NO171643B - ANTIBODIES WITH DOUBLE SPECIFICATIONS, THEIR PREPARATION AND USE - Google Patents
ANTIBODIES WITH DOUBLE SPECIFICATIONS, THEIR PREPARATION AND USE Download PDFInfo
- Publication number
- NO171643B NO171643B NO83834536A NO834536A NO171643B NO 171643 B NO171643 B NO 171643B NO 83834536 A NO83834536 A NO 83834536A NO 834536 A NO834536 A NO 834536A NO 171643 B NO171643 B NO 171643B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- antibody
- hybrid
- hybridoma
- antigen
- antibodies
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 102
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 80
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 80
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 80
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 41
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 41
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 claims description 35
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 claims description 35
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 32
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 21
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 18
- 102100037409 Sushi, von Willebrand factor type A, EGF and pentraxin domain-containing protein 1 Human genes 0.000 claims description 16
- 101710116672 Sushi, von Willebrand factor type A, EGF and pentraxin domain-containing protein 1 Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 claims description 7
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 claims description 3
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 claims description 3
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 claims description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 2
- 101800002638 Alpha-amanitin Proteins 0.000 claims 1
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 claims 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims 1
- 108700004714 Gelonium multiflorum GEL Proteins 0.000 claims 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims 1
- RXGJTYFDKOHJHK-UHFFFAOYSA-N S-deoxo-amaninamide Natural products CCC(C)C1NC(=O)CNC(=O)C2Cc3c(SCC(NC(=O)CNC1=O)C(=O)NC(CC(=O)N)C(=O)N4CC(O)CC4C(=O)NC(C(C)C(O)CO)C(=O)N2)[nH]c5ccccc35 RXGJTYFDKOHJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000004007 alpha amanitin Substances 0.000 claims 1
- CIORWBWIBBPXCG-SXZCQOKQSA-N alpha-amanitin Chemical compound O=C1N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N2C[C@H](O)C[C@H]2C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)[C@@H](O)CO)C(=O)N[C@@H](C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@H]1C[S@@](=O)C1=C2C2=CC=C(O)C=C2N1 CIORWBWIBBPXCG-SXZCQOKQSA-N 0.000 claims 1
- CIORWBWIBBPXCG-UHFFFAOYSA-N alpha-amanitin Natural products O=C1NC(CC(N)=O)C(=O)N2CC(O)CC2C(=O)NC(C(C)C(O)CO)C(=O)NC(C2)C(=O)NCC(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NCC(=O)NC1CS(=O)C1=C2C2=CC=C(O)C=C2N1 CIORWBWIBBPXCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims 1
- 229960005502 α-amanitin Drugs 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 description 50
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 40
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 229960003343 ouabain Drugs 0.000 description 26
- LPMXVESGRSUGHW-UHFFFAOYSA-N Acolongiflorosid K Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1CC2(O)CCC3C4(O)CCC(C=5COC(=O)C=5)C4(C)CC(O)C3C2(CO)C(O)C1 LPMXVESGRSUGHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- LPMXVESGRSUGHW-GHYGWZAOSA-N Ouabain Natural products O([C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O1)[C@H]1C[C@@H](O)[C@@]2(CO)[C@@](O)(C1)CC[C@H]1[C@]3(O)[C@@](C)([C@H](C4=CC(=O)OC4)CC3)C[C@@H](O)[C@H]21 LPMXVESGRSUGHW-GHYGWZAOSA-N 0.000 description 25
- 244000166550 Strophanthus gratus Species 0.000 description 25
- LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N ouabain Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C[C@@]2(O)CC[C@H]3[C@@]4(O)CC[C@H](C=5COC(=O)C=5)[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@@H]3[C@@]2(CO)[C@H](O)C1 LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N 0.000 description 25
- 230000008569 process Effects 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 19
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 16
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 13
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 12
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 10
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 7
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 6
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 6
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 6
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 6
- 230000001263 anti-prolactin effect Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 5
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 4
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 4
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 4
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 4
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N Phenytoin Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 229940064790 dilantin Drugs 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- YNXICDMQCQPQEW-UHFFFAOYSA-N 1-naphthyl dihydrogen phosphate Chemical compound C1=CC=C2C(OP(O)(=O)O)=CC=CC2=C1 YNXICDMQCQPQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 229940000489 arsenate Drugs 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N (e)-1-[(2s)-2-amino-2-carboxyethoxy]-2-diazonioethenolate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CO\C([O-])=C\[N+]#N AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- DJHGAFSJWGLOIV-UHFFFAOYSA-K Arsenate3- Chemical compound [O-][As]([O-])([O-])=O DJHGAFSJWGLOIV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102100036473 Phosphoribosylformylglycinamidine synthase Human genes 0.000 description 1
- 101710082600 Phosphoribosylformylglycinamidine synthase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010266 Sephadex chromatography Methods 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 125000001317 arsoryl group Chemical group *[As](*)(*)=O 0.000 description 1
- 229950011321 azaserine Drugs 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical class N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- PPTXFSQSISUDAU-UHFFFAOYSA-M hydrogen sulfate;2-methyl-4-[(2-methylphenyl)diazenyl]benzenediazonium Chemical compound OS([O-])(=O)=O.CC1=CC=CC=C1N=NC1=CC=C([N+]#N)C(C)=C1 PPTXFSQSISUDAU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000013198 immunometric assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 239000011824 nuclear material Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical class CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører et hybrid monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro, idet antistoffet har dobbelt spesifisitet og er fremstilt fra et polydom, og det særegne ved antistoffet i henhold til oppfinnelsen er at nevnte hybride antistoff er fremstilt ved fusjon av to hybridomer, eller et hybridom og en miltcelle (B-lymfocytt), eller fremstilt ved å fjerne kjernen fra et første hybridom og innføre den i cytoplasmaet av et annet hybridom, idet antistoffet er en komponent av en blanding av antistoffer omfattende det hybride antistoff og to species av mono-spesifikke antistoffer i et forhold på omtrent 2:1:1. The present invention relates to a hybrid monoclonal antibody for use in vitro, as the antibody has double specificity and is produced from a polydom, and the distinctive feature of the antibody according to the invention is that said hybrid antibody is produced by fusion of two hybridomas, or a hybridoma and a spleen cell (B-lymphocyte), or prepared by removing the nucleus from a first hybridoma and introducing it into the cytoplasm of another hybridoma, the antibody being a component of a mixture of antibodies comprising the hybrid antibody and two species of mono-specific antibodies in a ratio of approximately 2:1:1.
Oppfinnelsen angår også anvendelse av det nevnte monoklonale antistoff til immunokjemiske analyser. The invention also relates to the use of the aforementioned monoclonal antibody for immunochemical analyses.
Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene. These and other features of the invention appear in the patent claims.
Antigen-antistoffreaksjonen utnyttes allerede rutinemessig ved en rekke praktiske anvendelser og det undersøkes intenst for å etablere dens verdi for andre hittil ikke påviste anvendelser. F.eks. kan serumantistoffer frembragt av et vertsdyrs immunrespons til et immunogen anvendes ved affinitets-renseprosesser for å isolere immunogenet fra oppløsninger hvori det bare foreligger i små mengder. The antigen-antibody reaction is already routinely exploited in a number of practical applications and is being intensively investigated to establish its value for other hitherto unproven applications. E.g. serum antibodies produced by a host's immune response to an immunogen can be used in affinity purification processes to isolate the immunogen from solutions in which it is present only in small amounts.
Under andre omstendigheter, hvis immunogenet er et sykdoms-assosiert antigen, kan dets nærvær i en pasients serum eller annen kroppsvæske påvises under anvendelse av immunoanalyse eller immunometriske metoder. F.eks. er påvisning av HBsAg under anvendelse av en radioimmunometrisk teknikk den for tiden valgte metode. På en annen front er serumantistoffer til ferritin, oppnådd fra New Zealand hvite kaniner og merket med <131>I, rapportert som lovende for behandling av lever-tumorer (se Order at al., International Journal of Radiation Oncology, Biology and Physics, 6, 703 (1980)). Serum-antistoffer, f.eks. dem som oppnås fra kaniner, murine species eller andre pattedyr, er "polyklonale" av natur da immunsystemet i verten stimuleres til å frembringe en blanding av spesifikke antistoffer rettet på de forskjellige antigeniske determinanter eller epitoper på det immunogen som verten reagerer på. De individuelle antistoffer som utgjør blandingen er alle et produkt av et B-celleklon; videre utskiller hver B-celle bare ett spesielt antistoff. Det antistoff som produseres av et klon er forskjellig fra et antistoff mot det samme antigen fremstilt av et annet klon ved at det har minst en subtil forskjell mellom sin peptidsekvens og peptidsekvensen for det annet antistoff. Hvert antistoffspecies er derfor faktisk et distinkt molekyl og forskjellene i peptidsekvens mellom forskjellige species påvirker deres generelle spesifisiteter såvel som de spesielle epitoper som de gjenkjenner og deres affiniteter for antigenet. In other circumstances, if the immunogen is a disease-associated antigen, its presence in a patient's serum or other body fluid can be detected using immunoassay or immunometric methods. E.g. detection of HBsAg using a radioimmunometric technique is the currently chosen method. On another front, serum antibodies to ferritin, obtained from New Zealand white rabbits and labeled with <131>I, have been reported as promising for the treatment of liver tumors (see Order at al., International Journal of Radiation Oncology, Biology and Physics, 6 , 703 (1980)). Serum antibodies, e.g. those obtained from rabbits, murine species or other mammals are "polyclonal" in nature as the host's immune system is stimulated to produce a mixture of specific antibodies directed at the various antigenic determinants or epitopes on the immunogen to which the host responds. The individual antibodies that make up the mixture are all the product of a B-cell clone; furthermore, each B cell secretes only one special antibody. The antibody produced by one clone differs from an antibody to the same antigen produced by another clone in that it has at least a subtle difference between its peptide sequence and the peptide sequence of the other antibody. Each antibody species is therefore actually a distinct molecule and the differences in peptide sequence between different species affect their general specificities as well as the particular epitopes that they recognize and their affinities for the antigen.
En individuell B-celle kan ikke dyrkes uendelig under anvendelse av for tiden tilgjengelig vevdyrkingsteknikk for å oppnå det spesielle antistoff den utskiller som en ren forbindelse. Forholdsvis nylig oppdaget Kohler og Milstein og rapporterte en prosess hvorved et monoklonalt antistoff kan oppnås på grei måte som utskillingsproduktet av en hybrid celle omtalt som et "hybridom". (G. Kohler og C. Milstein, Nature, 256, 495 (1975)). I grunntrekkene innbefatter prosessen fusjon av miltceller tatt fra en immunisert mus med muse-myelomceller til å danne hybridomet. Myelomceller som ikke fremstiller eller i det minste ikke utskiller sitt eget immunoglobulin eller deler derav, foretrekkes. Kulturer av celler oppnådd ved kloning av et enkelt hybridom vil utskille identiske antistoffmolekyler som deretter lett kan oppnås som en ren kjemisk forbindelse. Dette er i motsetning til de konvensjonelle antistoff preparater oppnådd f. eks. fra serum, hvori det enkelte antistoff er bare en av komponentene i en hovedsakelig ikke-separerbar antistoffblanding av beslektede, men likevel distinkte kjemiske forbindelser. An individual B cell cannot be cultured indefinitely using currently available tissue culture techniques to obtain the particular antibody it secretes as a pure compound. Relatively recently, Kohler and Milstein discovered and reported a process by which a monoclonal antibody can be conveniently obtained as the secretion product of a hybrid cell referred to as a "hybridoma". (G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, 495 (1975)). Basically, the process involves fusing spleen cells taken from an immunized mouse with mouse myeloma cells to form the hybridoma. Myeloma cells that do not produce or at least do not secrete their own immunoglobulin or parts thereof are preferred. Cultures of cells obtained by cloning a single hybridoma will secrete identical antibody molecules which can then be easily obtained as a pure chemical compound. This is in contrast to the conventional antibody preparations obtained e.g. from serum, in which the individual antibody is only one of the components of a substantially non-separable antibody mixture of related, yet distinct chemical compounds.
Da det er en ren forbindelse, vil et monoklonalt antistoff ha en konstant spesifisitet for et enkelt sete på antigen-molekylene og en godt definert affinitet. Således kan kloner av forskjellige hybridomer behandles for selektering av dem som frembringer det monoklonale antistoff med de mest ønskelige egenskaper for en gitt anvendelse. Udødeligheten av hybridomet garanterer en nesten ubegrenset forsyning av det antistoff som det utskiller og eliminerer problemer forbundet med varians i antistoff-titer og total affinitet fra dyr til dyr anvendt for fremstilling av serum-antistoffer. Monoklonale antistoffer oppnådd fra hybridomer har f.eks. vært praktisk anvendt i diagnose-sett. Being a pure compound, a monoclonal antibody will have a constant specificity for a single site on the antigen molecules and a well-defined affinity. Thus, clones of different hybridomas can be processed to select those that produce the monoclonal antibody with the most desirable properties for a given application. The immortality of the hybridoma guarantees an almost unlimited supply of the antibody it secretes and eliminates problems associated with variance in antibody titer and overall affinity from animal to animal used for the production of serum antibodies. Monoclonal antibodies obtained from hybridomas have e.g. been practically used in diagnostic kits.
Et antistoffmolekyl kan generelt anses å uttrykke en enkelt spesifisitet som fremvises overfor det immunogen hvortil vertens immunsystem reagerte ved fremstilling av antistoffet. Antistoffet er sammensatt av to identiske halvdeler hvorav hver omfatter et tungt og lett kjedepar og hvorav hver gjenkjenner den samme antigeniske determinant som den annen. An antibody molecule can generally be considered to express a single specificity that is exhibited towards the immunogen to which the host's immune system reacted in producing the antibody. The antibody is composed of two identical halves, each of which comprises a pair of heavy and light chains, and each of which recognizes the same antigenic determinant as the other.
En -S-S- disulfid-bro som knytter sammen de to tunge kjeder ved stedet for cystein-andelene, kan vanligvis spaltes selektivt in vitro ved hjelp av en forsiktig reduksjon og de to halve molekyler disassosieres ved etterfølgende surgjøring. De halve molekyler kan så rekombineres (re-natureres), også in vitro, ved nøytral pH, idet re-assosieringen foregår ved ikke-kovalent interaksjon. A -S-S- disulfide bridge linking the two heavy chains at the site of the cysteine moieties can usually be selectively cleaved in vitro by careful reduction and the two half molecules dissociated by subsequent acidification. The half molecules can then be recombined (re-natured), also in vitro, at neutral pH, as the re-association takes place by non-covalent interaction.
Hvis antistoffer av forskjellige spesifisiteter underkastes en selektiv spaltning av disulfid-broene mellom de tunge kjeder og betingelser som fører til renaturering deretter etableres, kan reassosiering mellom halve molekyler foregå tilfeldig til å frembringe en populasjon av antistoffer, hvorav i det minste noen er hybrider ved at en halvdel av et antistoffmolekyl med en spesifisitet kombinerer med en halvdel av et antistoffmolekyl med en forskjellig spesifisitet. F.eks. beskriver Nisonoff et al. "The Antibody Molecule", Academic Press, New York (1975) på sidene 260-261 en in vitro produksjon av et polyklonalt antistoffhybrid av kanin-antiovalbumin og anti-BGG antistoffer. Hybride monoklonale antistoffer er også oppnådd under anvendelse av en analog prosess. Se D.M. Kranz et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, 5807 (1981). I det minste teoretisk vil det hybride antistoff fremvise en dobbelt spesifisitet ved at en halvdel av antistoffet vil gjenkjenne og binde til en antigenisk determinant eller epitop, mens den annen halvdel vil gjenkjenne en forskjellig epitop på det samme eller et forskjellig antigen. If antibodies of different specificities are subjected to selective cleavage of the disulfide bridges between the heavy chains and conditions leading to renaturation are then established, reassociation between half molecules can occur randomly to produce a population of antibodies, at least some of which are hybrids by one half of an antibody molecule with one specificity combines with one half of an antibody molecule with a different specificity. E.g. describes Nisonoff et al. "The Antibody Molecule", Academic Press, New York (1975) at pages 260-261 an in vitro production of a polyclonal antibody hybrid of rabbit antiovalbumin and anti-BGG antibodies. Hybrid monoclonal antibodies have also been obtained using an analogous process. See D.M. Kranz et al., Proe. Nati. Acad. Pollock. USA, 78, 5807 (1981). At least theoretically, the hybrid antibody will exhibit a dual specificity in that one half of the antibody will recognize and bind to an antigenic determinant or epitope, while the other half will recognize a different epitope on the same or a different antigen.
Selv om hybride antistoffer kan oppnås på den måte som er Although hybrid antibodies can be obtained as is
beskrevet i det foregående, er utbyttene ofte meget lave, de reaksjoner som anvendes for å fremstille dem er vanskelige å reprodusere og de hybride antistoffer utsettes vanligvis for tydelig, irreversibel denaturering. Slik denaturering kan described in the preceding, the yields are often very low, the reactions used to prepare them are difficult to reproduce and the hybrid antibodies are usually exposed to clear, irreversible denaturation. Such denaturation can
redusere immuno-reaktiviteten og ville forventes å resultere i forskjellige metaboliske egenskaper in vivo. Som et resultat er det hybride antistoff hittil stort sett forblitt en laboratorie-kuriositet som er vanskelig å oppnå. reduce immuno-reactivity and would be expected to result in different metabolic properties in vivo. As a result, the hybrid antibody has thus far largely remained a laboratory curiosity that is difficult to obtain.
Antistoffer med dobbelte spesifisiteter kan også fremstilles ved konjugering av par av intakte antistoffer, monoklonale eller ikke, under anvendelse av en rekke koblings- eller fornetningsmidler som protein A (fra Staphylococcus aureus), karbodiimid og bifunksjonelle forbindelser som f.eks. N-succinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat for å oppnå dimere og høyere antistoff-multimerer hvortil hvert medlem av antistoffparet bidrar med sin spesifisitet. F.eks. har Mandoche et al. rapportert dannelse av multivalente antistoffer med dobbelte spesifisiteter ved hjelp av en sekvensmessig reaksjon av antistoffer med protein A, som er blitt vist å være i stand til påvisning av celleoverflate-antigener in vitro. Se J. Immunological Methods, 42, 355, (1981). Ved denne metode binder antistoffer med en spesifisitet til overflate-antigenet og de andre til en andel som tillater påvisning. Antibodies with dual specificities can also be prepared by conjugating pairs of intact antibodies, monoclonal or not, using a variety of coupling or cross-linking agents such as protein A (from Staphylococcus aureus), carbodiimide and bifunctional compounds such as N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate to obtain dimers and higher antibody multimers to which each member of the antibody pair contributes its specificity. E.g. have Mandoche et al. reported the formation of multivalent antibodies with dual specificities by means of a sequential reaction of antibodies with protein A, which have been shown to be capable of detecting cell surface antigens in vitro. See J. Immunological Methods, 42, 355, (1981). In this method, antibodies with one specificity bind to the surface antigen and the others to a proportion that allows detection.
Syntesen av antistoffer med dobbelt spesifisitet ved hjelp av de foregående metoder er komplisert og ingen kommersiell utøvelse av dem er hittil foretatt. The synthesis of antibodies with double specificity by means of the preceding methods is complicated and no commercial practice of them has been carried out to date.
De hybride monoklonale antistoffer i henhold til oppfinnelsen kan fremstilles i gode utbytter uten denaturering. I denne fremstilling vil betegnelsen "hybrid antistoff" anvendes for å betegne et enkelt antistoffmolekyl med to forskjellige spesifisiteter. De individuelle spesifisiteter kan være til antigeniske determinanter på to forskjellige antigener eller til forskjellige antigeniske determinanter (epitoper) på det samme antigen. Videre omfatter også betegnelsen "antigen" også haptener hvis ikke annet er angitt. The hybrid monoclonal antibodies according to the invention can be produced in good yields without denaturation. In this presentation, the term "hybrid antibody" will be used to denote a single antibody molecule with two different specificities. The individual specificities can be to antigenic determinants on two different antigens or to different antigenic determinants (epitopes) on the same antigen. Furthermore, the term "antigen" also includes haptens if not stated otherwise.
De hybride antistoffer med en dobbelt spesifisitet i henhold til oppfinnelsen oppnås ved fusjon av et hybridom, foretrukket et selektivt destruerbart hybridom, som utskiller et antistoff mot en forhåndsselektert antigenisk determinant med en fusjonerbar B-lymfocytt eller et annet hybridom, idet B-lymfocytten eller det annet hybridom utskiller et annet antistoff mot en annen antigenisk determinant, til å danne et annen generasjons hybridom (i det følgende "polydom"). Som anvendt heri betyr betegnelsen "selektivt destruerbart hybridom" et hybridom som mangler eller i det minste hovedsakelig mangler evne til å overleve i det medium hvori polydomet dyrkes. Det er uventet funnet at til forskjell fra opphavshybridomet eller den B-lymfocytt hvorfra det er avledet, som hver utskiller en populasjon av identiske antistoffer med en enkelt spesifisitet, utskiller polydomet i tillegg en høy %andel av et monoklonalt hybrid antistoff med en dobbelt spesifisitet, dvs. en evne til å binde med hvilken som helst av de antigeniske determinanter som gjenkjennes av de individuelle antistoffer produsert av opphavscellene eller med begge determinanter samtidig. Det hybride monoklonale antistoff som oppnådd på denne måte, har ikke vært utsatt for den uønskede denaturering som karakteriserer hybrider oppnådd fra prosessen med kjemisk rekombinering av antistoff-halvmolekyler. Videre tillater den her anvendte metode at hybridet kan oppnås sikkert og i store mengder. The hybrid antibodies with a double specificity according to the invention are obtained by fusion of a hybridoma, preferably a selectively destructible hybridoma, which secretes an antibody against a preselected antigenic determinant with a fusionable B-lymphocyte or another hybridoma, the B-lymphocyte or the another hybridoma secretes a different antibody against a different antigenic determinant, to form a second generation hybridoma (hereinafter "polydom"). As used herein, the term "selectively destructible hybridoma" means a hybridoma that lacks or at least substantially lacks the ability to survive in the medium in which the polydome is grown. It has unexpectedly been found that, unlike the parent hybridoma or the B-lymphocyte from which it is derived, each of which secretes a population of identical antibodies with a single specificity, the polydoma additionally secretes a high percentage of a monoclonal hybrid antibody with a dual specificity, ie, an ability to bind with any of the antigenic determinants recognized by the individual antibodies produced by the cells of origin or with both determinants simultaneously. The hybrid monoclonal antibody obtained in this way has not been subjected to the undesirable denaturation that characterizes hybrids obtained from the process of chemical recombination of antibody half-molecules. Furthermore, the method used here allows the hybrid to be obtained safely and in large quantities.
De hybride monoklonale antistoffer i henhold til oppfinnelsen kan anvendes for immunodiagnose. Generelt anvender slike prosesser et monoklonalt antistoff eller polyklonale antistoffer med en første spesifisitet mot et målantigen og en annen spesifisitet mot en substans, f.eks. et annet antigen eller hapten, som tillater at en diagnose kan foretas for målantigenet eller som tillater tilveiebringelse av eller er i seg selv et middel som er letalt overfor målantigenet eller det vev som det er assosiert med. The hybrid monoclonal antibodies according to the invention can be used for immunodiagnosis. In general, such processes employ a monoclonal antibody or polyclonal antibodies with a first specificity against a target antigen and a second specificity against a substance, e.g. another antigen or hapten, which allows a diagnosis to be made for the target antigen or which allows the provision of or is itself an agent lethal to the target antigen or the tissue with which it is associated.
Ved en passende seleksjon av opphavsceller kan således et polydom oppnås som vil utskille et antistoff med en spesifisitet for et målantigen og en annen spesifisitet for en andel nyttig ved diagnose. Alternativt kan antistoff-halvmolekyler rekombineres under anvendelse av in vitro kjemiske midler eller individuelle intakte monospesifikke antistoffer kan kobles eller fornettes ved hjel? av kjemiske midler til å gi antistoff-multimerer (som kan være en dimer, trimer eller høyere multimer) med en dobbelt spesifisitet og med samme eller en lignende anvendelighet som det hybride monoklonale antistoff med den samme dobbelte spesifisitet i henhold til den foreliggende oppfinnelse. By a suitable selection of cells of origin, a polydom can thus be obtained which will secrete an antibody with a specificity for a target antigen and another specificity for a proportion useful in diagnosis. Alternatively, antibody half-molecules can be recombined using in vitro chemical agents or individual intact monospecific antibodies can be linked or cross-linked by death? of chemical means to provide antibody multimers (which may be a dimer, trimer or higher multimer) with a dual specificity and with the same or a similar utility as the hybrid monoclonal antibody with the same dual specificity according to the present invention.
Som anvendt heri inkluderer betegnelsen "antistoff" anti-stof fragmenter med immunokjemiske egenskaper som Fab eller F(ab)2 fragmenter. As used herein, the term "antibody" includes antibody fragments with immunochemical properties such as Fab or F(ab)2 fragments.
Et formål for den foreliggende oppfinnelse er følgelig hybride monoklonale antistoffer som ikke er blitt denaturert ved fremstillingsprosessen. Anvendbare fremstillingsprosesser vil fremgå av det følgende sammen med eksempler på anvendelser av de hybride monoklonale antistoffer i henhold til oppfinnelsen. Accordingly, an object of the present invention is hybrid monoclonal antibodies which have not been denatured by the manufacturing process. Applicable production processes will be apparent from the following together with examples of applications of the hybrid monoclonal antibodies according to the invention.
Den måte hvorpå disse og andre formål kan oppnås vil fremgå ved betraktning av den etterfølgende beskrivelse av foretrukne utførelsesformer. The way in which these and other purposes can be achieved will become apparent when considering the following description of preferred embodiments.
Som angitt i det foregående krever fremgangsmåten for fremstilling av et hybrid monoklonalt antistoff i henhold til oppfinnelsen som en opphavscelle et hybridom, og foretrukket et selektivt destruerbart hybridom, som utskiller et monoklonalt antistoff mot en forhåndsselektert antigenisk determinant eller epitop. Bruken av et selektivt destruerbart hybridom som opphavscelle har den fordel at den forhindrer at cellene som oppnås ved fusjon av det selektivt destruerbare hybridom med en B-lymfocytt eller et annet hybridom, dvs. polydomet, kan bli fortrengt av en populasjon av opphavshybridomet når cellene oppnådd ved fusjonsprossen dyrkes og til å tilveiebringe et middel hvormed polydomcellene kan isoleres fra opphavshybridomcellene. As stated above, the method for producing a hybrid monoclonal antibody according to the invention requires as a source cell a hybridoma, and preferably a selectively destructible hybridoma, which secretes a monoclonal antibody against a preselected antigenic determinant or epitope. The use of a selectively destructible hybridoma as a cell of origin has the advantage that it prevents the cells obtained by fusion of the selectively destructible hybridoma with a B-lymphocyte or another hybridoma, i.e. the polydoma, from being displaced by a population of the parent hybridoma when the cells obtained at the fusion process are cultured and to provide a means by which the polydom cells can be isolated from the parent hybridoma cells.
Selektivt destruerbare hybridomer kan oppnås fra hybridomer som utskiller et antistoff med en av de ønskede spesifisiteter fremstilt ved den klassiske Kohler-Milstein prosess, dvs. hybridomer oppnådd ved fusjon av en myelomcelle og en B-lymfocytt som finnes i miltcellene i mus. Ved en utførelses-form underkastes et slikt hybridom for en tilbakeseleksjonsprosess for oppnåelse av et hybridom som er selektivt destruerbart. Selectively destructible hybridomas can be obtained from hybridomas that secrete an antibody with one of the desired specificities produced by the classic Kohler-Milstein process, i.e. hybridomas obtained by fusion of a myeloma cell and a B-lymphocyte found in the spleen cells of mice. In one embodiment, such a hybridoma is subjected to a backselection process to obtain a hybridoma which is selectively destructible.
Generelt kan selektiv destruerbarhet oppnås ved tilbakeseleksjon til et hybridom som mangler en genetisk komponent som er nødvendig for dets overleving i et valgt medium hvori polydomet fremstilt ved fusjonen kan dyrkes på grunn av et genetisk bidrag fra fusjonspartneren av det selektivt destruerbare hybridom, dvs. B-lymfocytten eller det annet hybridom. In general, selective destructibility can be achieved by backselection to a hybridoma lacking a genetic component necessary for its survival in a selected medium in which the polydome produced by the fusion can be grown due to a genetic contribution from the fusion partner of the selectively destructible hybridoma, i.e. B- the lymphocyte or the other hybridoma.
Den hittil foretrukne tilbakeseleksjonsprosess innbefatter dyrking av et hybridom som utskiller et antistoff med en av de ønskede spesifisiteter for innlemmelse i det hybride antistoff i et dyrkingsmedium inneholdende 8-azaguanin. I et slikt medium er en hvilken som helst celle som innlemmer 8-azaguanin og derfor kan vokse i mediet, de celler som mangler enzymet hypoxantinguaninfosforibosyltransferase (HPRT). Kloner av celler som mangler dette enzym kan ikke vokse i medium inneholdende hypoxantinaminopterintymidin (HAT). De kan således selektivt ødelegges i dette medium. The heretofore preferred backselection process involves culturing a hybridoma secreting an antibody with one of the desired specificities for incorporation into the hybrid antibody in a culture medium containing 8-azaguanine. In such a medium, any cell that incorporates 8-azaguanine and therefore can grow in the medium are those cells lacking the enzyme hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT). Clones of cells lacking this enzyme cannot grow in medium containing hypoxanthineamineopterinthymidine (HAT). They can thus be selectively destroyed in this medium.
En meget lignende prosess for tilbakeseleksjon innbefatter dyrking av hybridomene som utskiller det ønskede antistoff i et medium inneholdende 6-tioguanin, en annen analog av guanin som er giftig for cellene hvis den innlemmes i DNA. Også her mangler visse celler som vil vokse i dette medium HPRT-enzymet, og kloner av disse cellene vil nødvendigvis være sensitive overfor HAT-medium. A very similar process of backselection involves growing the hybridomas that secrete the desired antibody in a medium containing 6-thioguanine, another analog of guanine that is toxic to cells if incorporated into DNA. Here, too, certain cells that will grow in this medium lack the HPRT enzyme, and clones of these cells will necessarily be sensitive to HAT medium.
Ennå en prosess for tilbakeseleksjon som kan anvendes innbefatter dyrking av celler av den selekterte hybridom-cellelinje i et medium inneholdende hvilken som helst av tyminanalogene 5-bromuracyldecksyribose (BUdR) eller 2-aminopurin. Bare de celler som mangler enzymet tymidin-kinase (TK) kan vokse i et medium inneholdende hvilken som helst av disse to inhibitorer. Som i tilfellet av celler som mangler enzymet HPRT vil celler som mangler TK ikke vokse i HAT-medium. Yet another backselection process that can be used involves culturing cells of the selected hybridoma cell line in a medium containing either of the thymine analogs 5-bromouracildecsyribose (BUdR) or 2-aminopurine. Only those cells lacking the enzyme thymidine kinase (TK) can grow in a medium containing either of these two inhibitors. As in the case of cells lacking the enzyme HPRT, cells lacking TK will not grow in HAT medium.
En forskjellig fremgangsmåte for oppnåelse av et selektivt destruerbart opphavshybridom innbefatter irreversibel enzyminhibering under anvendelse av metaboliske inhibitorer. Blant disse foretrekkes de såkalte Kcat inhibitorer. Disse inhibitorer er analoger av et enzyms substrat som omdannes ved hjelp av målenzymet til et høyt reaktivt molekyl som reagerer med enzymet ved dets aktive sete og resulterer i irreversibel inhibering av enzymet. F.eks. vil behandling av det selekterte hybridom med en analog av glutamin som azaserin eller 5-diazo-5-oksa-L-norleucin (DON) irreversibelt inhibere enzymet formylglycinamidribonukleotidamido-transferase ved dannelse av en kovalent binding med en cysteinrest ved enzymets aktive sete. Denne inhibering vil til slutt resultere i celledød. Hybridomet kan imidlertid reddes ved fusjon med det annet av opphavet til polydomet som tilveiebringer det nødvendige enzym. A different method for obtaining a selectively destructible parent hybridoma involves irreversible enzyme inhibition using metabolic inhibitors. Among these, the so-called Kcat inhibitors are preferred. These inhibitors are analogs of an enzyme's substrate that is converted by the target enzyme into a highly reactive molecule that reacts with the enzyme at its active site and results in irreversible inhibition of the enzyme. E.g. treatment of the selected hybridoma with an analogue of glutamine such as azaserine or 5-diazo-5-oxa-L-norleucine (DON) will irreversibly inhibit the enzyme formylglycinamide ribonucleotide amido-transferase by forming a covalent bond with a cysteine residue at the enzyme's active site. This inhibition will eventually result in cell death. However, the hybridoma can be saved by fusion with the other parent of the polydom that provides the necessary enzyme.
Ved en foretrukket utførelsesform fusjoneres det selektivt destruerbare hybridom med komplementære B-lymfocytter, typisk oppnådd som miltceller tatt fra en vert som på forhånd er blitt immunisert med et antigen, som kan være et hapten bundet til et bærerprotein, selektert til å få verten til å generere en immunreaksjon som frembringer antistoffer med den annen spesifisitet som ønskes i hybridantistoffet. Verten er vanligvis en mus, men species av kaniner, mennesker eller andre dyr kan også anvendes selv om interspeciesfunksjonen kan fremvise en lav grad av stabilitet. Fremgangsmåten for immunisering av en slik vert er selvfølgelig vel kjent og detaljer behøver ikke gis her. In a preferred embodiment, the selectively destructible hybridoma is fused with complementary B lymphocytes, typically obtained as spleen cells taken from a host that has been previously immunized with an antigen, which may be a hapten bound to a carrier protein, selected to cause the host to generating an immune reaction that produces antibodies of the other specificity desired in the hybrid antibody. The host is usually a mouse, but species of rabbits, humans or other animals can also be used, although the interspecies function may exhibit a low degree of stability. The procedure for immunization of such a host is of course well known and details need not be given here.
Fusjon av det selektivt destruerbare hybridom med B-lymfocyttene til å gi polydomet kan gjennomføres ved å kombinere de to grupper av celler i et medium inneholdende et middel til å fremme cellefusjon som f.eks. polyetylenglykol eller Sendi-virus i henhold til kjente metoder. Fusion of the selectively destructible hybridoma with the B-lymphocytes to give the polydoma can be accomplished by combining the two groups of cells in a medium containing an agent to promote cell fusion such as polyethylene glycol or Sendi virus according to known methods.
Etter fusjon overføres cellene til et medium som f.eks. HAT-medium for dyrking. B-lymfocyttene vil overleve bare i en kort tid og opphavshybridomcellene kan ikke vokse i dette medium. Populasjonen av polydomer dannet som et resultat av fusjonen, kan imidlertid dyrkes i dette medium, på grunn av komplementas j onen av opphavshybridomet med f. eks. B-lymfocytten, ved hjelp av et genetisk bidrag av evnen til å danne et manglende enzym som HPRT eller TK eller ved et direkte bidrag av et enzym som er inhibert i opphavshybridomet. Kloner av individuelle polydomer dyrkes og de selekteres som utskiller antistoffer med den ønskede dobbelte spesifisitet. Kloner av polydomer med antistoffer som fremviser den ønskede dobbelte spesifisitet for seleksjon av dem som har den annen spesifisitet, dvs. den som oppnås fra B-lymfocyttene, og affinitet er høyst ønskelig. After fusion, the cells are transferred to a medium such as HAT medium for cultivation. The B-lymphocytes will survive only for a short time and the parent hybridoma cells cannot grow in this medium. The population of polydomes formed as a result of the fusion, however, can be grown in this medium, due to the complementation of the parent hybridoma with e.g. The B-lymphocyte, by means of a genetic contribution of the ability to form a missing enzyme such as HPRT or TK or by a direct contribution of an enzyme that is inhibited in the parent hybridoma. Clones of individual polydomes are cultured and those that secrete antibodies with the desired dual specificity are selected. Clones of polydomes with antibodies exhibiting the desired dual specificity for selection of those having the other specificity, ie that obtained from the B-lymphocytes, and affinity are highly desirable.
Ved en ytterligere utførelsesform oppnås polydomet ved å fusjonere det selektivt destruerbare hybridom under anvendelse av et passende fusjonsmiddel med et annet hybridom som også er selektivt destruerbart. Det annet opphavshybridom oppnås på den samme måte som det første, dvs. ved en prosess med tilbakeseleksjon, irreversibel enzyminhibering eller ved hjelp av en hvilken som helst annen passende teknikk. I et slikt tilfelle må det annet hybridom være i stand til å komplementere.det første. Hvis f.eks. det første selektivt destruerbare hybridom mangler enzymet HPRT må det annet være i stand til å bidra til polydomet et gen som vil sette polydomet i stand til å uttrykke HPRT. Tilsvarende hvis det annet selektivt destruerbare hybridom- mangler enzymet TK In a further embodiment, the polydom is obtained by fusing the selectively destructible hybridoma using a suitable fusion agent with another hybridoma which is also selectively destructible. The second parental hybridoma is obtained in the same way as the first, ie by a process of backselection, irreversible enzyme inhibition or by any other suitable technique. In such a case, the second hybridoma must be able to complement the first. If e.g. the first selectively destructible hybridoma lacks the enzyme HPRT, the second must be able to contribute to the polydome a gene that will enable the polydome to express HPRT. Similarly, if the other selectively destructible hybridoma lacks the enzyme TK
må det første bidra med et gen for TK til polydomet. Lignende komplementæritet mellom de to hybridomer må være tilstede hvis irreversibel inhibering av et enzym er blitt gjennomført for å meddele selektiv destruerbarhet til dem. Det er også mulighet å anvende som et av hybridomopphavene et hybridom som er blitt underkastet en tilbakeseleksjonsprosess, og som det annet et hybridom som er blitt underkastet en prosess med enzyminhibering. must first contribute a gene for TK to the polydom. Similar complementarity between the two hybridomas must be present if irreversible inhibition of an enzyme has been carried out to confer selective destructibility to them. It is also possible to use as one of the hybridoma parents a hybridoma that has been subjected to a backselection process, and as the other a hybridoma that has been subjected to a process of enzyme inhibition.
Bruken av komplementære selektivt destruerbare hybridomer som opphav for polydomet har den fordel at begge opphav kan selekteres på basis av spesifisiteter og affiniteter i det monoklonale antistoff som de fremstiller, mens i tilfellet av fusjon av et enkelt hybridom med B-lymfocytter kan ingen prefusjon-seleksjon blant B-lymfocyttene foretas til å oppnå dem som produserer et antistoff med den ønskede spesifisitet og affinitet. Fusjon av de to selektivt destruerbare hybridomer kan gjen-nomføres under anvendelse av polyetylenglykol eller ved å anvende andre fusjonsmidler, også her ved hjelp av kjente metoder. Etter fusjon overføres cellene til et dyrkingsmedium hvori de to opphav kan vokse, men hvori de polydomer som resulterer fra fusjonen er i stand til vekst på grunn av de komplementære bidrag fra opphavene. The use of complementary selectively destructible hybridomas as the origin of the polydom has the advantage that both origins can be selected on the basis of specificities and affinities of the monoclonal antibody they produce, whereas in the case of fusion of a single hybridoma with B lymphocytes no prefusion selection can among the B-lymphocytes is carried out to obtain those that produce an antibody with the desired specificity and affinity. Fusion of the two selectively destructible hybridomas can be carried out using polyethylene glycol or by using other fusion agents, also here using known methods. After fusion, the cells are transferred to a culture medium in which the two progenitors can grow, but in which the polydomes resulting from the fusion are capable of growth due to the complementary contributions of the progenitors.
Det er hittil drøftet seleksjonsprosesser for oppnåelse av selektivt destruerbare hybridomer for bruk som begge hybridompartnere i en hybridom-hybridomfusjon til å danne et polydom. Nødvendigheten for at det annet av hybridomopphavene skal være selektivt destruerbart kan imidlertid unngås ved å meddele både en dominant og en recessiv markering til det første av hybridomopphavene. En hittil foretrukket metode er HAT-ouabain-seleksjon. Ouabain er en spesifikk inhibitor for den Na<+->K<+> aktiverte ATPase i plasmamembranen. Dette enzym er ansvarlig for innføring av K<+> i en celle og utføring av Na<+ >fra cellen. Heretofore, selection processes for obtaining selectively destructible hybridomas for use as both hybridoma partners in a hybridoma-hybridoma fusion to form a polydom have been discussed. The necessity for the second of the hybridoma parents to be selectively destructible can, however, be avoided by imparting both a dominant and a recessive marker to the first of the hybridoma parents. A hitherto preferred method is HAT-ouabain selection. Ouabain is a specific inhibitor of the Na<+->K<+> activated ATPase in the plasma membrane. This enzyme is responsible for the introduction of K<+> into a cell and the removal of Na<+> from the cell.
Celler av et hybridom som på forhånd er tilbakeselektert for f.eks. å meddele selektiv destruerbarhet, HAT-sensitivitet, dyrkes i ouabain-medium for seleksjon av ouabain-resistente celler. Kloner av disse celler vil være HAT-sensitive, men ouabain-resistente. I motsetning hertil vil det hybridom som er selektert for fusjon med dette være ouabain-sensitivt, men kan overleve og vokse i HAT. Alternativt kan seleksjon for ouabain-resistens foretas først enten på opphavsmyelomlinjen eller hybridomet avledet derfra, etterfulgt av tilbake-seleks jon eller annen teknikk for å meddele selektiv destruerbarhet. Cells of a hybridoma that have previously been back-selected for e.g. to confer selective destructibility, HAT sensitivity, are cultured in ouabain medium for selection of ouabain-resistant cells. Clones of these cells will be HAT-sensitive but ouabain-resistant. In contrast, the hybridoma selected for fusion with this will be ouabain sensitive, but can survive and grow in HAT. Alternatively, selection for ouabain resistance can be made first either on the parent myeloma line or the hybridoma derived therefrom, followed by back-selection or other technique to confer selective indestructibility.
Celler oppnådd ved fusjon av de to hybridomer i polyetylenglykol eller annet fusjonsmiddel overføres til HAT-medium inneholdende ouabain i en konsentrasjon som er letal for det annet av hybridomopphavene. Det selektivt destruerbare av hybridomopphavene kan ikke overleve i HAT-medium som enten f.eks. mangler HPRT eller annet enzym, selv om det er ouabain-resistent. Polydomcellene kan imidlertid vokse i mediet da de vil ha enzymene og ouabain-resistens nødvendig for overleving. Den foregående metode har den fordel at det er mulig å oppnå et polydom ved direkte fusjon av et selektivt destruerbart av hybridomopphavene som utskiller et antistoff med en av de spesifisiteter som ønskes i hybridet med et annet "tilgjengelig" hybridom som utskiller et antistoff med den annen spesifisitet som ønskes i hybridet, og ingen bruk av teknikk for å meddele selektivt destruerbarhet til det annet av hybridomopphavene er da nødvendig. Cells obtained by fusion of the two hybridomas in polyethylene glycol or other fusion agent are transferred to HAT medium containing ouabain in a concentration that is lethal to the other of the hybridoma originators. The selectively destructible of the hybridoma parents cannot survive in HAT medium which is either e.g. lacking HPRT or other enzyme, although ouabain resistant. However, the polydom cells can grow in the medium as they will have the enzymes and ouabain resistance necessary for survival. The preceding method has the advantage that it is possible to obtain a polydom by direct fusion of a selectively destructible of the hybridoma parents secreting an antibody with one of the specificities desired in the hybrid with another "available" hybridoma secreting an antibody with the other specificity desired in the hybrid, and no use of technique to impart selective destructibility to the other of the hybridoma parents is then necessary.
Ennå en ytterligere metode for oppnåelse av et polydom som anvender en universal opphavstype, dvs. en som har både en positiv og en negativ markør, som kan fusjoneres med et hvilket som helst "tilgjengelig" hybridom, innbefatter bruk av rekombinante DNA vektorer som bærer forskjellige medisin-resistens-markører. F.eks. kan det anvendes SV40 som bærer et gen for neomycin-resistens. Yet another method of obtaining a polydoma using a universal type of origin, i.e. one having both a positive and a negative marker, which can be fused to any "available" hybridoma, involves the use of recombinant DNA vectors carrying different drug resistance markers. E.g. SV40 carrying a gene for neomycin resistance can be used.
En hittil foretrukket universal opphavstype er den som er HAT sensitiv-neomycin-resistent. Den valgte opphavstype tilbake-selekteres til HAT-sensitivitet og transfekteres så med SV40 vektor som bærer et gen for neomycin-resistens. Denne metode kan også reverseres idet transfeksjon gjennomføres først. A hitherto preferred universal origin type is that which is HAT sensitive-neomycin resistant. The selected parent type is back-selected for HAT sensitivity and then transfected with SV40 vector carrying a gene for neomycin resistance. This method can also be reversed as transfection is carried out first.
Det resulterende hybridom kan vokse i nærvær av neomycin, som normalt er giftig for mammale celler, men vil dø i nærvær av HAT. Tilgjengelige hybridomer vokser imidlertid i HAT, men dør i nærvær av neomycin. The resulting hybridoma can grow in the presence of neomycin, which is normally toxic to mammalian cells, but will die in the presence of HAT. Viable hybridomas, however, grow in HAT but die in the presence of neomycin.
Produkter fra fusjonen av opphavene overlever derfor i nærvær av HAT og neomycin. Mens bruken av vektorer for å meddele resistens til neomycin foretrekkes hittil kan vektorer som bærer gener som vil meddele resistens for mammale celler overfor andre medisiner også anvendes. Products from the fusion of the origins therefore survive in the presence of HAT and neomycin. While the use of vectors to impart resistance to neomycin is preferred heretofore, vectors carrying genes which will impart resistance to mammalian cells to other drugs may also be used.
Selv om det hittil er foretrukket, er det ikke vesentlig for den foreliggende fremgangsmåte for oppnåelse av polydomer fra par av hybridomer at minst en av opphavscellelinjene er selektivt destruerbar. Det er innenfor rammen av denne teknikk å fusjonere et par hybridomer, hvorav ingen er selektivt destruerbare, men som utskiller et antistoff med en av de spesifisiteter som ønskes i det hybride antistoff, i nærvær av et passende fusjonsmiddel etterfulgt av subkloning av alle celler før populasjonen av ufusjonerte opphavshybridomer øker i en grad slik at seleksjon av subklonene for identifisering av polydomer ikke er praktisk. Subklonene blir deretter selektert for å fastslå hvilke sekret-antistoffer har en dobbelt spesifisitet. Although it has hitherto been preferred, it is not essential for the present method for obtaining polydomes from pairs of hybridomas that at least one of the parent cell lines is selectively destructible. It is within the scope of this technique to fuse a pair of hybridomas, neither of which is selectively destructible, but secretes an antibody with one of the specificities desired in the hybrid antibody, in the presence of a suitable fusion agent followed by subcloning of all cells before the population of unfused parent hybridomas increases to such an extent that selection of the subclones for identification of polydomes is not practical. The subclones are then selected to determine which secreted antibodies have a dual specificity.
Denne prosess er best egnet for oppnåelse av polydomer når fusjonsfrekvensen av opphavscellelinjene er høy. I alle fall, og spesielt når cellefusjonsfrekvensen er lav, kan cellene oppnådd fra fusjonen av hybridomer med monoklonale antistoffer overfor forskjellige antigener, selekteres under anvendelse av en cytofluorograf for identifisering av polydomene. For oppnåelse av dette blir prøver'av de to antigener merket med forskjellige fluorescerende deler hvis fluorescens synes ved forskjellige bølgelengder. F.eks. kan et antigen markeres med fluorescein og det annet antigen med rodamin. Populasjonen av celler fra fusjonen, som foretrukket er blitt dyrket over natten eller i en annen passende tidsperiode for å øke derés antall, inkuberes med de to merkede antigener. Cellene blir så selektert under anvendelse av cytofluorografen. De celler som fluorescerer ved bare en av de to bølgelengder vil være fra cellelinjene av opphavshybridomene: Celler som fremviser fluorescens ved begge bølgelengder vil imidlertid være polydomer som kan isoleres og subklones. This process is best suited for obtaining polydomes when the fusion frequency of the parent cell lines is high. In any case, and especially when the cell fusion frequency is low, the cells obtained from the fusion of hybridomas with monoclonal antibodies to different antigens can be selected using a cytofluorograph for polydomain identification. To achieve this, samples of the two antigens are labeled with different fluorescent moieties whose fluorescence appears at different wavelengths. E.g. one antigen can be marked with fluorescein and the other antigen with rhodamine. The population of cells from the fusion, which preferably have been cultured overnight or for another suitable period of time to increase their numbers, are incubated with the two labeled antigens. The cells are then selected using the cytofluorograph. The cells that fluoresce at only one of the two wavelengths will be from the cell lines of the original hybridomas: cells that exhibit fluorescence at both wavelengths, however, will be polydomes that can be isolated and subcloned.
Ved ennå en ytterligere utførelsesform kan et polydom oppnås direkte ved å fjerne kjernen fra et første hybridom som utskiller et monoklonalt antistoff med en av de spesifisiteter som ønskes i hybridet og innføring av denne i cytoplasmaet av et annet hybridom som utskillet et monoklonalt antistoff med den annen ønskede spesifisitet. Selvfølgelig behøver ingen av opphavshybridomene å være selektivt destruerbare for å kunne anvendes ved denne prosess. Etter innføring av kjernematrialet klones cellen til å oppnå en populasjon av polydomet. In yet another embodiment, a polydoma can be obtained directly by removing the nucleus from a first hybridoma secreting a monoclonal antibody with one of the specificities desired in the hybrid and introducing this into the cytoplasm of another hybridoma secreting a monoclonal antibody with the other desired specificity. Of course, none of the original hybridomas need to be selectively destructible in order to be used in this process. After introduction of the nuclear material, the cell is cloned to obtain a population of polydomes.
Det er funnet at til forskjell fra opphavshybridomene eller B-lymfocyttene som utskiller et enkelt antistoff, utskiller polydomceller oppnådd ved de ovennevnte metoder en blanding av antistoffer, hvorav minst ett er et hybrid antistoff med en dobbelt spesifisitet. Av polydomene fremstilles også forholdsvis mindre mengder av antistoffer med samme spesifisitet som de som fremstilles av opphavscellene anvendt for oppnåelse av polydomet. Forholdet mellom hybride og monospesifikke antistoffer synes å være omtrent 2:1:1 som er det forhold som forventes hvis polydomet produserer like mengder av alle de mulige (H) kjeder sem syntetiseres av opphavscellene som er tilfeldig kombinert i selve polydomet. It has been found that unlike the parent hybridomas or B-lymphocytes which secrete a single antibody, polydom cells obtained by the above methods secrete a mixture of antibodies, at least one of which is a hybrid antibody with a dual specificity. Relatively smaller amounts of antibodies with the same specificity as those produced by the parent cells used to obtain the polydomain are also produced from the polydomain. The ratio between hybrid and monospecific antibodies appears to be approximately 2:1:1, which is the ratio expected if the polydome produces equal amounts of all the possible (H) chains synthesized by the cells of origin that are randomly combined in the polydome itself.
Polydomene kan dyrkes in vitro eller vokse in vivo i hvilke som helst genetisk forlikelige dyr eller hårløse mus til å gi større mengder av det hybride antistoff som utvinnes fra dyrkningsmediet eller ascitin-fluidet av dyret under anvendelse av kjente prosesser. Se f.eks. protokollene i "Monoclonal Antibodies", utgitt av Kennett et al., Plenum Press, New York (1980) sidene 336-418. The polydomains can be cultured in vitro or grown in vivo in any genetically compatible animal or hairless mouse to yield larger amounts of the hybrid antibody recovered from the culture medium or ascites fluid of the animal using known procedures. See e.g. the protocols in "Monoclonal Antibodies", published by Kennett et al., Plenum Press, New York (1980) pages 336-418.
Blandingen av antistoffer fremstilt av polydomet kan separeres til å gi hybridet. F.eks. tillater sekvensmessig affinitetskromatografering mot først det ene og deretter det annet antigen som hybridet er spesifikt overfor, dets separering fra de monospesifikke antistoff-forurensninger. Det er også funnet at enkel ionebyttingskromatografering og elektroforetiske metoder også kan anvendes i det minste under visse forhold. Om nødvendig kan ladningsforskjellen for ionebytting være en av egenskapene for antistoffet som tas i betraktning ved selektering av opphavslinjene. The mixture of antibodies produced by the polydomet can be separated to give the hybrid. E.g. allows sequential affinity chromatography against first one and then the other antigen for which the hybrid is specific, its separation from the monospecific antibody contaminants. It has also been found that simple ion exchange chromatography and electrophoretic methods can also be used at least under certain conditions. If necessary, the charge difference for ion exchange can be one of the properties of the antibody taken into account when selecting the lines of origin.
Eksempel 1 Example 1
Et hybrid monoklonalt antistoff i samsvar med oppfinnelsen med dobbelt spesifisitet for hepatitt B overflateantigen (HBsAg) og prostatasur fosfatase (PAP) ble fremstilt på følgende måte: Et hybridom som utskiller et monoklonalt antistoff til PAP ble dyrket i HAT-medium i 1 uke og deretter overført til og dyrket i et ikke-selektivt medium. Etter forskjellige lengder av voksetid under ikke-selektive betingelser ble 2 ml porsjoner av celler anbragt i medium inneholdende 10~<4> M 8-azaguanin som forhindrer cellene fra å vokse ved å innlemme 8-azaguanin i deres DNA i stedet for guanin. Cellene som mangler HPRT-enzymet overlevde og vokste i dette medium og disse celler overlevde ikke nødvendigvis i HAT. A hybrid monoclonal antibody according to the invention with dual specificity for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and prostatic acid phosphatase (PAP) was prepared as follows: A hybridoma secreting a monoclonal antibody to PAP was cultured in HAT medium for 1 week and then transferred to and cultured in a non-selective medium. After various lengths of growth time under non-selective conditions, 2 ml portions of cells were placed in medium containing 10~<4> M 8-azaguanine which prevents the cells from growing by incorporating 8-azaguanine into their DNA in place of guanine. The cells lacking the HPRT enzyme survived and grew in this medium and these cells did not necessarily survive in HAT.
Kloner som vokste i mediet inneholdende 8-azaguanin ble testet for sensitivitet til HAT og anti-PAP produksjon. Et klon som fremdeles fremstilte anti-PAP og fremviste HAT-sensitivitet med en reversjonsfrekvens på mindre enn 4 x 10-^ ble subklonet. Alle subklonene oppførte seg lik opphavsklonet. Clones grown in the medium containing 8-azaguanine were tested for sensitivity to HAT and anti-PAP production. A clone that still produced anti-PAP and exhibited HAT sensitivity with a reversion frequency of less than 4 x 10 -^ was subcloned. All subclones behaved similarly to the parent clone.
Celler fra en av de HAT-sensitive subkloner ble fusjonert i polyetylenglykol med miltceller oppnådd fra Balb/c mus hyperimmunisert med HBsAg til å gi polydomer under anvendelse av fusjonsteknikken til Gerhard. Se "Monoclonal Antibodies", supra, side 370. Fusjonen frembragte 220 polydomer som ble selektert for å bestemme hvilke som utskilte antistoffer med spesifisitet for både PAP og HBsAg. Kloner av to slike polydomer ble funnet å fremstille antistoff og kunne utvinnes fra ascites og fremviste begge spesifisiteter. Cells from one of the HAT-sensitive subclones were fused in polyethylene glycol with spleen cells obtained from Balb/c mice hyperimmunized with HBsAg to give polydomes using the fusion technique of Gerhard. See "Monoclonal Antibodies", supra, page 370. The fusion produced 220 polydoms which were selected to determine which secreted antibodies with specificity for both PAP and HBsAg. Clones of two such polydomes were found to produce antibody and could be recovered from ascites and exhibited both specificities.
Subkloner av begge polydomer fortsatte å produsere ascites som fremviste begge spesifisiteter og ga trippelbånd på Orstein-Davis PAGE lik de tilsvarende for opphavsklonet. Ascitene fra begge kloner ble funnet å binde <125>I-HBsAg og 12 5I_PAp ved radioimmunoanalyse og ga Ka-verdier på omtrent 10^ for hver og antydet således dannelse av antistoffer med to spesifisiteter. Subclones of both polydomes continued to produce ascites exhibiting both specificities and yielding triple bands on Orstein-Davis PAGE similar to those corresponding to the parental clone. The ascites from both clones were found to bind <125>I-HBsAg and 12 5I_PAp by radioimmunoassay and gave Ka values of approximately 10^ for each, thus suggesting formation of antibodies with two specificities.
Data i tabell I i det følgende viser resultatene oppnådd ved immunoanalyse under anvendelse av ascites oppnådd fra et klon av en av polydomene sammenlignet med ascites oppnådd fra hybridomer som utskiller monoklonale antistoffer, henholdsvis mot IgE (anvendt som en kontroll), PAP og HBsAg under anvendelse av immobilisert HBsAg som en fast fase og en rekke radiomerkede antigener som oppløsningsfase. Data in Table I below show the results obtained by immunoassay using ascites obtained from a clone of one of the polydomains compared with ascites obtained from hybridomas secreting monoclonal antibodies, respectively against IgE (used as a control), PAP and HBsAg using of immobilized HBsAg as a solid phase and a variety of radiolabeled antigens as a solution phase.
En 200 mikroliter prøve av ascites fra polydomet og hver av de tre hybridomer ble hver inkubert over natten med 12 polystyrenkuler som HBsAg var bundet til. HBsAg kulene ble oppnådd fra Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois. Etter vasking ble triplikatprøver inkubert i 4 timer med 100,000 cm av det indikerte <l25>i merkede antigen. Etter en annen vasking ble kulene tellet for å bestemme mengden av merket antigen bundet til kulene. Ved et sett av tester under anvendelse av radiomerket PAP som oppløsningsfase-antigen ble anti-PAP tilsatt til antigenet før det ble inkubert med kulen. Antistoffet til PAP anvendt for dette formål er det monoklonale antistoff som fremstilles av opphavshybridomet anvendt for å fremstille polydomet og er derfor mot den samme PAP epitop som den som forventes å utvises av det hybride antistoff. A 200 microliter sample of ascites from the polydom and each of the three hybridomas was each incubated overnight with 12 polystyrene beads to which HBsAg was bound. The HBsAg beads were obtained from Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois. After washing, triplicate samples were incubated for 4 hours with 100,000 cm of the indicated <125>i labeled antigen. After a second wash, the beads were counted to determine the amount of labeled antigen bound to the beads. In one set of tests using radiolabeled PAP as the solution phase antigen, anti-PAP was added to the antigen prior to incubation with the bead. The antibody to PAP used for this purpose is the monoclonal antibody produced by the parent hybridoma used to produce the polydom and is therefore against the same PAP epitope as that expected to be displayed by the hybrid antibody.
Data i tabell I indikerer at bare den stråling som forventes fra ikke-spesifikk binding måles for anti-PAP ascites ved sammenligning med strålingen for IgE kontrollen. Data in Table I indicate that only the radiation expected from non-specific binding is measured for anti-PAP ascites when compared to the radiation for the IgE control.
Ascitene inneholdende HBsAg antistoffet, på den annen side, bandt det merkede HBsAg antigen som forventet, men fremviste ikke-spesifikk binding når de andre merkede antigener ble testet. Ascitene fra polydom-klonec bandt imidlertid både merket HBsAg og merket PAP, idet førstnevnte skyldes nærværet av noe ikke-hybrid, monospesifikt antistoff til KBsAg i ascitene og sistnevnte kan tilskrives et hybrid som kan binde og brodanne HBsAg på kulen og det spormerkede PAP i opp-løsning. Forsøket under anvendelse av en blanding av merket PAP og anti-PAP fra opphavshybridomet bekrefter at anti-PAP spesifisiteten av hybridet er for den samme epitop som det antistoff som utskilles opphavshybridomet, da bare bakgrunns-stråling iakttas ved inhibering av binding av merket PAP til det hybride antistoff på grunn av opphavsantistoffet. The ascites containing the HBsAg antibody, on the other hand, bound the labeled HBsAg antigen as expected, but showed non-specific binding when the other labeled antigens were tested. However, the ascites from polydom-klonec bound both labeled HBsAg and labeled PAP, the former being due to the presence of some non-hybrid, monospecific antibody to KBsAg in the ascites and the latter attributable to a hybrid that can bind and bridge HBsAg on the bead and the trace-labeled PAP in the ascites -solution. The experiment using a mixture of labeled PAP and anti-PAP from the parent hybridoma confirms that the anti-PAP specificity of the hybrid is for the same epitope as the antibody secreted by the parent hybridoma, as only background radiation is observed upon inhibition of binding of the labeled PAP to the hybrid antibody due to the parent antibody.
Analyse av ascitene fra polydomklonet anvendt ved den sammen-lignende radiobedømmelse ble gjennomført under anvendelse av polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) og immunoelektroforese (IEP) . Begge indikerte nærvær av minst tre antistoffspecies. Analysis of the ascites from the polydomin clone used in the comparative radiojudgment was carried out using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and immunoelectrophoresis (IEP). Both indicated the presence of at least three antibody species.
DEAE ionebyttingskromatografi i preparativ målestokk ga tre velseparerte topper hvorav den midtre hadde en skulder. Hver av de tre topper var homogene ved analyse med PAGE og IEP og hver tilsvarte et av båndene i den opprinnelige ascites. Preparative-scale DEAE ion-exchange chromatography gave three well-separated peaks, the middle one of which had a shoulder. Each of the three peaks was homogeneous when analyzed by PAGE and IEP and each corresponded to one of the bands in the original ascites.
Material som representerer hver av DEAE toppene ble testet for antigen-binding under .anvendelse av radiomerket HBsAg og PAP. Den første topp bandt HBsAg, men ikke PAP. Den midtre topp og dens skulder bandt til både HBsAg og PAP og den siste topp bandt bare PAP. Den midtre topp er således et hybrid-antistoff med en dobbelt spesifisitet til HBsAg cg PAP bestående av minst to subspecies. Material representing each of the DEAE peaks was tested for antigen binding using radiolabeled HBsAg and PAP. The first peak bound HBsAg but not PAP. The middle peak and its shoulder bound to both HBsAg and PAP and the last peak bound only PAP. The middle peak is thus a hybrid antibody with a double specificity to HBsAg cg PAP consisting of at least two subspecies.
Det hybride antistoff oppnådd som den midtre topp ved DE AS kromatografering ble radiomerket med <125>j> Etter merking ville 85 % av det merkede antistoff binde til PAP og 88 ville binde til HEsAg. Affiniteten av hybridet for PAP ble funnet å være noe mindre enn for det monoklonale antistoff til PAP produsert av opphavslinjen. Denne forskjell i affinitet var omtrent den samme som iakttatt mellom et monoklonalt antistoff og dets Fab fragment. The hybrid antibody obtained as the middle peak by DE AS chromatography was radiolabeled with <125>j> After labeling, 85% of the labeled antibody would bind to PAP and 88 would bind to HEsAg. The affinity of the hybrid for PAP was found to be somewhat less than that of the monoclonal antibody to PAP produced by the parent line. This difference in affinity was about the same as observed between a monoclonal antibody and its Fab fragment.
DEAE kromatografering indikerer at hybrid antistoff omfatter mer enn 50 % av antistoffene produsert av polydomet og utgjør omtrent forholdet 2:1:1 forutsagt på statistisk basis hvis polydomet skulle syntetisere alle de mulige tunge antistoff-kjeder, dvs. de som fremviser enten PAP eller HBsAg spesifisitet, som er kombinert inne i cellen på et tilfeldig grunnlag til å danne hybrid-antistoff blandet med mindre mengder av ce to monospesifikke antistoffer med den samme spesifisitet som de som frembringes av opphavscellene. Eksistensen av subspecies av hybrid antistoff antyder at de kan være forskjellige med hensyn til deres lette kjedesamnen-setning. DEAE chromatography indicates that hybrid antibody comprises more than 50% of the antibodies produced by the polydome and constitutes approximately the 2:1:1 ratio predicted on a statistical basis if the polydome were to synthesize all possible antibody heavy chains, i.e. those displaying either PAP or HBsAg specificity, which are combined inside the cell on a random basis to form hybrid antibody mixed with smaller amounts of ce two monospecific antibodies with the same specificity as those produced by the cells of origin. The existence of hybrid antibody subspecies suggests that they may differ with respect to their light chain conformation.
Eksempel 2 Example 2
Hybride monoklonale antistoffer i samsvar med oppfinnelsen med dobbelt spesifisitet for human IgD og prolactin ble fremstilt ved fusjonen av to hybridomer, hvorav en var bygget opp til å inneholde to selekterbare genetiske markører: sensitivitet til HAT-medium og resistens til ouabain. Dette dobbelt markerte hybridom eller såkalte "universale opphavshybridom" kunne så fusjoneres til et hvilket som helst annet hybridom. De resulterende polydomer vokser i nærvær av HAT og ouabain, mens eventuelle ufusjonerte opphavsceller.dør. Fordelene med å anvende "universale opphav" er beskrevet andre steder heri. Hybrid monoclonal antibodies according to the invention with dual specificity for human IgD and prolactin were produced by the fusion of two hybridomas, one of which was constructed to contain two selectable genetic markers: sensitivity to HAT medium and resistance to ouabain. This doubly marked hybridoma or so-called "universal origin hybridoma" could then be fused to any other hybridoma. The resulting polydomes grow in the presence of HAT and ouabain, while any unfused progenitor cells die. The advantages of using "universal origins" are described elsewhere herein.
For oppbygging av slike universalopphav ble begge selekterbare markører innført under den initiale oppbygning av hybridomet. For å oppnå denne opphavslinje ble det lett tilgjengelige HAT-sensitive musemyelom p3.653 selektert for en annen genetisk markør, ouabainresistens, ved innføring av 1 mM ouabain i dyrkingsmediet. Mens de fleste celler døde hadde omtrent 1/100,000 celler ved tilfeldig mutasjon oppnådd resistens overfor den nevnte substans og overlevde således og formerte seg til å danne den nye myelompopulasjon som var HAT-sensitiv og ouabainresistent. For the construction of such universal origins, both selectable markers were introduced during the initial construction of the hybridoma. To obtain this lineage, the readily available HAT-sensitive mouse myeloma p3.653 was selected for another genetic marker, ouabain resistance, by introducing 1 mM ouabain into the culture medium. While most cells died, about 1/100,000 cells had by chance mutation acquired resistance to the aforementioned substance and thus survived and proliferated to form the new myeloma population which was HAT-sensitive and ouabain-resistant.
Dette HAT-sensitive ouabainresistente myelom ble så fusjonert med miltceller oppnådd fra Balb/c mus hyperimmunisert med IgD under anvendelse av den tidligere angitte teknikk til Gerhard. Hybrider ble selektert i HAT-medium (uten ouabain) og kloner ble selektert for produksjon av monoklonalt antistoff rettet mot IgD. Fra de positive kloner ble den som produserte et IgG mot IgD selektert for videre studium. Dette klon ble testet for rentensjon av trekket med ouabain-resistens ved å tilsette 1 mM ouabain til dyrkningsmediet. Omtrent 1/3 av cellene bibeholdt denne genetiske markør. Når kulturen ble dyrket eksponentielt i ouabain ble cellene subklonet. Ouabainresistente subkloner ble testet for fortsatt produksjon av det monoklonale anti IgD antistoff. Et av subklonene ble videre tilbakeselektert ved metoden i eksempel 1 til å gi en populasjon av celler sensitive til HAT. Dette subklon ble dyrket i 2 uker under ikke-selektive betingelser og deretter anbragt i medium inneholdende 6-tioguanin. Som tidligere bemerket er virkningsmekanismen for 6-tioguanin lignende virkningen av 8-azaguanin. Celler som innlemmer 6-tioguanin i sitt DNA i stedet for guanin, vil ikke vokse. Celler som mangler HPRT-enzym vil ikke utnytte 6-tioguanin fra mediet og kan derfor vokse, men-er følgelig sensitive overfor HAT. Denne populasjon av det tilbake-selekterte subklon ble så selv subklonet i 6-tioguanin og ouabainholdig medium. Subkloner ble bedømt for fortsatt produksjon av det monoklonale anti-IgD antistoff. Et klon som viste alle de ønskede egenskaper - vekst i ouabain og 6-tioguanin såvel som fremstilling av monoklonalt anti-IgD, ble selektert som såkalt "universalopphav". Disse universalopphav kunne så fusjoneres til et hvilket som helst annet HAT-resistent ouabainsensitivt hybdidom til å danne et polydom som ville uttrykke et hybridantistoff og en spesifisitet av dette ville være anti-IgD. For dette formål ble det initialt selektert et musehybridom som utskiller et monoklonalt antistoff rettet mot prolactin. Det anti-prolactinmonoklonale antistoff er av den samme underklasse (IgGi) som det anti-IgD som opphavslinjen uttrykker og det separeres lett fra antistoffet på Ornstein-Davis geler. En slik separering indikerer meget forskjellig ladning på antistoffene og skulle således tillate lett isolering av et hybridantistoff ved hjelp av DEAE-Sephadex-kromatografering. This HAT-sensitive ouabain-resistant myeloma was then fused with spleen cells obtained from Balb/c mice hyperimmunized with IgD using the previously stated technique of Gerhard. Hybrids were selected in HAT medium (without ouabain) and clones were selected for production of monoclonal antibody directed against IgD. From the positive clones, the one that produced an IgG against IgD was selected for further study. This clone was tested for retention of the ouabain resistance trait by adding 1 mM ouabain to the culture medium. About 1/3 of the cells retained this genetic marker. When the culture was grown exponentially in ouabain, the cells were subcloned. Ouabain-resistant subclones were tested for continued production of the monoclonal anti-IgD antibody. One of the subclones was further backselected by the method in example 1 to give a population of cells sensitive to HAT. This subclone was grown for 2 weeks under non-selective conditions and then placed in medium containing 6-thioguanine. As previously noted, the mechanism of action of 6-thioguanine is similar to that of 8-azaguanine. Cells that incorporate 6-thioguanine into their DNA instead of guanine will not grow. Cells lacking the HPRT enzyme will not utilize 6-thioguanine from the medium and can therefore grow, but are consequently sensitive to HAT. This population of the back-selected subclone was then itself subcloned in 6-thioguanine and ouabain-containing medium. Subclones were assessed for continued production of the monoclonal anti-IgD antibody. A clone that showed all the desired properties - growth in ouabain and 6-thioguanine as well as production of monoclonal anti-IgD, was selected as so-called "universal origin". These universal origins could then be fused to any other HAT-resistant ouabain-sensitive hybdidom to form a polydom that would express a hybrid antibody and one specificity of which would be anti-IgD. For this purpose, a mouse hybridoma that secretes a monoclonal antibody directed against prolactin was initially selected. The anti-prolactin monoclonal antibody is of the same subclass (IgGi) as the anti-IgD expressed by the parent line and is easily separated from the antibody on Ornstein-Davis gels. Such a separation indicates very different charges on the antibodies and should thus allow easy isolation of a hybrid antibody by means of DEAE-Sephadex chromatography.
IO<7> celler av den HAT-sensitive, ouabainresistente cellelinje ble fusjonert i polyetylenglykol med IO<7> celler som fremstiller antiprolactin. De fusjonerte celler ble først dyrket i 3 døgn og til slutt anbragt på nytt i HAT-medium. Mer enn 600 kloner oppsto fra denne fusjon: 66 kloner ble tilfeldig selektert for analyse. Av disse kloner fremviste 3 6 både anti-IgD og antiprolactin aktivitet. IO<7> cells of the HAT-sensitive, ouabain-resistant cell line were fused in polyethylene glycol with IO<7> cells that produce antiprolactin. The fused cells were first cultured for 3 days and finally placed again in HAT medium. More than 600 clones arose from this fusion: 66 clones were randomly selected for analysis. Of these clones, 36 exhibited both anti-IgD and antiprolactin activity.
Disse klonsupernatanter ble bedømt med hensyn til nærvær av hybridantistoff ved hjelp av følgende bedømmelse. En polystyrenkule belagt med et annet antiprolactin monoklonalt antistoff ble inkubert i 5 timer med 200 mikroliter av en 100 ng/ml prolactinoppløsning. Det anvendte antistoff binder prolactin ved et distinkt sete i forhold til tilsvarende for det antistoff som frembringes av den fusjonerte hybridor.-cellelinje. Kulen ble vasket og deretter inkubert over natten med klonsupernatantene. Den neste dag etter flere vaskinger ble <!25>i merket IgD tilsatt. Hybridantistoff bundet til kulen med en funksjonell binding kunne binde det radiomerkede IgD med den fri anti-IgD funksjonalitet mens hverken opphavstype antistoff IgD-IgD eller prolactin-prolactin kunne danne denne bro mellom prolactinkulen og <125>i IgD sporstoff. Resultater av en typisk bedømmelse for kloner som frembringer hybrid bifunksjonelt antistoff er gjengitt i den etterfølgende tabell 2. 21 av 36 kloner fremviste vesentlig bifunksjonell aktivitet ved denne bedømmelse. Ascites utviklet fra 2 hittil til-gjengeligé kloner er blitt vist å reagerer i den bifunksjonelle bedømmelse. Disse ascites inneholder antistoffer som separerer de tre distinkte bånd på Orstein-Davis geler: To bånd faller nøyaktig sammen med antistoffer produsert av opphavshybridomer (Anti-IgD og antiprolactin). Det tredje bånd vandrer midtveis mellom de opphavsmonoklonale antistoff-bånd som forventet for det hybride antistoff. These clone supernatants were assessed for the presence of hybrid antibody using the following assay. A polystyrene bead coated with another antiprolactin monoclonal antibody was incubated for 5 hours with 200 microliters of a 100 ng/ml prolactin solution. The antibody used binds prolactin at a distinct site compared to the corresponding antibody produced by the fused hybridor cell line. The pellet was washed and then incubated overnight with the clone supernatants. The next day after several washings, <!25>i labeled IgD was added. Hybrid antibody bound to the bead with a functional bond could bind the radiolabeled IgD with the free anti-IgD functionality, while neither parent antibody IgD-IgD nor prolactin-prolactin could form this bridge between the prolactin bead and <125>i IgD tracer. Results of a typical evaluation for hybrid bifunctional antibody-producing clones are shown in the following table 2. 21 of 36 clones showed significant bifunctional activity in this evaluation. Ascites developed from 2 hitherto available clones has been shown to respond in the bifunctional assessment. These ascites contain antibodies that separate the three distinct bands on Orstein-Davis gels: Two bands coincide exactly with antibodies produced by the parent hybridomas (Anti-IgD and antiprolactin). The third band migrates midway between the parent monoclonal antibody bands as expected for the hybrid antibody.
At et hybrid monoklonalt antistoff mot IgD og prolactin fremviser en doserespons når mengden av prolactin varieres ved analysen anvendt for å utvikle dataene i tabell 2, er vist ved dataene i tabell 3 under anvendelse av antistoffet i klonat nr. 2 og, som kontroller, antistoffer fra opphavs-cellelinjen (anti-IgD og antiprolactin). That a hybrid monoclonal antibody against IgD and prolactin exhibits a dose response when the amount of prolactin is varied in the assay used to develop the data in Table 2 is shown by the data in Table 3 using the antibody in clone #2 and, as controls, antibodies from the cell line of origin (anti-IgD and antiprolactin).
Disse data viser at mengden av prolactin bundet av det hybride antistoff er doseresponsivt ved at mengden av merket IgD som bindes økes når dosen av prolactin økes. I motsetning hertil iakttas ingen doserespons under anvendelse av opphavsantistoffene mot IgD og prolactin da de ikke kan danne broen mellom prolactin bundet til kulen og det merkede IgD. Det hybride antistoff kan således anvendes som en komponent ved en bedømmelse av prolactin. Skreddersying av andre hybride antistoffer frembyr lignende muligheter for andre bedømmelser. These data show that the amount of prolactin bound by the hybrid antibody is dose-responsive in that the amount of labeled IgD that is bound is increased when the dose of prolactin is increased. In contrast, no dose response is observed using the parent antibodies against IgD and prolactin as they cannot form the bridge between prolactin bound to the bead and the labeled IgD. The hybrid antibody can thus be used as a component in an assessment of prolactin. Tailoring other hybrid antibodies presents similar opportunities for other assessments.
Eksempel 3 Example 3
Ved en liknende teknikk som eksempel 2 ble et universalt opphavshybridom utviklet som utskiller monoklonalt antistoff rettet mot haptenarsenat-arsenat-dimeren og som er både resistent mot ouabain og sensitivt til HAT. Dette hybridom ble fusjonert til et hybridom som utskiller et monoklonalt antistoff med spesifisitet for carcinoembryonisk antigen (CEA), et antigen som uttrykkes både av embryoniske vev og flere typer av carcinom. Også her resulterte mer enn 600 kloner fra fusjonen. Av 7 2 kloner testet for evnen til å binde både CEA og arsenat hadde 69 begge bindingsaktiviteter. De kloner som fremviste den største binding ble selektert for enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) av hybrid antistoff. For hver analyse fikk CEA oppløsning (600 ng eller 250 ng) absorbere over natten i hver brønn i en mikrotiter plastplate med 96 brønner. Den neste dag ble uabsorbert material vasket ut av brønnene med PBS-Tween 20. Klonsupernatanter ble tilsatt og inkubert i 2 1/2 timer ved 35°C og deretter vasket bort av platen. CEA-CEA og CEA-arsenat antistoff ville forbli festet til platen via det absorberte antigen. Det annet antigen, arsenylsyre koblet til enzymet alkalisk fosfatase,- ble tilsatt brønnene i 3 timer ved 35°C. Etter en ytterligere vasking med PSB-Tween ble kromagen-substrat for alkalisk fosfatase, paranitrofenylfosfat, tilsatt til brønnene og farge utviklet i 48 timer. Adsorbsjon i hver brønn ble målt ved 410 nm. Ved tilstedeværelse i en klonsupernatant bandt det hybride antistoff det adsorberte CEA på platen ved en funksjonalitet og etterlot den annen fri til å binde arsenylsyre koblet til alkalisk fosfatase. Farge fra kromagensubstratet utviklet seg bare hvor det alkaliske fosfatase koblet til arsenylsyren hadde blitt bundet. Ved denne analyse fremviste 3 av 12 supernatanter hybrid antistoffaktivitet som indikert i tabell 4. By a similar technique to example 2, a universal origin hybridoma was developed which secretes monoclonal antibody directed against the haptenarsenate-arsenate dimer and which is both resistant to ouabain and sensitive to HAT. This hybridoma was fused into a hybridoma secreting a monoclonal antibody with specificity for carcinoembryonic antigen (CEA), an antigen expressed both by embryonic tissues and several types of carcinoma. Here too, more than 600 clones resulted from the fusion. Of 72 clones tested for the ability to bind both CEA and arsenate, 69 had both binding activities. The clones that showed the greatest binding were selected for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of hybrid antibody. For each assay, CEA solution (600 ng or 250 ng) was allowed to absorb overnight in each well of a 96-well plastic microtiter plate. The next day, unabsorbed material was washed out of the wells with PBS-Tween 20. Clone supernatants were added and incubated for 2 1/2 hours at 35°C and then washed off the plate. CEA-CEA and CEA-arsenate antibody would remain attached to the plate via the absorbed antigen. The second antigen, arsenyl acid linked to the enzyme alkaline phosphatase, was added to the wells for 3 hours at 35°C. After a further wash with PSB-Tween, the chromagen substrate for alkaline phosphatase, paranitrophenyl phosphate, was added to the wells and color developed for 48 hours. Adsorption in each well was measured at 410 nm. When present in a clone supernatant, the hybrid antibody bound the adsorbed CEA on the plate at one functionality and left the other free to bind arsenylic acid coupled to alkaline phosphatase. Color from the chromagen substrate developed only where the alkaline phosphatase coupled to the arsenylic acid had been bound. In this assay, 3 of 12 supernatants exhibited hybrid antibody activity as indicated in Table 4.
Den foreliggende oppfinnelse muliggjør også immunodiagnose The present invention also enables immunodiagnosis
. under anvendelse av antistoffer med en dobbelt spesifisitet, f.eks. hybride antistoffer oppnådd som beskrevet ovenfor og . using antibodies with a dual specificity, e.g. hybrid antibodies obtained as described above and
fra antistoff-halvmolekyler ved hjelp av den konvensjonelle teknikk til Nisonoff et al., supra, eller antistoff-multimerer oppnådd ved kobling eller fornetning av individuelle monospesifikke antistoffer. Foretrukket er det antistoff med dobbelt spesifisitet som anvendes i disse metoder et hybrid antistoff fremstilt på sikker måte og oppnådd som en hovedsakelig ren forbindelse som ikke har være utsatt for denaturering og som har en ensartet spesifisitet og affinitet for antigenet. from antibody half-molecules using the conventional technique of Nisonoff et al., supra, or antibody multimers obtained by linking or crosslinking individual monospecific antibodies. Preferably, the dual specificity antibody used in these methods is a hybrid antibody prepared in a safe manner and obtained as a substantially pure compound which has not been subjected to denaturation and which has a uniform specificity and affinity for the antigen.
I tilfellet av immunodiagnostiske anvendelser vil en av de to spesifisiteter som utvises av hybridet eller annet antistoff med dobbelt spesifisitet vært mot det målantigen hvis påvisning er ønsket og den annen vil være mot et annet antigen, som kan være et hapten eller andre molekylære species, som tillater diagnosen. F.eks. vil et antistoff nyttig ved immunohistologi ha en første spesifisitet for et antatt antigen, f.eks. et tumor assosiert antigen som CEA, PAP eller ferritin, og en annen spesifisitet mot et hapten eller antigen som vil delta i en fargereaksjon som f.eks. et enzym som bevirker en fargereaksjon i nærvær av et passende substrat. Blant passende enzymer hvortil den annen spesifisitet av antistoffet kan rettes er prostatasur fosfatase (PAP) pepperrot-peroksydase, glukoseoksydase og alkalisk fosfatase. In the case of immunodiagnostic applications, one of the two specificities exhibited by the hybrid or other dual specificity antibody will be against the target antigen whose detection is desired and the other will be against another antigen, which may be a hapten or other molecular species, which allows the diagnosis. E.g. will an antibody useful in immunohistology have a first specificity for a putative antigen, e.g. a tumor associated antigen such as CEA, PAP or ferritin, and another specificity towards a hapten or antigen that will participate in a color reaction such as e.g. an enzyme that causes a color reaction in the presence of a suitable substrate. Among suitable enzymes to which the second specificity of the antibody can be directed are prostatic acid phosphatase (PAP) horseradish peroxidase, glucose oxidase and alkaline phosphatase.
For gjennomføring av den histologiske undersøkelse behandles først en vevseksjon med antistoffet med dobbelt spesifisitet. Før dette gjøres kan hybridet allerede ha fått binde seg til det enzym som katalyserer fargereaksjonen. Hvis ikke blir deretter seksjonen behandlet med en annen oppløsning inneholdende enzymet og renset etter en passende inkubasjon og deretter behandlet med substratet som undergår en fargeendring i nærvær av enzymet. Dannelsen av den farge som frembringes av enzymet og substratet i vevsprøven er en positiv indikasjon på nærvær i vevet av målantigenet. Det hybride antistoff mot HBsAg og PAP hvis fremstilling er beskrevet heri, er funnet å binde til HBsAg på et test-substrat (polystyrenkuler) og til PAP i et simulert farge-eksperiment under anvendelse av p-nitrofenylfosfat som enzymsubstrat. Etter inkubasjon av det hybride antistoff med PAP og HBsAg resulterte tilsetningen av p-nitrofenylfosfatet i at kulene undergikk den karakteristiske fargeendring fra gult til brunt. To carry out the histological examination, a tissue section is first treated with the antibody with double specificity. Before this is done, the hybrid may have already been allowed to bind to the enzyme that catalyzes the color reaction. If not, the section is then treated with another solution containing the enzyme and cleared after an appropriate incubation and then treated with the substrate which undergoes a color change in the presence of the enzyme. The formation of the color produced by the enzyme and the substrate in the tissue sample is a positive indication of the presence in the tissue of the target antigen. The hybrid antibody against HBsAg and PAP, the preparation of which is described herein, has been found to bind to HBsAg on a test substrate (polystyrene beads) and to PAP in a simulated color experiment using p-nitrophenyl phosphate as enzyme substrate. After incubation of the hybrid antibody with PAP and HBsAg, the addition of the p-nitrophenyl phosphate resulted in the beads undergoing the characteristic color change from yellow to brown.
Som bemerket i eksempel 2 kan også et antistoff med dobbelt spesifisitet anvendes ved immunoanalyser og immunometriske analyser. Under anvendelse av det hybride antistoff mot HBsAg og PAP hvis fremstilling er beskrevet i foregående, kan en immunometrisk analyse for HBsAg gjennomføres under anvendelse av et immobilisert monoklonalt antistoff for HBsAg i en fast fase til å ekstrahere HBsAg fra et serum eller en annen flytende prøve som muligens inneholder antigenet. Prøven inkuberes med en kule, korn, testrør eller annet substrat som har anti-HBsAg bundet eller belagt på over-flaten. Inkubasjonen med serumprøven kan etterfølges av, foretas samtidig eller foretas etter en inkubasjon med en oppløsning av hybridet. I alle fall, hvis HBsAg er tilstede i prøven, vil resultatet være dannelse av en sandwich av det immobiliserte antistoff, HBsAg, hvis dette er til stede i prøven og det hybride antistoff. Som del av bedømmelsen tillates PAP å binde til det hybride antistoff. Dette kan gjøres under eller etter dannelse av sandwichen, eller alternativt kan antistoff-PAP-komplekset forhåndsdannes. Etter dannelse av sandwichen vaskes den faste fase for å fjerne prøverester og ubundet hybrid antistoff og bringes deretter i kontakt med en oppløsning inneholdende et substrat som f.eks. p-nitrofenylfosfat eller a-naftolfosfat som undergår en fargeendring i nærvær av PAP. Forekomst av en fargeendring bekrefter nærværet av målantigen i prøven. As noted in Example 2, an antibody with dual specificity can also be used in immunoassays and immunometric analyses. Using the hybrid antibody against HBsAg and PAP whose preparation is described above, an immunometric assay for HBsAg can be carried out using an immobilized monoclonal antibody for HBsAg in a solid phase to extract HBsAg from a serum or other liquid sample which possibly containing the antigen. The sample is incubated with a bead, bead, test tube or other substrate that has anti-HBsAg bound or coated on the surface. The incubation with the serum sample can be followed by, carried out at the same time or carried out after an incubation with a solution of the hybrid. In any case, if HBsAg is present in the sample, the result will be the formation of a sandwich of the immobilized antibody, HBsAg, if present in the sample, and the hybrid antibody. As part of the assessment, PAP is allowed to bind to the hybrid antibody. This can be done during or after formation of the sandwich, or alternatively the antibody-PAP complex can be preformed. After formation of the sandwich, the solid phase is washed to remove sample residues and unbound hybrid antibody and then brought into contact with a solution containing a substrate such as e.g. p-nitrophenyl phosphate or α-naphthol phosphate which undergoes a color change in the presence of PAP. Occurrence of a color change confirms the presence of the target antigen in the sample.
Ved en slik bedømmelse under anvendelse av det polyklonale anti-HBsAg-korn i et kommersielt sett for diagnose av HBsAg fremstilt av Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois (markedsført under betegnelsen "Aushia"), ble prøver inneholdende forskjellige mengder HBsAg inkubert med kornene. De anvendte prøver var positive og negative kontroller fra det kommersielle sett og to prøver oppnådd ved fortynning av den positive kontroll med den negative kontroll i forholdene på enten en del negativ kontroll:2 deler positiv kontroll eller 2 deler negativ kontroll:1 del positiv kontroll. In such an evaluation using the polyclonal anti-HBsAg bead in a commercial kit for the diagnosis of HBsAg manufactured by Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois (marketed under the name "Aushia"), samples containing different amounts of HBsAg were incubated with the beads. The samples used were positive and negative controls from the commercial kit and two samples obtained by diluting the positive control with the negative control in the ratios of either one part negative control:2 parts positive control or 2 parts negative control:1 part positive control.
Etter inkubasjon av prøvene med kornet til å binde HBsAg ble kornet vaske.t og inkubert med det hybride antistoff reaktivt til både HBsAg og PAP. Dette muliggjorde dannelse av en sandwich av immobiliserte antistoffer: antigen: og hybrid antistoff. Kornet ble på nytt vasket og inkubert med en oppløsning av PAP. Denne inkubasjon ble fulgt av en ytterligere vasking og kornet inkubert med et substrat a-naftolfosfat. PAP fjerner enzymatisk fosfat. Etter en passende inkubasjon ble substratet fjernet fra kornet og tilsatt en indikator Fast Garnet GBC salt som endres fra fargeløst til rødaktig purpur i nærvær av produktet fra den enzymatiske reaksjon. En fargeendring ble iakttatt til å bekrefte nærvær av HBsAg i prøvene. Absorpsjon ved 57 0 nm ble målt for prøvene og disse data er vist i den etterfølgende tabell 5. After incubation of the samples with the bead to bind HBsAg, the bead was washed and incubated with the hybrid antibody reactive to both HBsAg and PAP. This enabled the formation of a sandwich of immobilized antibodies: antigen: and hybrid antibody. The pellet was again washed and incubated with a solution of PAP. This incubation was followed by a further wash and the grain incubated with a substrate α-naphthol phosphate. PAP removes enzymatic phosphate. After an appropriate incubation, the substrate was removed from the grain and an indicator Fast Garnet GBC salt was added which changes from colorless to reddish purple in the presence of the product of the enzymatic reaction. A color change was observed to confirm the presence of HBsAg in the samples. Absorption at 570 nm was measured for the samples and these data are shown in the following table 5.
Disse data viser en doserespons med variasjon i HBsAg konsentrasjon som kunne forventes hvis det hybride antistoff danner en bro mellom HBsAg bundet til kulen og PAP. Dette viser ytterligere nytten av et hybrid antistoff ved en immunoanalyse. These data show a dose response with variation in HBsAg concentration that would be expected if the hybrid antibody forms a bridge between HBsAg bound to the bead and PAP. This further demonstrates the utility of a hybrid antibody in an immunoassay.
Andre påvisningsmidler enn enzymatisk katalyserte reaksjoner er også mulig. F.eks. kan den annen spesifisitet av hybridet eller et annet antistoff med en dobbelt spesifisitet rettes mot et hapten eller antigen som er radiomerket eller som er fluorescent eller som kan påvises i sandwichen ved hjelp av hvilke som helst passende midler. Other means of detection than enzymatically catalyzed reactions are also possible. E.g. the other specificity of the hybrid or another antibody with a dual specificity may be directed against a hapten or antigen which is radiolabelled or which is fluorescent or which can be detected in the sandwich by any suitable means.
En foretrukket prosess som anvender et hybrid antistoff eller et annet antistoff med en dobbelt spesifisitet ved en immunoanalyse utnytter fenomenet med fluorescens-utslukning. Ved en slik bedømmelse rettes en spesifisitet av antistoffet mot et målantigen og den annen mot f.eks. et hapten som bærer en fluorescerende kromofor. Kromoforen er enten bundet til A preferred process using a hybrid antibody or another antibody with a dual specificity in an immunoassay utilizes the phenomenon of fluorescence quenching. In such an assessment, one specificity of the antibody is directed against a target antigen and the other against e.g. a hapten carrying a fluorescent chromophore. The chromophore is either bound to
haptenet eller kan i passende tilfeller være selve haptenet. the hapten or in appropriate cases can be the hapten itself.
Analysen gjennomføres ved inkubering av antistoffet med serum eller en annen prøve som kan inneholde målantigenet hvortil . er tilsatt en forut bestemt mengde av målantigen merket med en utslukningskromofor. Den merkede antigen konkurrerer med eventuelt målantigen i prøven for antistoffets bindested som er spesifikt for målantigenet. Før, under eller etter denne inkubasjon inkuberes en mengde av haptenet som bærer den fluorescerende kromofor med antistoffet og binder ved det annet bindingssted. The analysis is carried out by incubating the antibody with serum or another sample which may contain the target antigen for which . is added a predetermined amount of the target antigen labeled with a quenching chromophore. The labeled antigen competes with any target antigen in the sample for the antibody's binding site which is specific for the target antigen. Before, during or after this incubation, a quantity of the hapten carrying the fluorescent chromophore is incubated with the antibody and binds at the second binding site.
De to kromoforer selekteres slik at det første cv dem fluorescerer ved en bølgelengde som kan absorberes (ut-slukkes) av den annen hvis de anbringes tilstrekkelig nær hverandre slik at det foton som emitteres av der. fluorescerende kromofor kan oppfanges av utslukkeren. For å gjøre dette bør de to kromoforer ligge innenfor omtrent 100 Angstrøm fra hverandre og foretrukket innenfor cmtrent 50 Ångstrøm fra hverandre. Denne posisjonering vil forekomme når den fluorescerende kromofor bindes ved ett antistoff-bindingssete og den utslukkende kromofor bindes til det tilsatte antigen ved det annet. Et passende par av kromoforer inkluderer fluorescein som fluorescerende kromofor og rodamin som den utslukkende kromofor. The two chromophores are selected so that the first cv them fluoresces at a wavelength that can be absorbed (extinguished) by the other if they are placed sufficiently close to each other so that the photon that is emitted from there. fluorescent chromophore can be captured by the quencher. To do this, the two chromophores should be within about 100 Angstroms of each other and preferably within about 50 Angstroms of each other. This positioning will occur when the fluorescent chromophore binds at one antibody binding site and the quenching chromophore binds to the added antigen at the other. A suitable pair of chromophores includes fluorescein as the fluorescent chromophore and rhodamine as the quenching chromophore.
Den målte fluorescens vil variere inverst med mengden av nativt antigen i prøven siden, i fravær av nativt antigen, alt antigen bundet til antistoffet vil være merket med den utslukkende kromofor og være i stilling til å absorbere fluorescens ved kromoforen som bæres av haptenet. Sammenligning av den målte fluorescens med fluorescensen av en kontrollprøve inneholdende en kjent mengde av antigen tillater en kvalitativ og kvantitativ bestemmelse av nærværet av antigen i prøven. The measured fluorescence will vary inversely with the amount of native antigen in the sample since, in the absence of native antigen, all antigen bound to the antibody will be labeled with the quenching chromophore and be in a position to absorb fluorescence at the chromophore carried by the hapten. Comparison of the measured fluorescence with the fluorescence of a control sample containing a known amount of antigen allows a qualitative and quantitative determination of the presence of antigen in the sample.
Denne type immunoanalyse kan f.eks. anvendes for å bestemme innholdet i serum av medisiner som dilantin som må nøye overvåkes. Ved en slik bedømmelse bør målantigenet selv-følgelig være dilantin. Det vil være klart for den fagkyndige på området at denne prosess kan anvendes for å påvise andre antigener og spesielt inklusive tumorassosierte antigener. This type of immunoassay can e.g. used to determine the serum content of drugs such as dilantin which must be closely monitored. In such an assessment, the target antigen should naturally be dilantin. It will be clear to the expert in the field that this process can be used to detect other antigens and especially including tumor-associated antigens.
En annen foretrukket prosess som anvender et hybrid antistoff eller et annet antistoff med en dobbelt spesifisitet ved en immunobedømmelse anvender en enzymatisk reaksjon. Ved en hittil foretrukket prosess rettes en av antistoff-spesifisitetene selvfølgelig til målantigenet og den annen til et enzym eller et hapten hvortil et enzym er bundet. Another preferred process using a hybrid antibody or another antibody with a dual specificity in an immunoassay uses an enzymatic reaction. In a hitherto preferred process, one of the antibody specificities is of course directed to the target antigen and the other to an enzyme or a hapten to which an enzyme is bound.
Bedømmelsen gjennomføres ved å inkubere antistoffet med en prøve som kan inneholde målantigenet hvortil er blitt tilsatt en forut bestemt mengde av målantigenet som er modifisert ved binding til en substans som innvirker med enzymet til å frembringe enten en påvisbar substans eller på en annen måte tillate påvisning av dannelse av antigen-antistoff-komplekset. Påvisningen kan f.eks. skje ved fluorimetri, luminescens, spektrofotometri e.l. The assessment is carried out by incubating the antibody with a sample which may contain the target antigen to which has been added a predetermined amount of the target antigen which has been modified by binding to a substance which interacts with the enzyme to produce either a detectable substance or in another way allow the detection of formation of the antigen-antibody complex. The detection can e.g. happen by fluorimetry, luminescence, spectrophotometry etc.
Ved en alternativ prosess kan det tilsatte målantigen være bundet til enzymet og i dette tilfelle har antistoffet en av sine spesifisiteter rettet mot den substans som innvirker med enzymet eller mot et hapten hvortil substansen er bundet. Den substans som innvirker med enzymet kan i seg selv være et annet enzym. I et slikt tilfelle katalyserer et av enzymene produksjon av et produkt som kreves av det annet. Når således antistoffet binder både det tilsatte målantigen, hvortil et av enzymene er bundet, og det annet enzym, dannes produktet fra den første enzymatiske reaksjon i nærheten av det annet enzym før vesentlig diffusjon av produktet i det omgivende medium kan foregå. In an alternative process, the added target antigen can be bound to the enzyme and in this case the antibody has one of its specificities directed at the substance that interacts with the enzyme or at a hapten to which the substance is bound. The substance that interacts with the enzyme may itself be another enzyme. In such a case, one of the enzymes catalyzes the production of a product required by the other. Thus, when the antibody binds both the added target antigen, to which one of the enzymes is bound, and the other enzyme, the product from the first enzymatic reaction is formed in the vicinity of the second enzyme before significant diffusion of the product into the surrounding medium can take place.
Et eksempel på en slik prosess utnytter de to enzymer heksokinase (HK) og glukose-6-fosfat-dehydrogenase (G-6-PDH) i det følgende reaksjonsskjema. An example of such a process uses the two enzymes hexokinase (HK) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH) in the following reaction scheme.
For utnyttelse av dette reaksjonsskjema vil det tilsatte målantigen ha enten HK eller G-6-PDH bundet til seg og det hybride antistoff vil ha en av sine spesifisiteter rettet mot det annet (eller et hapten som bærer det). Prøven er i tillegg til det hybride antistoff og den forut bestemte mengde av enzymmerket antigen, tilsatt glukose, ATP og koenzymet NAD<+>. Det hybride antistoff har foretrukket det annet enzym allerede bundet til seg. Alternativt kan dette enzym tilsettes til prøven sammen med de andre reagenser. Under inkubasjonen vil det enzymmerkede antigen konkurrere med eventuelt nativt antigen i prøven om et av bindingssetene i det hybride antistoff. Det annet enzym er eller vil bli bundet til annet bindingssete. Dette tillater dannelse av glukose-6-fosfat katalysert av HK til å foregå i tett nærhet til G-6-PDH. Det sistnevnte omdanner glukose-6-fosfat til glukonolakton-6-fosfat, et resultat som følges av reduksjon av NAD<+> til NADH. NADH absorberer sterkt ved 340 nm og kan derfor påvises spektrofotometrisk. Mengden av dannet NADH varierer inverst med mengden av nativt antigen i prøven, dvs. dets maksimale produksjon forekommer når der ikke er noe målantigen i prøven som bedømmes. Sammenligning av mengden av NADH dannet med en kontrollprøve tillater en kvalitativ og kvantitavtiv bestemmelse i nærværet av antigen i prøven. To utilize this reaction scheme, the added target antigen will have either HK or G-6-PDH bound to it and the hybrid antibody will have one of its specificities directed against the other (or a hapten that carries it). The sample is, in addition to the hybrid antibody and the predetermined amount of enzyme-labeled antigen, added glucose, ATP and the coenzyme NAD<+>. The hybrid antibody has preferred the other enzyme already bound to it. Alternatively, this enzyme can be added to the sample together with the other reagents. During the incubation, the enzyme-labeled antigen will compete with any native antigen in the sample for one of the binding sites in the hybrid antibody. The other enzyme is or will be bound to another binding site. This allows formation of glucose-6-phosphate catalyzed by HK to occur in close proximity to G-6-PDH. The latter converts glucose-6-phosphate to gluconolactone-6-phosphate, a result which is followed by the reduction of NAD<+> to NADH. NADH absorbs strongly at 340 nm and can therefore be detected spectrophotometrically. The amount of NADH formed varies inversely with the amount of native antigen in the sample, ie its maximum production occurs when there is no target antigen in the sample being assessed. Comparison of the amount of NADH formed with a control sample allows a qualitative and quantitative determination of the presence of antigen in the sample.
Denne type bestemmelse kan anvendes for å overvåke mengden av dilantin eller andre medisiner i serum. I et slikt tilfelle er medisinen målantigenet. En slik bestemmelse kan imidlertid også anvendes for å påvise andre serumantigener som f.eks. dem som er assosiert med tumorer eller andre sykdommer. This type of determination can be used to monitor the amount of dilantin or other drugs in the serum. In such a case, the drug is the target antigen. However, such a determination can also be used to detect other serum antigens such as e.g. those associated with tumors or other diseases.
Claims (8)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US36778482A | 1982-04-12 | 1982-04-12 | |
PCT/US1983/000525 WO1983003679A1 (en) | 1982-04-12 | 1983-04-12 | Antibodies having dual specificities, their preparation and uses therefor |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO834536L NO834536L (en) | 1983-12-09 |
NO171643B true NO171643B (en) | 1993-01-04 |
NO171643C NO171643C (en) | 1993-04-14 |
Family
ID=26768261
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO834536A NO171643C (en) | 1982-04-12 | 1983-12-09 | ANTIBODIES WITH DOUBLE SPECIFICATIONS, THEIR PREPARATION AND USE |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
DK (1) | DK564883D0 (en) |
NO (1) | NO171643C (en) |
-
1983
- 1983-12-08 DK DK564883A patent/DK564883D0/en unknown
- 1983-12-09 NO NO834536A patent/NO171643C/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO171643C (en) | 1993-04-14 |
DK564883A (en) | 1983-12-08 |
DK564883D0 (en) | 1983-12-08 |
NO834536L (en) | 1983-12-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2562002B2 (en) | Hybrid monoclonal antibody with bispecificity | |
JP2714786B2 (en) | Methods for producing chimeric antibodies | |
EP0068763B2 (en) | Recombinant monoclonal antibodies | |
EP0265500B1 (en) | Antibody to human progesterone receptor and diagnostic materials and methods | |
Haugen et al. | Monoclonal antibody to aflatoxin B1-modified DNA detected by enzyme immunoassay. | |
CN110167967B (en) | Idiotypic antibodies directed against anti-PD-L1 antibodies and uses thereof | |
CA1171780A (en) | Method for the determination of an antigen in solution | |
US6808901B1 (en) | Production of chimeric antibodies | |
EP0245520B1 (en) | Monoclonal antibody against glutathione s-transferase and its use in the diagnosis of cancer | |
CN114213541B (en) | Monoclonal antibody of totipotent nuclease and preparation method thereof | |
NO171643B (en) | ANTIBODIES WITH DOUBLE SPECIFICATIONS, THEIR PREPARATION AND USE | |
US6306615B1 (en) | Detection method for monitoring β tubulin isotype specific modification | |
CN116396392B (en) | Antibody specific to digoxigenin and related application thereof | |
METTLER et al. | Monoclonal sperm antibodies: their potential for investigation of sperms as target of immunological contraception | |
CA2355893C (en) | Antiuracil monoclonal antibody | |
CN117264072B (en) | anti-SN 38 monoclonal antibody and application thereof | |
JPH06504424A (en) | Monoclonal anti-IgM antibodies, their production and use, and hybridomas for producing them | |
JPH0467959B2 (en) | ||
JPS6239772A (en) | Method for quantifying human prolylhydroxylase by radioactive immunoassay | |
Fletcher et al. | Monoclonal antibody: A major new development in immunology | |
CA1329545C (en) | Immunological complex, its preparation and its use | |
JP2004091454A (en) | Antibody, method for producing the same and method for quantitatively determining antigen by using the same antibody | |
JP2520249B2 (en) | Quantitative determination of human prolyl hydroxylase by immunoassay | |
Liu | Development of bispecific monoclonal antibodies and their applications in ultrasensitive virus ELISA; phage display technology and viral purification. | |
JPS5920228A (en) | Hybridoma cell strain and monoclonal antibody against theophylline |