【０００１】
【発明に属する技術分野】
本発明は芍薬の主有効成分であるＰＥに対するＭＡｂを生産するハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞融合技術は、ケーラーとミルスタインの報告（Ｎａｔｕｒｅ，４９５−４９７頁、１９７５年）以来急速に発展した。哺乳動物の脾細胞と癌細胞であるミエローマ細胞を融合させた雑種細胞をハイブリドーマと称する。ハイブリドーマは用いた脾細胞が産生する抗体産生能を有することから、多くの蛋白質やペプチドの様な高分子化合物に対する抗体の生産に用いられてきた。
【０００３】
一方、本出願人は通常は抗原とは成りえない芍薬の配糖体に対するＭＡｂを産生するハイブリドーマを作製する。ＰＥは有用な薬理活性を有する芍薬の主要な配糖体である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
芍薬中のＰＦの含有量は少なく、その検出は容易ではない。ましてや漢方薬中の含有量を精査するためには前処理等に多大な労力を要する。このため前処理を必要とせず、再現性があり、かつ高感度なアッセイ系が要求される。これに対応出来うるのはＭＡｂ以外にない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上述の問題点を解決すべく研究を重ねた結果、細胞融合によりＰＦに対する、ＭＡｂを産生するハイブリドーマを得、本ハイブリドーマを培養することによって抗ＰＦ抗体を大量に生産することに成功した。本抗体を用いることによって高感度、再現性良好な、かつ前処理を必要としないアッセイ系を完結した
【０００６】
【実施の形態】抗ＰＥ ＭＡｂを生産するハイブリドーマは以下の様に作成する。すなわち、（１）抗原としてＰＦ−ＢＳＡ複合体を免疫した動物の抗体産生脾臓細胞を作成する。（２）ミエローマ細胞を培養増殖し、調整する。（３）上記２種の細胞をポリエチレングリコールを媒体として融合する。（４）得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地にて選抜する。（５）抗ＰＦＭＡｂ生産ハイブリドーマを選抜する。（６）選抜ハイブリドーマをクローニングする。これらの行程について詳細に説明する。
【０００７】
（抗体産生細胞の調整）
ＰＦ−ＢＳＡ複合体を動物に免疫する。免疫法としてはフロイントのコンプリートアジュバンドを併用する手法がとられる。動物としてはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示される。抗体産生細胞としては脾臓、リンパ節、抹消血液等から分離した細胞が使用される。
【０００８】
（骨髄腫細胞の調整）
細胞融合に使用する骨髄腫細胞は特に限定されず、各種の哺乳動物の細胞株が利用可能であるが、抗体産生細胞の調整に用いた動物と同種の細胞株を使用するのが好ましい。用いる細胞株は細胞融合の後に、未融合の骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマのみが増殖可能なようにすることによって、未融合細胞と融合細胞を選別することを考慮して、特定の薬剤抵抗性を有するものが好ましい。例えば８−アザグアニン抵抗性の細胞は、ＨＡＴ培地中で生育できない性質を有するため好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞株、ＰＡＩ，Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８，Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−ＵＩ，Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１，Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３．，ＳＰ２／０−Ａｇ１４，ＦＯ，Ｓ１９４／５ＸＸＯ，ＢＵ．１，ＭＰＣ１１−４５．６．，ＴＧ．１．７等が用いられる。
【０００９】
（融合細胞）
細胞融合は通常ＭＥＭ培地、ＲＭＩ１６４０培地、ＩＭＤＭ培地等のｅ−ＲＤＦ培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を混合（混合比は通常１：４−１：１０）することにより行われる。融合促進剤としては平均分子量１０００−６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が使用できる。ＰＥＧの使用濃度は通常３０−５０％である。
【００１０】
（ハイブリドーマの選択的増殖）
融合を終えた細胞は、１０％ＦＣＳ含有ｅ−ＲＤＦ培地などで適当に希釈し、遠心分離する。沈査を選択培地（例えばＨＡＴ培地）で浮遊し、９６穴ウエルマイクロプレートに接種した後に、５％炭酸ガス培養装置で培養する。選択培地で生育してくる細胞はハイブリドーマである。
【００１１】
（抗体産生ハイブリドーマの検索）
抗体産生ハイブリドーマの検索は常法に従えばよく、特に限定されない。例えばハイブリドーマの増殖した培養液を採取し、ＰＦ−ＨＳＡと反応させ、酵素、蛍光物質、発光物質などでラベルした２次抗体との反応により検索できる。
【００１２】
（クローニング）
抗体産生ハイブリドーマを含むことを確認した培養ウエル中の細胞を限界希釈法などによりクローニングを行い、ＭＡｂ産生ハイブリドーマを得る。以上の操作により抗ＰＦ ＭＡｂ産生ハイブリドーマＣ３１Ｂ９を得た。このハイブリドーマはＰＦに対する特異的なＭＡｂを産生する新規な細胞である。
【００１３】
（抗ＰＦ ＭＡｂの調整）
上記で得られたハイブリドーマを適切な培地中で培養することにより、その培養上清から本発明ＭＡｂが得られる。大量に生産する方法としては骨髄腫細胞由来動物と同種の動物にプリスタン等の鉱物油を腹腔内投与後、ハイブリドーマを接種する。接種後、腹水を採取し、通常の抗体分離操作により抗ＰＦ ＭＡｂを得る。また、無血清培地で培養し、通常の手法で抗ＰＦ ＭＡｂを得る。
【００１４】
（抗ＰＦ ＭＡｂのキャラクタリゼーション）
精製した抗ＰＦ−ＭＡｂのサブクラス、軽鎖等を通常の方法で決定した。
【００１５】
（発明の効果）
本抗体は極めて特異性が高いので通常のＥＬＩＳＡに用いることにより、再現性が高く、高感度、かつ前処理が不要な定量が可能である。以下の実施例で示すように各種の芍薬のＰＦ含有量を簡便に定量出来る。
【００１６】
【実施例】
（抗ＰＥ ＭＡｂ産生ハイブリドーマの製造）
（抗原の調整）
ＰＦ５ｍｇをメタノール４ｍｌに溶かした液を，５ｍｇの過ウ素酸ナトリウムを水０．６ｍｌに溶かした液に滴下し室温で１時間反応した。ＢＳＡ添加炭酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ９．６，１ｍｌ）を上記の反応液に加えて反応した。反応後水に対して４℃で透析を行い、凍結乾燥後ＰＦ−ＢＳＡ（４．８ｍｇ）を得た。なおＥＬＩＳＡで使用するＰＥ−ＨＳＡについても同様な方法で作製した。
【００１７】
（抗原中のハプテン数の検討）
得られたＰＦ−ＢＳＡ抱合体の微量をとり、過剰のシナピン酸を添加して混合する。混合物の小量をカセットのウエルに入れ、マルデイトフマスにて測定する（図１）。
【００１８】
（免疫脾細胞の調整）
ＰＦ−ＢＳＡ抱合体５０μｇをフロイント−コンプリート−アジュバントに乳濁化させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与した。以後、２週間の間隔で５０μｇのＰＦ−ＢＳＡ抱合体アジュバント溶液を２回同様に投与し、最後にＰＥ−ＢＳＡ抱合体のみを１００μｇ投与し免疫を完了した。３日後にマウスを麻酔下屠殺し、脾臓を摘出した。脾臓を細断した後、１００メッシュのナイロン網でろ過し、脾臓の単離細胞を得た。
【００１９】
（ハイブリドーマの調整）
単離した免疫脾細胞に低張液（１５５ｍＭ塩化アンモニューム）を加えて赤血球を溶血した後、ｅ−ＲＤＦ培地で細胞を３回洗う。マウス骨髄腫細胞もｅ−ＲＤＦ培地で３回洗浄した。両細胞数を計測し脾細胞と骨髄腫細胞を１０：１の割合として遠心をする。上清を捨て、沈殿した細胞を充分解きほぐし、ポロエチレングリコール（ＰＥＧ）４、０００を培地で希釈した５０％液を１．０ｍｌ滴下して融合を行った。３７℃、３０秒間静置した後、ｅ−ＲＤＦ培地５ｍｌを５分間かけて添加した。１、０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈殿を１０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭにより洗い、遠心して上清を捨てた。ヒポキサンチン１０−２Ｍ、アミノプテリン４ｘ１０−７Ｍおよびチミジン１．５ｘ１０−５Ｍを加えた（ＨＡＴ−）１０％ＦＣＳ添加ｅ−ＲＤＦ培地を用いて沈殿を再び浮遊させ、９６ウエルマイクロプレートに１００μｌずつ分注した。３日毎に同一培地を５０μｌ追加し、細胞の増殖を確認した。
【００２０】
（抗体産生ハイブリドーマの検索）
ハイブリドーマが増殖したウエルの液を採取し、ＰＦ−ＨＳＡ抱合体を結合させた別のウエルに添加し、直接ＥＬＩＳＡによりＰＦに対するＭＡｂ産生ハイブリドーマを検索した。即ち、９６ウエルマイクロプレートにＰＦ−ＨＳＡ抱合体０．１μｇ／１００μｌ／ウエルを分注し、３７℃で１時間インキュベートしてウエルに吸着させた。このウエルに培養上清を１００μｌずつ分注し抗原抗体反応を行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝食塩水（Ｔ−ＰＢＳ）で３回洗浄した。パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体１０００倍希釈液をウエルあたり１００μｌ添加し、１時間後にＴＰＢＳで洗浄した。０．００３％過酸化水素、ＡＢＴＳ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。２０分後プレートリーダーを用いて４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。発色したウエルの細胞を採取した。
【００２１】
（抗ＰＦ ＭＡｂ産生ハイブリドーマのクローニング）
抗体産生ハイブリドーマを限界希釈してウエルに分注した。抗体産生能を持ち、かつ増殖したハイブリドーマを同様に３回クローニングしてクローンを得た。
【００２２】
（抗ＰＥ ＭＡｂの調整）
上記の抗体産生ハイブリドーマを無血清培地（１０μｇ／ｍｌインスリン、３５μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭセレニューム添加ｅＲＤＦ培地）で３７℃、炭酸ガス培養器で培養した。上清をプロテインＧＦＦカラムを用いて精製した。即ち、上清をトリス緩衝液でｐＨ７に調整し、カラムに付す。カラムを１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄後、吸着している抗体を１００ｍＭクエン酸緩衝液で溶出する。得られた抗体溶液は水に対して４回透析し、最後に凍結乾燥して精製抗体をえた。
【００２３】
（競合的ＥＬＩＳＡによる定量）
ＰＦ−ＨＳＡ抱合体溶液（１μｇ／ｍｌ）を５０μずつウエルに添加し１時間反応し吸着させる。比特異的結合を除去するために５％スキンミルク添加ＰＢＳ溶液３００μｌを加え１時間反応してブロッキングする。５０μｌの各種濃度の試料溶液を加え、さらに抗ＰＥＭＡｂ溶液（１μｇ／ｍｌ）５０μｌを添加して１時間インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄し、１０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウス抗体１００μｌを加え１時間反応した。１時間後にＴＰＢＳで洗浄した。０．００３％過酸化水素、ＡＢＴＳ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。１５分後に発色を４０５ｎｍで測定。各濃度のＰＥの吸光度から検量線を作成した（図２）。
【００２４】
（交差反応性の調査）
ＰＦおよびモノテルペン配糖体の芍薬固有の配糖体類、およびその他のテルペン類を測定した。表１に見られる通り、芍薬の薬理活性を代表している主活性成分であるＰＦとアルビフロリン（ＡＬ）に特異的に親和性を持つ抗体であることが明らかとなった。また，ベンジルペオニフロリンに約３０％の交差反応性が認められたが，その他の成分には殆ど交差反応性を示さなかった（図３の構造式参照）。
【００２５】
（各種芍薬のＰＦおよびアルビフロリン（ＡＬ）含有量）
各種芍薬の乾燥粉末５ｍｇをメタノール０．５ｍｌで５回抽出する。抽出液を合わせて遠心にかける。上清を１０％メタノール溶液で適切な濃度に希釈して実施例に準じて定量する。結果を表２に示す。ＰＦおよびＡＬ含有量を通常の方法によりＨＰＬＣで分析した。それらの分析値と抗体を用いて分析した結果（ＥＬＩＳＡ）と比較したところ両者は非常に良好な一致をみた。このことから今回開発した芍薬の活性本体であるＰＦおよびＡＬ含量の分析法は信頼性が高く，また，高感度かつ再現性が良好なことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例の抗原のハプテン数を調査したマルジマススペクトログラフ。
【図２】実施例の抗体Ｃ３１Ｂ９の検量線を示す片対数グラフ。
【図３】ペオニフロリンと関連化合物の構造式。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a hybridoma that produces a MAb against PE, which is a main active ingredient of peony.
[0002]
[Prior art]
Cell fusion technology has evolved rapidly since the report of Kohler and Milstein (Nature, pp. 495-497, 1975). Hybrid cells obtained by fusing mammalian spleen cells and myeloma cells as cancer cells are referred to as hybridomas. Hybridomas have the ability to produce antibodies produced by the spleen cells used, and thus have been used to produce antibodies against high molecular compounds such as many proteins and peptides.
[0003]
On the other hand, the present applicant creates a hybridoma that produces a MAb against the glycoside of Shakuyaku, which cannot normally serve as an antigen. PE is a major glycoside of peony with useful pharmacological activity.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The content of PF in the peony is low and its detection is not easy. In addition, a great deal of labor is required for pretreatment and the like in order to closely examine the content of the herbal medicine. Therefore, a reproducible and highly sensitive assay system that does not require pretreatment is required. There is nothing other than MAb that can cope with this.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, obtained a hybridoma that produces MAb against PF by cell fusion, and produced a large amount of anti-PF antibody by culturing the hybridoma. succeeded in. By using this antibody, an assay system with high sensitivity, good reproducibility, and requiring no pretreatment has been completed.
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS A hybridoma producing an anti-PE MAb is prepared as follows. That is, (1) antibody-producing spleen cells of an animal immunized with a PF-BSA complex as an antigen are prepared. (2) Myeloma cells are cultured and grown and adjusted. (3) The above two cells are fused using polyethylene glycol as a medium. (4) The obtained hybridoma is selected on a HAT medium. (5) Select anti-PFMAb-producing hybridomas. (6) Cloning the selected hybridoma. These steps will be described in detail.
[0007]
(Preparation of antibody-producing cells)
Animals are immunized with the PF-BSA conjugate. As an immunization method, a method using Freund's complete adjuvant in combination is used. Examples of animals include mice, rats, rabbits, guinea pigs, sheep, and the like. Cells isolated from spleen, lymph nodes, peripheral blood, etc. are used as antibody-producing cells.
[0008]
(Preparation of myeloma cells)
The myeloma cells used for cell fusion are not particularly limited, and various mammalian cell lines can be used, but it is preferable to use the same cell line as the animal used for preparing the antibody-producing cells. Considering that after cell fusion, unfused myeloma cells cannot survive in the selection medium and only hybridomas can proliferate after cell fusion, so that unfused cells and fused cells are selected. Those having a particular drug resistance are preferred. For example, 8-azaguanine-resistant cells are preferably used because they have a property that they cannot grow in a HAT medium. Specifically, a mouse myeloma cell line, PAI, P3-X63-Ag8, P3-X63-Ag8-UI, P3-NSI / 1-Ag4-1, X63-Ag8-6.5.3. , SP2 / 0-Ag14, FO, S194 / 5XXO, BU. 1, MPC11-45.6. , TG. 1.7 or the like is used.
[0009]
(Fused cells)
Cell fusion is usually performed by mixing myeloma cells and antibody-producing cells in an e-RDF medium such as a MEM medium, an RMI1640 medium, or an IMDM medium (mixing ratio is usually 1: 4-1: 10). As the fusion promoter, polyethylene glycol (PEG) having an average molecular weight of 1,000 to 6,000 can be used. The working concentration of PEG is usually 30-50%.
[0010]
(Selective growth of hybridoma)
The cells after the fusion are appropriately diluted with e-RDF medium containing 10% FCS and centrifuged. The sediment is suspended in a selection medium (for example, HAT medium), inoculated into a 96-well microplate, and then cultured in a 5% carbon dioxide gas culture apparatus. Cells growing on the selection medium are hybridomas.
[0011]
(Search for antibody-producing hybridomas)
The search for antibody-producing hybridomas may be performed according to a conventional method, and is not particularly limited. For example, a culture solution in which a hybridoma has grown can be collected, reacted with PF-HSA, and searched for by reaction with a secondary antibody labeled with an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like.
[0012]
(Cloning)
The cells in the culture wells confirmed to contain the antibody-producing hybridoma are cloned by a limiting dilution method or the like to obtain a MAb-producing hybridoma. By the above operation, anti-PF MAb-producing hybridoma C31B9 was obtained. This hybridoma is a novel cell that produces a specific MAb for PF.
[0013]
(Adjustment of anti-PF MAb)
By culturing the hybridoma obtained above in a suitable medium, the MAb of the present invention can be obtained from the culture supernatant. As a method for mass production, an animal of the same species as the myeloma cell-derived animal is intraperitoneally administered with a mineral oil such as pristane and then inoculated with a hybridoma. After inoculation, ascites is collected, and an anti-PF MAb is obtained by a usual antibody separation operation. Further, the cells are cultured in a serum-free medium, and an anti-PF MAb is obtained by a usual method.
[0014]
(Characterization of anti-PF MAb)
The subclass, light chain, etc. of the purified anti-PF-MAb were determined by a conventional method.
[0015]
(The invention's effect)
Since this antibody has extremely high specificity, it can be used in ordinary ELISA to achieve high reproducibility, high sensitivity, and quantification requiring no pretreatment. As shown in the following examples, the PF content of various peony can be easily determined.
[0016]
【Example】
(Production of anti-PE MAb producing hybridoma)
(Preparation of antigen)
A solution of 5 mg of PF dissolved in 4 ml of methanol was added dropwise to a solution of 5 mg of sodium periodate dissolved in 0.6 ml of water, and reacted at room temperature for 1 hour. BSA-added carbonate buffer (50 mM, pH 9.6, 1 ml) was added to the above reaction solution for reaction. After the reaction, the solution was dialyzed against water at 4 ° C., and lyophilized to obtain PF-BSA (4.8 mg). In addition, PE-HSA used in ELISA was produced in the same manner.
[0017]
(Examination of hapten number in antigen)
Take a trace amount of the obtained PF-BSA conjugate, add excess sinapinic acid and mix. A small amount of the mixture is placed in the wells of a cassette and measured on Maldeit Fuma (FIG. 1).
[0018]
(Preparation of immune splenocytes)
50 μg of the PF-BSA conjugate was emulsified in Freund's complete-adjuvant and administered intraperitoneally to BALB / C mice. Thereafter, 50 μg of the PF-BSA conjugate adjuvant solution was similarly administered twice at two-week intervals, and finally 100 μg of the PE-BSA conjugate alone was administered to complete the immunization. Three days later, the mouse was sacrificed under anesthesia, and the spleen was removed. After shredding the spleen, the mixture was filtered through a 100-mesh nylon net to obtain isolated spleen cells.
[0019]
(Adjustment of hybridoma)
A hypotonic solution (155 mM ammonium chloride) is added to the isolated immunized splenocytes to lyse the erythrocytes, and the cells are washed three times with e-RDF medium. Mouse myeloma cells were also washed three times with e-RDF medium. The numbers of both cells are counted, and splenocytes and myeloma cells are centrifuged at a ratio of 10: 1. The supernatant was discarded, the precipitated cells were decomposed and loosened, and 1.0 ml of a 50% solution of polyethylene glycol (PEG) 4,000 diluted with a medium was added dropwise to perform fusion. After leaving still at 37 ° C. for 30 seconds, 5 ml of e-RDF medium was added over 5 minutes. Centrifuged at 1,000 rpm for 10 minutes. The precipitate was washed with IMDM supplemented with 10% FCS, centrifuged, and the supernatant was discarded. The precipitate was resuspended using 10% FCS-supplemented e-RDF medium supplemented with 10-2 M hypoxanthine, 4 × 10 −7 M aminopterin, and 1.5 × 10 −5 M thymidine, and 100 μl aliquots were placed on a 96-well microplate. Noted. Every three days, the same medium was added in an amount of 50 μl, and cell growth was confirmed.
[0020]
(Search for antibody-producing hybridomas)
The liquid of the well in which the hybridoma had grown was collected, added to another well to which the PF-HSA conjugate was bound, and the MAb producing hybridoma to PF was searched by direct ELISA. That is, 0.1 μg / 100 μl / well of the PF-HSA conjugate was dispensed into a 96-well microplate and incubated at 37 ° C. for 1 hour to be adsorbed to the well. 100 μl of the culture supernatant was dispensed into each well to carry out an antigen-antibody reaction. The plate was washed three times with a phosphate buffered saline solution containing 0.05% Tween 20 (T-PBS). A peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG antibody 1000-fold diluted solution was added in an amount of 100 μl per well, and one hour later, the well was washed with TPBS. Citrate buffer containing 0.003% hydrogen peroxide and 0.3 mg / ml ABTS was added for color development. After 20 minutes, the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm using a plate reader. The cells of the colored wells were collected.
[0021]
(Cloning of anti-PF MAb producing hybridoma)
The antibody-producing hybridoma was subjected to limiting dilution and dispensed into wells. Hybridomas having antibody-producing ability and proliferating were similarly cloned three times to obtain clones.
[0022]
(Adjustment of anti-PE MAb)
The above antibody-producing hybridoma was cultured in a serum-free medium (eRDF medium supplemented with 10 μg / ml insulin, 35 μg / ml transferrin, 20 μM ethanolamine, and 25 nM serum) at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator. The supernatant was purified using a protein GFF column. That is, the supernatant is adjusted to pH 7 with Tris buffer and applied to the column. After washing the column with 10 mM phosphate buffer, the adsorbed antibody is eluted with 100 mM citrate buffer. The obtained antibody solution was dialyzed four times against water and finally freeze-dried to obtain a purified antibody.
[0023]
(Quantification by competitive ELISA)
A PF-HSA conjugate solution (1 μg / ml) is added to the wells in 50 μl increments, and the mixture is allowed to react and adsorb for 1 hour. To remove specific binding, 300 μl of a PBS solution containing 5% skin milk was added, and the mixture was reacted for 1 hour to perform blocking. 50 μl of sample solutions of various concentrations were added, and 50 μl of an anti-PEMAb solution (1 μg / ml) was further added, followed by incubation for 1 hour. After washing three times with TPBS, 100 μl of a 1000-fold diluted peroxidase-labeled anti-mouse antibody was added and reacted for 1 hour. After 1 hour, the plate was washed with TPBS. Citrate buffer containing 0.003% hydrogen peroxide and 0.3 mg / ml ABTS was added for color development. Color development was measured at 405 nm after 15 minutes. A calibration curve was created from the absorbance of PE at each concentration (FIG. 2).
[0024]
(Survey of cross-reactivity)
Glycosides peculiar to Shakuyaku of PF and monoterpene glycosides, and other terpenes were measured. As shown in Table 1, it was revealed that the antibody has specific affinity for PF and albiflorin (AL), which are the main active ingredients representing the pharmacological activity of Shakuyaku. In addition, benzylpeoniflorin was found to have a cross-reactivity of about 30%, but showed little cross-reactivity to other components (see the structural formula in FIG. 3).
(PF and Albiflorin (AL) content of various peony)
5 mg of dry powder of various peony is extracted five times with 0.5 ml of methanol. Combine the extracts and centrifuge. The supernatant is diluted to an appropriate concentration with a 10% methanol solution and quantified according to the examples. Table 2 shows the results. The PF and AL contents were analyzed by HPLC according to the usual method. When these analytical values were compared with the results of analysis using an antibody (ELISA), both showed very good agreement. From this result, it was revealed that the method for analyzing the PF and AL contents, which are the active substances of the peony, developed this time is highly reliable, and has high sensitivity and good reproducibility.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a mardimas spectrograph in which the number of haptens of the antigen of Example was investigated.
FIG. 2 is a semilogarithmic graph showing a calibration curve of an antibody C31B9 of an example.
FIG. 3 is a structural formula of paeoniflorin and related compounds.
