene med PBS-Tween 20. Klonsupernatanter ble tilsatt og inkubert i 2 1/2 timer ved 35°C og deretter vasket bort av platen. CEA-CEA og CEA-arsenat antistoff ville forbli festet til platen via det absorberte antigen. Det annet antigen, arsenylsyre koblet til enzymet alkalisk fosfatase,- ble tilsatt brønnene i 3 timer ved 35°C. Etter en ytterligere vasking med PSB-Tween ble kromagen-substrat for alkalisk fosfatase, paranitrofenylfosfat, tilsatt til brønnene og farge utviklet i 48 timer. Adsorbsjon i hver brønn ble målt ved 410 nm. Ved tilstedeværelse i en klonsupernatant bandt det hybride antistoff det adsorberte CEA på platen ved en funksjonalitet og etterlot den annen fri til å binde arsenylsyre koblet til alkalisk fosfatase. Farge fra kromagensubstratet utviklet seg bare hvor det alkaliske fosfatase koblet til arsenylsyren hadde blitt bundet. Ved denne analyse fremviste 3 av 12 supernatanter hybrid antistoffaktivitet som indikert i tabell 4.

Den foreliggende oppfinnelse muliggjør også immunodiagnose

. under anvendelse av antistoffer med en dobbelt spesifisitet, f.eks. hybride antistoffer oppnådd som beskrevet ovenfor og

fra antistoff-halvmolekyler ved hjelp av den konvensjonelle teknikk til Nisonoff et al., supra, eller antistoff-multimerer oppnådd ved kobling eller fornetning av individuelle monospesifikke antistoffer. Foretrukket er det antistoff med dobbelt spesifisitet som anvendes i disse metoder et hybrid antistoff fremstilt på sikker måte og oppnådd som en hovedsakelig ren forbindelse som ikke har være utsatt for denaturering og som har en ensartet spesifisitet og affinitet for antigenet.

I tilfellet av immunodiagnostiske anvendelser vil en av de to spesifisiteter som utvises av hybridet eller annet antistoff med dobbelt spesifisitet vært mot det målantigen hvis påvisning er ønsket og den annen vil være mot et annet antigen, som kan være et hapten eller andre molekylære species, som tillater diagnosen. F.eks. vil et antistoff nyttig ved immunohistologi ha en første spesifisitet for et antatt antigen, f.eks. et tumor assosiert antigen som CEA, PAP eller ferritin, og en annen spesifisitet mot et hapten eller antigen som vil delta i en fargereaksjon som f.eks. et enzym som bevirker en fargereaksjon i nærvær av et passende substrat. Blant passende enzymer hvortil den annen spesifisitet av antistoffet kan rettes er prostatasur fosfatase (PAP) pepperrot-peroksydase, glukoseoksydase og alkalisk fosfatase.

For gjennomføring av den histologiske undersøkelse behandles først en vevseksjon med antistoffet med dobbelt spesifisitet. Før dette gjøres kan hybridet allerede ha fått binde seg til det enzym som katalyserer fargereaksjonen. Hvis ikke blir deretter seksjonen behandlet med en annen oppløsning inneholdende enzymet og renset etter en passende inkubasjon og deretter behandlet med substratet som undergår en fargeendring i nærvær av enzymet. Dannelsen av den farge som frembringes av enzymet og substratet i vevsprøven er en positiv indikasjon på nærvær i vevet av målantigenet. Det hybride antistoff mot HBsAg og PAP hvis fremstilling er beskrevet heri, er funnet å binde til HBsAg på et test-substrat (polystyrenkuler) og til PAP i et simulert farge-eksperiment under anvendelse av p-nitrofenylfosfat som enzymsubstrat. Etter inkubasjon av det hybride antistoff med PAP og HBsAg resulterte tilsetningen av p-nitrofenylfosfatet i at kulene undergikk den karakteristiske fargeendring fra gult til brunt.

Som bemerket i eksempel 2 kan også et antistoff med dobbelt spesifisitet anvendes ved immunoanalyser og immunometriske analyser. Under anvendelse av det hybride antistoff mot HBsAg og PAP hvis fremstilling er beskrevet i foregående, kan en immunometrisk analyse for HBsAg gjennomføres under anvendelse av et immobilisert monoklonalt antistoff for HBsAg i en fast fase til å ekstrahere HBsAg fra et serum eller en annen flytende prøve som muligens inneholder antigenet. Prøven inkuberes med en kule, korn, testrør eller annet substrat som har anti-HBsAg bundet eller belagt på over-flaten. Inkubasjonen med serumprøven kan etterfølges av, foretas samtidig eller foretas etter en inkubasjon med en oppløsning av hybridet. I alle fall, hvis HBsAg er tilstede i prøven, vil resultatet være dannelse av en sandwich av det immobiliserte antistoff, HBsAg, hvis dette er til stede i prøven og det hybride antistoff. Som del av bedømmelsen tillates PAP å binde til det hybride antistoff. Dette kan gjøres under eller etter dannelse av sandwichen, eller alternativt kan antistoff-PAP-komplekset forhåndsdannes. Etter dannelse av sandwichen vaskes den faste fase for å fjerne prøverester og ubundet hybrid antistoff og bringes deretter i kontakt med en oppløsning inneholdende et substrat som f.eks. p-nitrofenylfosfat eller a-naftolfosfat som undergår en fargeendring i nærvær av PAP. Forekomst av en fargeendring bekrefter nærværet av målantigen i prøven.

Ved en slik bedømmelse under anvendelse av det polyklonale anti-HBsAg-korn i et kommersielt sett for diagnose av HBsAg fremstilt av Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois (markedsført under betegnelsen "Aushia"), ble prøver inneholdende forskjellige mengder HBsAg inkubert med kornene. De anvendte prøver var positive og negative kontroller fra det kommersielle sett og to prøver oppnådd ved fortynning av den positive kontroll med den negative kontroll i forholdene på enten en del negativ kontroll:2 deler positiv kontroll eller 2 deler negativ kontroll:1 del positiv kontroll.

Etter inkubasjon av prøvene med kornet til å binde HBsAg ble kornet vaske.t og inkubert med det hybride antistoff reaktivt til både HBsAg og PAP. Dette muliggjorde dannelse av en sandwich av immobiliserte antistoffer: antigen: og hybrid antistoff. Kornet ble på nytt vasket og inkubert med en oppløsning av PAP. Denne inkubasjon ble fulgt av en ytterligere vasking og kornet inkubert med et substrat a-naftolfosfat. PAP fjerner enzymatisk fosfat. Etter en passende inkubasjon ble substratet fjernet fra kornet og tilsatt en indikator Fast Garnet GBC salt som endres fra fargeløst til rødaktig purpur i nærvær av produktet fra den enzymatiske reaksjon. En fargeendring ble iakttatt til å bekrefte nærvær av HBsAg i prøvene. Absorpsjon ved 57 0 nm ble målt for prøvene og disse data er vist i den etterfølgende tabell 5.

Disse data viser en doserespons med variasjon i HBsAg konsentrasjon som kunne forventes hvis det hybride antistoff danner en bro mellom HBsAg bundet til kulen og PAP. Dette viser ytterligere nytten av et hybrid antistoff ved en immunoanalyse.

Andre påvisningsmidler enn enzymatisk katalyserte reaksjoner er også mulig. F.eks. kan den annen spesifisitet av hybridet eller et annet antistoff med en dobbelt spesifisitet rettes mot et hapten eller antigen som er radiomerket eller som er fluorescent eller som kan påvises i sandwichen ved hjelp av hvilke som helst passende midler.

En foretrukket prosess som anvender et hybrid antistoff eller et annet antistoff med en dobbelt spesifisitet ved en immunoanalyse utnytter fenomenet med fluorescens-utslukning. Ved en slik bedømmelse rettes en spesifisitet av antistoffet mot et målantigen og den annen mot f.eks. et hapten som bærer en fluorescerende kromofor. Kromoforen er enten bundet til

haptenet eller kan i passende tilfeller være selve haptenet.

Analysen gjennomføres ved inkubering av antistoffet med serum eller en annen prøve som kan inneholde målantigenet hvortil . er tilsatt en forut bestemt mengde av målantigen merket med en utslukningskromofor. Den merkede antigen konkurrerer med eventuelt målantigen i prøven for antistoffets bindested som er spesifikt for målantigenet. Før, under eller etter denne inkubasjon inkuberes en mengde av haptenet som bærer den fluorescerende kromofor med antistoffet og binder ved det annet bindingssted.

De to kromoforer selekteres slik at det første cv dem fluorescerer ved en bølgelengde som kan absorberes (ut-slukkes) av den annen hvis de anbringes tilstrekkelig nær hverandre slik at det foton som emitteres av der. fluorescerende kromofor kan oppfanges av utslukkeren. For å gjøre dette bør de to kromoforer ligge innenfor omtrent 100 Angstrøm fra hverandre og foretrukket innenfor cmtrent 50 Ångstrøm fra hverandre. Denne posisjonering vil forekomme når den fluorescerende kromofor bindes ved ett antistoff-bindingssete og den utslukkende kromofor bindes til det tilsatte antigen ved det annet. Et passende par av kromoforer inkluderer fluorescein som fluorescerende kromofor og rodamin som den utslukkende kromofor.

Den målte fluorescens vil variere inverst med mengden av nativt antigen i prøven siden, i fravær av nativt antigen, alt antigen bundet til antistoffet vil være merket med den utslukkende kromofor og være i stilling til å absorbere fluorescens ved kromoforen som bæres av haptenet. Sammenligning av den målte fluorescens med fluorescensen av en kontrollprøve inneholdende en kjent mengde av antigen tillater en kvalitativ og kvantitativ bestemmelse av nærværet av antigen i prøven.

Denne type immunoanalyse kan f.eks. anvendes for å bestemme innholdet i serum av medisiner som dilantin som må nøye overvåkes. Ved en slik bedømmelse bør målantigenet selv-følgelig være dilantin. Det vil være klart for den fagkyndige på området at denne prosess kan anvendes for å påvise andre antigener og spesielt inklusive tumorassosierte antigener.

En annen foretrukket prosess som anvender et hybrid antistoff eller et annet antistoff med en dobbelt spesifisitet ved en immunobedømmelse anvender en enzymatisk reaksjon. Ved en hittil foretrukket prosess rettes en av antistoff-spesifisitetene selvfølgelig til målantigenet og den annen til et enzym eller et hapten hvortil et enzym er bundet.

Bedømmelsen gjennomføres ved å inkubere antistoffet med en prøve som kan inneholde målantigenet hvortil er blitt tilsatt en forut bestemt mengde av målantigenet som er modifisert ved binding til en substans som innvirker med enzymet til å frembringe enten en påvisbar substans eller på en annen måte tillate påvisning av dannelse av antigen-antistoff-komplekset. Påvisningen kan f.eks. skje ved fluorimetri, luminescens, spektrofotometri e.l.

Ved en alternativ prosess kan det tilsatte målantigen være bundet til enzymet og i dette tilfelle har antistoffet en av sine spesifisiteter rettet mot den substans som innvirker med enzymet eller mot et hapten hvortil substansen er bundet. Den substans som innvirker med enzymet kan i seg selv være et annet enzym. I et slikt tilfelle katalyserer et av enzymene produksjon av et produkt som kreves av det annet. Når således antistoffet binder både det tilsatte målantigen, hvortil et av enzymene er bundet, og det annet enzym, dannes produktet fra den første enzymatiske reaksjon i nærheten av det annet enzym før vesentlig diffusjon av produktet i det omgivende medium kan foregå.

Et eksempel på en slik prosess utnytter de to enzymer heksokinase (HK) og glukose-6-fosfat-dehydrogenase (G-6-PDH) i det følgende reaksjonsskjema.

For utnyttelse av dette reaksjonsskjema vil det tilsatte målantigen ha enten HK eller G-6-PDH bundet til seg og det hybride antistoff vil ha en av sine spesifisiteter rettet mot det annet (eller et hapten som bærer det). Prøven er i tillegg til det hybride antistoff og den forut bestemte mengde av enzymmerket antigen, tilsatt glukose, ATP og koenzymet NAD<+>. Det hybride antistoff har foretrukket det annet enzym allerede bundet til seg. Alternativt kan dette enzym tilsettes til prøven sammen med de andre reagenser. Under inkubasjonen vil det enzymmerkede antigen konkurrere med eventuelt nativt antigen i prøven om et av bindingssetene i det hybride antistoff. Det annet enzym er eller vil bli bundet til annet bindingssete. Dette tillater dannelse av glukose-6-fosfat katalysert av HK til å foregå i tett nærhet til G-6-PDH. Det sistnevnte omdanner glukose-6-fosfat til glukonolakton-6-fosfat, et resultat som følges av reduksjon av NAD<+> til NADH. NADH absorberer sterkt ved 340 nm og kan derfor påvises spektrofotometrisk. Mengden av dannet NADH varierer inverst med mengden av nativt antigen i prøven, dvs. dets maksimale produksjon forekommer når der ikke er noe målantigen i prøven som bedømmes. Sammenligning av mengden av NADH dannet med en kontrollprøve tillater en kvalitativ og kvantitavtiv bestemmelse i nærværet av antigen i prøven.

Denne type bestemmelse kan anvendes for å overvåke mengden av dilantin eller andre medisiner i serum. I et slikt tilfelle er medisinen målantigenet. En slik bestemmelse kan imidlertid også anvendes for å påvise andre serumantigener som f.eks. dem som er assosiert med tumorer eller andre sykdommer.

Claims (8)

1. Et hybrid monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro, idet antistoffet har dobbelt spesifisitet og er fremstilt fra et polydom, karakterisert ved at nevnte hybride antistoff er fremstilt ved fusjon av to hybridomer, eller et hybridom og en miltcelle (B-lymfocytt), eller fremstilt ved å fjerne kjernen fra et første hybridom og innføre den i cytoplasmaet av et annet hybridom, idet antistoffet er en komponent av en blanding av antistoffer omfattende det hybride antistoff og species av mono-spesifikke antistoffer i et forhold på omtrent 2:1:1.

2. Hybrid monoklonalt antistoff som angitt i krav 1, karakterisert ved at den ene av de doble spesifisiteter er mot et målantigen og den andre mot en substans som tillater diagnose av målantigenet.

3. Hybrid monoklonalt antistoff som angitt i krav 2, karakterisert ved at substansen som tillater diagnose er merket med et radionuklid, en fluorescerende substans eller et enzym.

4. Hybrid monoklonalt antistoff som angitt i krav 1, karakterisert ved at en av de doble spesifisiteter av antistoffet er mot et målantigen og den andre mot et hapten som er, eller er tilbundet, et middel som er letalt til antigenet eller assosiert vev.

5. Hybrid monoklonalt antistoff som angitt i krav 4, karakterisert ved at det letale middel er et radionuklid eller et vevtoksin.

6. Hybrid monoklonalt antistoff som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte hybride antistoff er spesifikt for hepatitt B overflateantigen, karsinoembryonisk antigen, prostatasur fasfatase eller ferritin.

7. Hybrid monoklonalt antistoff som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte hybride antistoff har en spesifisitet for et tumorassosiert antigen og den andre spesifisitet for gelonin, a-amanitin,k difteri toksin A, metotrexat, diklormetotrexat, duanomycin eller kloronbucil.

8. Anvendelse av det monoklonale antistoff som angitt i krav 1-7 til immunokjemiske analyser.