FI85946C - Foerfarande foer framstaellning av en bispecifik antikropp och bestaemningsfoerfarande varvid denna anvaends. - Google Patents

Description

1 85946

Menetelmä bispesifisen vasta-aineen valmistamiseksi ja määritysmenetelmä jossa sitä käytetään

IgG-vasta-aineiden tiedetään koostuvan kahdesta 5 puolimolekyylistä, joista kumpikin muodostuu kevyestä ketjusta (L-ketjusta) ja raskaasta ketjusta (H-ketjusta). Näiden kahden puoliskon H-ketjuja sitovat toisiinsa disul-fidisillat, jotka voidaan katkaista selektiivisellä pelkistyksellä. Jos tämä tehdään kahdelle erilaiselle IgG- 10 näytteelle, voidaan puolimolekyylit yhdistää hybridivasta-aineiksi. Tämä on tehty intakteille kaniinin globuliineil-le [Nisonoff et ai., Science 134 (1964) 376 - 379]. Myös IgA-vasta-aineet voidaan halkaista samanlaisiksi puolimo-lekyyleiksi.

15 Hybridejä on muodostettu myös käyttämällä IgG-vas- ta-aineiden F(ab' )2-fragmentteja intaktien vasta-aineiden sijasta, ts. molekyylien F(c')-osat, jotka eivät saa aikaan immuunispesifisyyttä, poistetaan ennen hybridisaatiota pilkkomalla sopivalla proteaasilla, kuten pepsiinillä.

20 Tätä menettelyä ovat kuvanneet Nisonoff et ai. [Arch. Bio-chem. Biophys. 89 (1960) 230 - 244] ja Nisonoff ja Rivers [Arch. Biochem. Biophys. 93 (1960) 460 - 462]. Ensin mainitun julkaisun jälkikeskustelussa Nisonoff totesi [Current Contents 44 (2.11.1981) 25] seuraavaa: 25 Tähän asti tätä menettelyä on käytetty rajoitetus ti, pääasiassa solujen pintojen värjäämisessä ferritiinil-lä käyttämällä anti-ferritiini -vasta-aineen ja solun pinta-antigeenin vasta-aineen hybridiä. On myös ajateltu, että hybridivasta-aine voisi toimia keinona farmakologisen 30 aineen viemiseksi spesifisesti kosketukseen halutun kudos-pinnan kanssa.

Tällaisten hybridien käyttöä sytotoksisten lääkkeiden levitykseen on myös ehdotettu [Raso ja Griffin, Fed. Proc. 37 (1978) 1350].

35 Milstein [Proc. R. Soc. Lond. B211 (1981) 393 - 412] ehdottaa mahdollisuutta käyttää "monoklonaalisia vas- 2 85946 ta-aineita toksisten aineiden kantajina kasvainten hoitamiseksi spesifisesti" ja lausuu, että "on mahdollista, että Fab-fragmentit ovat parempia kohdistusaineita kuin intakti vasta-aine".

5 Hybridivasta-aineita on muodostettu myös fuusioi malla kaksi solua, joilla on kyky tuottaa erilaisia vasta-aineita, hybridisoluksi, jolla on kyky tuottaa hybridivasta-aineita. Tällaista menetelmää kuvaavat Milstein ja Cuello [Nature 305 (1983) 537 - 540]. Erilaisia monoklo-10 naalisia vasta-aineita tuottavia hiiren hybridoomasoluja fuusioitiin, ja tuloksena olevat fuusioidut solut tuottivat vasta-aineseoksia, jotka koostuivat kaikista mahdollisista alkuperäisten raskaiden ja kevyiden ketjujen kahden erilaisen yhteenliittymän muodostamista yhdistelmistä. 15 Tämä molekyyliseos sisälsi hybridivastaalneita, jotka koostuivat kummankin alkuperäisen vasta-ainemolekyylin yhdestä puoliskosta ja jotka voitiin osittain puhdistaa ioninvaihtokromatografiällä.

Eräässä toisessa julkaisussa [Raso et ai., Cancer 20 Research 41 (1981) 2073 - 2078) kuvataan kaniinin vasta-aineen F(ab' )2-fragmentteja sisältävän epäpuhtaan tuotteen muodostamista; kaniinin vasta-ainefragmentit halkaistiin pelkistämällä ja yhdistettiin antirisiinin A-ketjun F(ab' )2-fragmentteihin. Näitä kaksoisspesifisiä dimeerejä 25 käytettiin kokeisiin, joissa tutkittiin kohdistettua lääkkeen antamista. Artikkelissa sanotaan: Tähän työhön käytetyt kahta tyyppiä olevat puhdistetut vasta-aineet eristettiin tavanomaisista heteroanti-seerumeista. Siten näiden kahden populaation liittämisestä 30 täytyy olla seurauksena monimutkainen affiniteetti- ja spesifisyysyhdistelmien muodostama joukko. Homogeenisten hybridoomaperäisten vasta-aineiden keksiminen tekee mahdolliseksi hybridivasta-aineen rakenneosapuoliskojen si-toutumisaffiniteettien täydellisen kontrollin, ja tämän 35 yhtenäisyyden pitäisi tehostaa suuresti niiden lopullista tehoa antovälineinä.

3 85946 Tämä keksintö tarjoaa käytettäväksi homogeenisen, identtisistä bispesifisistä vasta-ainedeterminanteista koostuvan tuotteen, jossa kukin bispesifinen determinantti koostuu disulfidisiltojen yhdistämistä kahdesta L-H -puo-5 limolekyylistä, jotka ovat keskenään erilaisia ja spesifisiä eri antigeenideterminanteille.

Keksinnön kohteena on menetelmä bispesifisen mono-klonaalisen IgG-vasta-aineen tai sen fragmentin valmistamiseksi. Keksinnön kohteena on edelleen menetelmä neste-10 mäisessä näytteessä olevan tuntemattoman aineen määrän määrittämiseksi, joka aine saatetaan reagoimaan ainakin ensimmäisen entsyymin kanssa, jolloin muodostuu mitattavissa oleva ioni tai yhdiste, joka muodostunut ioni tai yhdiste toimii mainitun aineen mittana käyttämällä keksin-15 nön mukaisesti valmistettua vasta-ainetta. Keksinnön mukaisille menetelmille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään.

Vasta-aineen tai sen fragmentin valmistusmenetelmälle on edullista, että ennen yhdistämisvaihetta muodos-20 tetaan johdannainen toisesta, identtisten puolimolekyylien muodostamasta parista tioliaktivointiaineen avulla, joka edistää disulfidisiltojen muodostumista tiolilla aktivoitujen puolimolekyylien ja erilaisten puolimolekyylien välille.

25 Keksinnön muissa edullisissa suoritusmuodoissa mo noklonaaliset vasta-aineet ovat IgGl tai, vähemmän edullisesti IgG2A, IgG2B tai IgG3); kukin puolimolekyyli, mikäli se on peräisin IgG-vasta-aineesta, sisältää ainakin F(ab')osan; tioliaktivointiaine estää tiolilla aktivoitu-30 jen puolimolekyylien uudelleenyhdistymisen; toinen tai molemmat monoklonaalisista vasta-ainedeterminanteista koostuu yhden tai useamman disulfidisillan yhdistämistä puolimolekyyleistä, ja vaihe, jossa tällaiset determinantit halkaistaan puolimolekyyleiksi, toteutetaan olosuh-35 teissä, jotka estävät disulfidisiltojen muodostumisen puo- 4 85946 limolekyylien H-ketjujen sisään; ja tioliaktivointiaine on 5,5'-ditiobis(2-nitrobentsoehappo), 2,2'-dipyridiinidi- sulfidi, 4,4-dipyridiinidisulfidi tai sulfiitin ja tetra-tionaatin seos. [Tioliaktivointiaineiden käyttöä F(ab')-5 fragmenttien liittämiseen muihin proteiineihin on kuvattu esimerkiksi julkaisuissa Raso et ai., J. Immunol. 125 (1980) 2610; Raso et ai., Cancer Res. 42 (1982) 457; ja Masuho et ai., B.B.R.C. 90 (1979) 320, jotka julkaisut mainitaan tässä viitteenä]. Disulfidisiltojen muodostumi-10 nen disulfidisiltojen alunperin yhdistämien H-ketjujen alueelle estetään edullisesti tekemällä halkaisureaktio ditiolikompleksointiaineen, kuten arseniitin, esimerkiksi epäorgaanisen arseniitin, kuten natriumarseniitin, tai aryyliarseniitin, esimerkiksi fenyyliarsiinioksidin, tai 15 kadmiumsuolan läsnäollessa tai tekemällä halkaisureaktio olosuhteissa, joissa H-ketjujen konformaatio muuttuu disulfidisiltojen muodostumisen estävällä tavalla, esimerkiksi pH:n 3,8 - 4,5 (edullisimmin 4,2) vallitessa tai poistamalla pelkistyneet kysteiiniryhmät yhtä lukuun otta-20 matta käyttämällä proteolyyttistä entsyymiä, kuten karbok-sipeptidaasi Y:tä.

Kun estetään samanlaisten puolimolekyylien liittyminen uudelleen toisiinsa, voidaan bispesifisten determinanttien puhdistus seoksesta tehdä yksinkertaisesti mole-25 kyylikoon perusteella, esimerkiksi geelisuodatuksella; tämä on mahdollista, koska liuoksessa olevien ainoiden molekyylien, puolimolekyylien ja hybridien koot eroavat toisistaan siten, että toisen koko on kaksinkertainen toiseen nähden. Muita erotusmenetelmiä ovat esimerkiksi io-30 ninvaihto ja isoelektrinen fokusointi.

Kuvio 1 esittää kaavamaisesti bioluminensenssitut-kimuksessa käyttökelpoista järjestelyä.

Kuvio 2 esittää kaavamaisesti kanavointi-immuuni-tutkimusta, jossa käytetään bispesifisiä monoklonaalisia 35 vasta-ainedeterminantteja.

li 5 85946

Kuvio 3 esittää kaavamaisesti fluoresenssienergian-siirtoimmuunitutkimusta, jossa käytetään bispesifisiä mo-noklonaalisia vasta-ainedeterminantteja.

Kuvio 4 on kaavamainen esitys kaniinin IgGj^n raken-5 teestä verrattuna hiiren IgGL:een.

Kuvio 5 esittää kaavamaisesti kilpailevia ketjunsi-säisiä reaktioita hiiren puolimolekyyleissä.

Kuvio 6 esittää kaavamaisesti edullista menetelmää bispesifisten monoklonaalisten vasta-ainedeterminanttien 10 valmistamiseksi.

Kuvio 7 esittää kaavamaisesti luminensenssiener-giansiirtoimmuunitutkimusta, jossa käytetään bispesifisiä monoklonaalisia vasta-ainedeterminanttej a.

Keksinnön mukaisesti valmistetut bispesifiset mono-15 klonaaliset vasta-ainedeterminantit ovat käyttökelpoisia monenlaisiin tarkoituksiin. Nämä sovellutukset perustuvat kaikki näiden determinanttien kykyyn toimia spesifisten kohtien B' kautta hyvin spesifisinä yhteenliittäjinä mille tahansa kahdelle antigeenideterminantille, joilla on kyky 20 stimuloida vasta-ainetuotantoa eläimessä; esimerkiksi te hokkaille proteiineille, polypeptideille, hiilihydraateille, nukleiinihapoille tai hapteneille, jotka ovat joko vapaina tai immobilisoituina pinnoille tai hiukkasille.

Eräs esitettyjen bispesifisten vasta-ainedetermi-25 nanttien käyttötarkoitus on niiden käyttö aineina, jotka sitovat halutun antigeenisen ryhmän haluttuun pintaan, joka sisältää tai jolle on immobilisoituna erilainen anti-geenideterminantti. Esimerkiksi hiukkasille tai kalvoille siten immobilisoituja entsyymejä voidaan käyttää kiinteä-30 faasikatalysaattoreina. Tämän tyyppisen immobilisoinnin etuina muihin nähden ovat se, että voidaan valita vasta-·' · aineita, joilla ei ole haitallista vaikutusta entsyymin aktiivisuuteen, ja se, että voidaan immobilisoida puhtaita entsyymejä epäpuhtaista seoksista. Bispesifisiä vasta-ai-35 nedeterminantteja voidaan käyttää myös hyvin spesifisinä 6 85946 bispesif isinä reagensseina immuuni-tutkimusmenettelyissä, joita käytetään esimerkiksi lääketieteellisten häiriötilojen diagnostisointiin, tai molekyylikoettimina antigeeni-determinanttien sukulaisuuden tutkimiseksi biologisissa 5 systeemeissä.

Bispesifisten vasta-ainedeterminanttien lisäsovel-lutuksena on niiden käyttö elektrodeissa. Tätä keksintöä voidaan käyttää rakenteeltaan minkälaisissa elektrodeissa tahansa, esimerkiksi kiinteäfaasiantureissa, kuten kenttä-10 vaikutustransistoreissa, joita kuvaa Wohltjen [Analyt. Chem. 56 (1984) 87A].

Entsyymielektrodeilla, jotka valmistetaan käyttämällä bispesifisiä vasta-ainedeterminantteja, on useita etuja tavanomaisiin entsyymielektrodeihin nähden. Eräs etu 15 on niiden tarkka itserakentumisominaisuus; haluttu elek trodi järjestely muodostetaan yksinkertaisesti kiinnittämällä asianmukainen hapteeni tai asianmukaiset hapteenit kalvoon (joko elektrodikalvoon tai erilliseen elektrodin kanssa yhteydessä olevaan kalvoon) ja upottamalla haptee-20 nin sisältävä kalvo liuokseen, joka sisältää asianmukaisia bispesifisiä vasta-aineita ja entsyymejä. Tämä rakentamisen helppous merkitsee myös sitä, että elektrodi on helppo ladata uudelleen, kun on tapahtunut elektrodin toimintakyvyn loppuminen pitkän käytön takia.

25 Elektrodien eräänä etuna on myös bispesifisten vas ta-ainedeterminanttien spesifisyyden toimintatapa. Kullakin entsyymillä on joukko antigeenikohtia, joilla on kyky tarttua vasta-aineen spesifiseen kohtaan. Tällaisissa kohdissa tapahtuva sitoutuminen johtaa kuitenkin usein ent-30 syymin inaktivoitumiseen. Bispesifisten monoklonaalisten vasta-ainedeterminenttien ollessa kyseessä tämä ongelma vältetään, koska determinantit valitaan siten, että ne sitoutuvat entsyymiin vain sellaisista kohdista, joissa tapahtuva sitoutuminen ei aiheuta entsyymin deaktivoitu-35 mistä.

Il 7 85946

Lisäetuna on se, että elektrodin rakentaminen tai uudelleen panostaminen voidaan tehdä käyttäen epäpuhtaita entsyymiseoksia, koska bispesifisten vasta-ainedetermi-nanttien ainutlaatuinen spesifisyys takaa oikeiden entsyy-5 mien valitsemisen epäpuhtaasta seoksesta. Joissakin tapauksissa elektrodirakenne voidaan stabiloida miedolla bifunktionaalisella silloitusaineella, esimerkiksi dime-tyylisuberimidaatilla.

Bispesifisten vasta-ainedeterminanttien eräänä so-10 vellutuksena on vielä niiden käyttö itserakentuvien verkkojen, joita käytetään esimerkiksi molekulaarisina mikropiireinä, muodostamiseen.

Edellä mainittuja käyttötarkoituksia kuvataan yksityiskohtaisemmin US-patenttijulkaisussa 4 444 878 15 (Paulus), joka mainitaan tässä viitteenä.

Ryhdymme nyt käsittelemään yksityiskohtaisemmin keksinnön mukaisten bispesifisten vasta-ainedeterminanttien muodostamista ja erityismenetelmää, jota käytetään vasta-aineiden ollessa hiirestä peräisin.

20 Kuvio 4 valaisee rakenne-eroa kaniinin IgGi-vasta- aineiden ja hiiren IgGj-vasta-aineiden (joita useimmat monoklonaaliset vasta-aineet ovat) välillä. Näissä rakenteissa on raskaita ketjuja yhdistävien disulfidisiltojen määrä erilainen. Kaniinin IgG^.n kahta puoliskoa pitää yh-25 dessä yksi sidos, ja F(ab')2:n pelkistykseen F(ab’)-mono-meeriksi samoin kuin monomeerin uudelleenliittymiseen di-meeriksi liittyy vain yhden sidoksen katkeaminen ja muodostuminen uudelleen, mikä on suhteellisen yksinkertainen prosessi. Sitä vastoin hiiren igG^n raskaita ketjuja yh-30 distää 3 disulfidisiltaa, ja niiden katkeaminen ja uudel-leenmuodostuminen voi johtaa kilpaileviin ketjunsisäisiin sivureaktioihin, jotka ovat kuviossa 5 esitettyä tyyppiä ja voivat merkittävästi alentaa halutun tuotteen saantoa. Ketjunsisäinen reaktio tekee puolimolekyylistä kykenemät-35 tömän liittymään erilaiseen puolimolekyyliin. Tämän kek- β 85946 sinnön mukainen menetelmä tekee mahdolliseksi puhtaiden bispesifisten monoklonaalisten vasta-ainedeterminanttien tuotannon suurella saannolla hiiren monoklonaalisista vasta-aineista samoin kuin muista nisäkäslajeista peräisin 5 olevista vasta-aineista.

Menetelmä sisältää seuraavat peräkkäiset vaiheet. Tuotetaan tavanomaisia menetelmiä käyttäen kahta erilaista monoklonaalista IgGj-vasta-ainetta, joista kummallakin on toinen halutuista spesifisyyksistä. Kukin vasta-aine käsi-10 tellään sitten sopivalla proteaasilla, kuten pepsiinillä, jolloin vasta-ainemolekyylin F(c')-osa irtoaa ja syntyy F(ab' )2-fragmentti. Sitten kukin aine saatetaan olosuhteisiin, joissa F(ab')-puolimolekyylejä yhdistävät disulfidi-sillat, mutta eivät mitkään muut molekyylin disulfidisil-15 lat, katkeavat. Samanaikaisesti nämä olosuhteet ovat sel laiset, että estetään raskaiden ketjujen sisäisten disul-fidien muodostuminen, esimerkiksi ditiolikompleksointi-aineen (esimerkiksi natriumarseniitin (kuten kuviossa 6), aromaattisen arseniitin, kuten fenyyliarsiinioksidin tai 20 CdCl2:n) lisäämisen tai raskaan ketjun konformaation muuttamisen (esimerkiksi alentamalla pH arvoon 4,2) tai pro-teolyyttisellä entsyymillä tehtävän kaikkien paitsi yhden pelkistyneiden kysteiiniryhmien (esimerkiksi karboksipep-tidaasi Y:llä) poistamisen ansiosta.

25 Toinen aineista käsitellään sitten tioliaktivointi- aineella kaikkien vapaiden tiolien kompleksoimiseksi, jolloin muodostuu johdos, jolla on kyky reagoida nopeasti muiden vapaiden tiolien kanssa disulfideiksi, kuten näkyy kuviossa 6 tapahtumaketjun 1 lopussa. Tähän tarkoitukseen 30 soveltuvia aineita ovat aromaattiset disulfidit, kuten DTNB (Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82 (1959) 70) (kuvio 6), 2,2'-dipyridiinidisulfidi, 4,4'-dipyridiinidisul-fidi [Grasetti et ai., Arch. Biochem. Biophys. 119 (1967) 41] ja sulfiitti/tetrationaatti [Masuho et ai., B.B.R.C. 35 98 (1979) 320]. Tämä aktivoitu aine yhdistetään sitten li 9 85946 (kuvion 6 tapahtumaketju 3) toiseen ditiolikompleksoituun aineeseen, joka sisältää käytettävissä olevia tioleja, sellaisissa olosuhteissa, joissa ainakin jotkut puolimole-kyylit liittyvät kemiallisesti bispesifisiksi vasta-aine-5 determinanteiksi mutta eivät monospesifiseksi F(ab')2:ksi.

Vaihtoehtoisesti voidaan molemmat aineet käsitellä tioliaktivointiaineella, jolloin muodostuu aktivoituja tiolijohdoksia. (Tämä on usein kätevää aktivoitujen johdosten suhteellisen hyvän stabiilisuuden ansiosta). Toinen 10 aineista käsitellään sitten ylimäärällä pienimolekyylistä tiolia vapaiden tiolien regeneroimiseksi F(ab')-monomee-rille, minkä jälkeen seuraa erottaminen ylimäärästä pienimolekyylisiä tioleja. Molekyylisisäinen disulfidisiltojen muodostuminen voidaan estää lisäämällä ditiolikompleksoin-15 tiainetta (kuvio 6 tapahtumasarja 2) tai muuttamalla raskaan ketjun konformaatiota. Joissakin tapauksissa voi olla kuitenkin edullista sallia molekyylisisäisten disulfidi-siltojen muodostuminen. Tämä aine yhdistetään sitten (kuvion 6 tapahtumasarja 3) tioliaktivoidussa muodossa ole-20 vaan toiseen F(ab')-aineeseen olosuhteissa, joissa ainakin osa puolimolekyyleistä liittyy kemiallisesti bispesifisek-si F(ab' )2:ksi.

Koska näissä olosuhteissa tuotettu F(ab')2-fraktio koostuu yksinomaan halutuista bispesif isistä vasta-ainede-25 terminanteista, edellyttäen, että lähtöaineina on käytetty asianmukaisesti puhdistettuja monoklonaalisia vasta-aineita, voidaan homogeenisia bispesifisiä vasta-ainedetermi-nantteja saada yksinkertaisesti poistamalla monomeerinen F(ab*)fraktio halutusta F(ab')2:sta molekyylikoon perus-30 teella käyttäen jotakin kätevää menettelyä, kuten geeli-suodatusta.

Seuraavaa menettelyä käytetään valmistettaessa identtisistä bispesifisistä vasta-ainedeterminanteista koostuva homogeeninen tuote, jossa kussakin bispesifisessä 35 determinantissa on kohta, joka on spesifinen avidiinipro- ίο 8 5946 teiinin eräälle ainutkertaiselle antigeenikohdalle, ja kohta, joka on spesifinen β-galaktosidaasientsyymin eräälle ainutkertaiselle antigeenikohdalle. Tämä menettely seuraa yleisesti kuviossa 6 esitettyjä vaiheita.

5 Ensimmäinen vaihe on monoklonaalisten vasta-ainei den valmistaminen näille kahdelle proteiinille, avidiinll-le ja β-galaktosidaasille. Tämä tehdään immunisoimalla yksi ryhmä BALB/C-hiiriä kutakin entsyymiä vastaan käyttämällä tavanomaisia immunisointimenettelyjä.

10 Immunisoinnin jälkeen preparoidaan eläinten perna- solut ja fuusioidaan ne MOPC-21 -myeloomasolujen johdoksiin (esimerkiksi NS1 tai SP2/0-Agl4) käyttämällä Galfren et ai. [Methods in Enzymology 73 (1981) 3 - 46] kuvaamaa menettelyä. Hybridisolut valikoidaan hypoksantiini-amin-15 opteriini-tymidiinialustassa, kloonataan ja niistä tutkitaan haluttujen entsyymien vastaisten vasta-aineiden tuotanto Galfren et ai. [ibid.] kuvaamalla menetelmällä. Kloonit, joiden havaitaan tuottavan halutun entsyymin vastaisia vasta-aineita, tutkitaan sitten, jotta saataisiin 20 valituksi klooni, joka tuottaa IgG1-ryhmän vasta-ainetta, jolla on suuri affiniteetti entsyymin suhteen ja joka ei aiheuta entsyymin inaktivoitumista. Mielenkiinnon kohteena olevat kloonit säilytetään nestetypessä käyttöön asti. Vasta-ainetta valmistetaan tavanomaisella menetelmällä, 25 jossa kloonattuja soluja lisätään vesivatsakasvaimina pristaanilla esikäsiteltyjen hiirien vatsaontelossa.

Halutut avidiinin ja β-galaktosidaasin vastaiset IgGj-vasta-aineet puhdistetaan sitten vesivatsanesteestä suurin piirtein Parhamin et ai. [Journal of Immunological 30 Methods 53 (1982) 133 - 173] kuvaamalla tavalla, käyttämällä menettelyä, joka sisältää ammoniumsulfaattisaostuk-sen, geelisuodatuksen ja DEAE-selluloosakromatografian, jossa käytetään lineaarista suolagradienttia. Monoklonaaliset vasta-aineet pilkotaan F(ab' )2-fragmenteiksi pepsii-35 nillä Lamoyin ja Nisonoffin [Journal of Immunological I! il 85946

Methods 56 (1983) 235 - 243] kuvaamalla tavalla inkuboi-malla 18 tuntia 25 °C:ssa liuoksessa, joka sisältää 2 pai-no-% pepsiiniä 0,1 M natriumasetaatissa, pH 4,2. F(ab')2-fragmentit puhdistetaan sitten suuren erotuskyvyn neste-5 kromatografialla TSK 3000 SW-pylväässä eluenttina 0,1 M natriumfosfaatti, pH 6,8, Parhamin et ai. [ibid.] kuvaamalla tavalla.

F(ab' )2-fraktiot muutetaan sitten täydellisesti Fab'-monomeeriksi pelkistämällä liuoksella, joka sisältää 10 1 mmol/1 2-merkaptoetyyliamiinia, 1 mmol/1 EDTA:a, 10 mmol/1 natriumarseniittia ja 0,1 mol/1 natriumfosfaattia, pH 6,8, 18 tuntia 25 °C:ssa. Seokseen lisätään sitten kiinteää DTNBrtä loppupitoisuudeksi 20 mmol/1. Kun seosta on pidetty 2-3 tuntia 25 °C:ssa, poistetaan DTNB-ylimäärä ja 15 pienimolekyyliset tuotteet tekemällä keskipakogeelisuoda-tus Sephadex® G-25:llä, joka on tasapainoitettu 0,1 M nat-riumfosfaatilla, pH 6,8, joka sisältää 1 mmol/1 EDTA:a. Tuloksena olevat Fab’-monomeerien tionitrobentsoaatit ovat suhteellisen stabiileja, ja niitä voidaan säilyttää useita 20 päiviä ilman, että tapahtuu merkittävää hajoamista.

Toinen Fab'-monomeerin tionitrobentsoaattijohdoksista (anti-avidiini -vasta-aineesta saatu) muutetaan sitten takaisin vapaaksi tiolimuodoksi (kompleksoitu ditio-lilla) inkuboimalla 30 min 25 °C:ssa liuoksessa, joka si-25 sältää 10 mmol/1 merkaptoetyyliamiinia, 1 mmol/1 EDTA:a ja 0,1 mol/1 natriumfosfaattia, pH 6,8. Merkaptoetyyliamiini-ylimäärä ja pienimolekyyliset reaktiotuotteet poistetaan sitten tekemällä keskipakogeelisuodatus Sephadex® G-25:llä, joka on tasapainoitettu 0,1 M natriumfosfaatil-30 la, pH 6,8, joka sisältää 1 mmol/1 EDTA:a.

Tuloksena oleva anti-avidiini-F(ab')-tioli saatetaan sitten heti kosketukseen yhtä suuren moolimäärän kanssa anti-p-galaktosidaasi-Fab':n tionitrobentsoaatti-johdosta proteiinipitoisuuden ollessa vähintään 0,5 mg/ml 35 3-20 tunnin ajaksi 25 °C:ssa bispesifisen F(ab')2:n muodos- i2 8 59 46 tumisen mahdollistamiseksi. Seokseen lisätään sitten kiinteää DTNB:tä loppupitoisuudeksi 5 mmol/1, ja annetaan seoksen seistä 3 tuntia 25 °C:ssa mahdollisen ei-kovalent-tisen dimeerisen materiaalin hajoamisen edistämiseksi.

5 Avidiinin ja β-galaktosidaasin vastainen homogeeninen bi-spesifinen vasta-ainedeterminantti valmistetaan sitten erottamalla F(ab' )2-fraktio jäljelle jääneistä Fab'monomee-reista HPLC:llä TSK 3000 SW:llä käyttäen 0,1 M natriumfos-faattia, pH 6,8, joka menettely ei vahingoita F(ab')2:a 10 eikä vaadi sen sitomista muuhun aineeseen, jolloin minimoituu aktiivisuutta heikentävien konformaatiomuutosten riski. Halutun bispesifisen vasta-ainedeterminantin muodostuminen voidaan helposti osoittaa käyttämällä hyväksi sen kykyä saada aikaan avidiinista riippuvainen β-galakto-15 sidaasin sitoutuminen biotiinilla substituoidusta selluloosasta valmistettuihin kiekkoihin.

Bispesifinen vasta-ainedeterminantti voidaan liittää biotiinisubstituoidusta selluloosasta valmistettuun kalvoon tutkittaessa yhdistettä, esimerkiksi laktoosia, 20 jonka mittauksessa β-galaktosidaasi voi olla apuna (kuten jäljempänä selitetään tarkemmin).

Anti^-galaktosidaasi voidaan immobilisoida biotii-nisubstituoidulle kalvolle saattamalla yksinkertaisesti kalvo (joka sisältää biotiinin sitoutunutta avidiinia) 25 kosketukseen bispesifisen determinantin kanssa, jossa on anti-avidiinipuolisko ja anti^-galaktosidaasipuolisko, sekä β-galaktosidaasin kanssa. Samalla tavalla glukoosiok-sidaasi voidaan immobilisoida kalvoon.

Käyttämällä edellä kuvattua menettelyä voidaan val-30 mistaa kaksi bispesifistä molekyyliä, joista o-ensimmäinen spesifinen glukoosioksidaasientsyymin sisältämän ainutkertaisen antigeenisen kohdan suhteen ja β-galaktosidaasin antigeenisen kohdan suhteen, ja toinen on spesifinen glu-koosioksidaasin eri antigeenikohdan ja tyypin I kollagee-35 nin erään antigeenikohdan suhteen. Näitä voidaan käyttää i3 85946 muodostettaessa elektrodi laktoosin yleistä mittausta varten, kuten Paulus [ibid.] kuvaa.

Seuraavassa kuvataan koetyyppiesimerkkiä, jossa mitataan ainetta, jonka määrityksessä voidaan käyttää ko-5 lorimetriaa, reflektometriaa, luminensenssin mittausta tai fluorometriaa tutkittavan aineen tuntemattoman määrän mittaamiseen. Yleisesti ilmaistuna kokeessa mitataan nestemäisessä näytteessä olevan tuntemattoman aineen määrää, johon aineeseen vaikuttaa ainakin ensimmäinen entsyymi 10 siten, että vapautuu mitattavissa oleva ioni tai yhdiste, jota voidaan käyttää tuntemattoman aineen mittana. Kokeessa sidotaan ensimmäinen entsyymi kiinteään alustaan (esimerkiksi helmille tai kalvokantajaan) tai toimintajärjestyksessä aiemmin vaikuttavaan toiseen entsyymiin käyttä-15 mällä apuna esitettyä bispesifistä vasta-ainedeterminant-tia, joka on spesifinen ensimmäisen entsyymin ja kantajan tai toisen entsyymin suhteen. Tällä tavalla voidaan liittää toisiinsa miten monta reaktiosarjaan liittyvää entsyymiä tahansa, ja toimintajärjestyksessä viimeinen entsyymi 20 sidotaan yleensä kantajaan. Näyte saatetaan kosketukseen kantajalle immobolisoidun entsyymin tai entsyymien kanssa, ja mitataan mitattavissa oleva ioni tai yhdiste. Tuntemattomiin aineisiin, joita voidaan mitata, kuuluu esimerkiksi verensokeri.

25 Peräkkäin vaikuttavat entsyymit voidaan vaihtoeh toisesti liittää toisiinsa tuntemattoman aineen avulla, joka on määrä mitata käyttämällä asianmukaisia bispesifi-siä vasta-aineita. Tämä laajentaa mitattavissa olevien aineiden alueen biomolekyyleihin, kuten hormoneihin (esimer-30 kiksi ihmisen sikiön suonikalvon gonadotropiini, jota mitataan raskaustesteissä, ja insuliini).

Kuvio 1 valaisee järjestelyä, jossa itseasettuvia entsyymejä yhdistävät bispesifiset vasta-ainedeterminantit (nuolenkärkikuviot, jotka yhdistävät renkailla merkittyjä 35 entsyymejä). Järjestyksessä viimeinen entsyymi (lusiferaa- i4 85946 si) voidaan immobilisoida käyttämällä esimerkiksi avidii-nia ja biotiinisubstituoitua kalvoa (ei kuviossa). Lusi-feraasi on kuviossa näkyvällä tavalla pelkistyessään bio-luminesoiva (esitettyä reaktioketjua kuvaavat tarkemmin 5 Wienhausen ja DeLuca [Anal. Biochem. 127 (1982) 380] ja Hastings et ai., [US-patenttijulkaisu 4 278 761], jotka julkaisut mainitaan tässä viitteenä].

Kuvio 2 valaisee "kanavointi"-immuunitutkimusta, jossa käytetään kahta bispesifistä vasta-ainedeterminant-10 tia. (Kuvatussa kokeessa noudatetaan joitakin Litmanin et ai., [Anal. Biochem. 106 (1980) 223] kuvaaman kanavointi-immuuni tutkimuksen periaatteita). Ensimmäinen bispesifinen determinantti on spesifinen ensimmäiselle entsyymille ja mitattavan antigeenin, esimerkiksi ihmisen sikiön suoni-15 kalvon gonadotropiinin, ensimmäiselle antigeenikohdalle. Toinen bispesifinen determinantti on spesifinen toiselle entsyymille ja mitattavan antigeenin toiselle antigeeniselle kohdalle. Ensimmäisellä entsyymillä on kyky vaikuttaa ensimmäiseen substraattiin sillä tavalla, että syntyy 20 toinen substraatti, johon voidaan antaa vaikuttaa toisen entsyymin, jolloin vapautuu mitattavissa oleva yhdiste tai ioni. Koe tehdään saattamalla nestemäinen seos, jonka epäillään sisältävän mitattavaa molekyyliä, kosketukseen käytettävien kahden bispesifisen determinantin ja käytet-25 tävien kahden entsyymin kanssa ensimmäisen substraatin läsnäollessa. Jos on läsnä tuntematonta ainetta, sitoutuvat nämä kaksi determinanttia siihen, ja determinantteihin sitoutuneet kaksi entsyymiä joutuvat hyvin lähelle toisiaan, niin että tapahtuvien kahden reaktion teho kasvaa 30 useita kertalukuja. Kuvatussa tapauksessa ensimmäinen entsyymi on glukoosioksidaasi, toinen entsyymi on peroksidaa-si, ensimmäinen substraatti on glukoosi, ja toinen substraatti on peroksidi, joka hapettaa leukovärlaineen, jolloin muodostuu mitattavissa oleva väriaine. Järjestyksessä • 35 viimeinen entsyymi voidaan immobilisoida. Kuviossa 2 esi-

II

is 85946 tettyyn kokeeseen sisältyy optinen piirre signaali:kohina-suhteen parantamiseksi, kilpailevan entsyymin (tässä tapauksessa katalaasin) käyttö tarpeeksi suurena määränä peroksidaasin vaikutuksen peittämiseksi entsyymiin liit-5 tyvän tuntemattoman aineen poissaollessa.

Kuvio 3 valaisee fluoresenssienergiansiirtoimmuuni-tutkimusta, joka on analoginen kuvion 2 kokeelle; erona on se, että energiansiirtokokeessa vaikutetaan orgaanisten substraattien sijasta valoon mitattavissa olevan tuloksen 10 tuottamiseksi. Kokeessa käytetään kahta fluoresoivaa proteiinia; kuvatussa kokeessa nämä ovat fykoerytriini ("Phy") ja allofykosyaniini ("Ali"), joita molempia tuottavat siniviherlevät ja joita kuvaavat Glazer ja Stryer [Biophys. J. 43 (1983) 323], joka julkaisu tässä mainitaan 15 viitteenä, käyttökelpoisiksi immuunitutkimuksiin. Kuten kuviossa 3 ilmenee, toinen bispesifinen monoklonaalinen vasta-ainedeterminantti on spesifinen tutkittavan antigeenin (esimerkiksi ihmisen sikiön suonikalvon gonadotropii-nin) ensimmäiselle kohdalle ja Phy:lie, ja toinen bispe-20 sifinen monoklonaalinen vasta-ainedeterminantti on spesi finen kyseessä olevan antigeenin toiselle kohdalle ja All:lle. Antigeenin läsnäolo saattaa Phy:n ja All:n läheisesti toisiinsa liittyneiksi, mikä kasvattaa suuresti energiansiirtotehoa. Signaali syntyy, koska Phy eksitoituu 25 aallonpituudella 500 nm ja emittoi aallonpituudella 580 nm, kun taas Ali läpäisee aallonpituuden 500 nm, mutta eksitoituu aallonpituudella 580 nm ja emittoi aallonpituudella 660 nm. Aallonpituudella 660 nm esiintyvä signaali syntyy siten vain valon kulkiessa peräkkäin molempien pro-30 teiinien läpi, jonka prosessin teho riippuu proteiinien läheisyydestä toistensa suhteen. Edellä kuvatun kaltaisissa kokeissa toinen tai molemmat fluoresoivista proteiineista voidaan immobilisoida kantajalle joko tavanomaisin keinoin tai esitettyjen bispesifisten determinanttien 35 kautta.

i6 85946 Läheistä tyyppiä olevassa immuunikokeessa, jota valaistaan kuviossa 7, tapahtuu luminesenssienergian siirto luminesoivan molekyylin ja fluoresoivan aineen välillä Patelin et ai. [Analytical Biochemistry 129 (1983) 162 -5 169] kuvaamalla tavalla. Kuvion 7 tapauksessa käytetään luminesoivaa proteiinia, ekvoriinia, fykoerytriinin yhteydessä. Antigeenin läsnäolo liittää ekvoriinin ja fykoerytriinin läheisesti toisiinsa, mikä kasvattaa suuresti ener-giansiirtotehoa. Ca**:n lisääminen saa aikaan ekvoriinin 10 luminesenssin aallonpituudella 475 nm, joka eksitoi fykoerytriinin ja saa sen fluoresoimaan aallonpituudella 580 nm. Aallonpituudella 580 nm esiintyvä signaali syntyy siten vain fykoerytriinin aikaansaaman ekvoriiniluminesens-siaallonpituuden modulaation tapahtuessa, jonka prosessin 15 teho riippuu proteiinin läheisyydestä toisiinsa nähden.

Muut suoritusmuodot ovat mahdollisia. Esimerkiksi, vaikka IgGi-vasta-aineet ovat edullisia, voidaan keksinnön yhteydessä käyttää myös lgG2- vasta-aineita. Myös kokonaista puolimolekyyliä, pikemmin kuin pelkkää F(c')-osaa, voi-20 daan käyttää. Saantoa voidaan hieman parantaa käyttämällä ditiolikompleksointiaineena natriumarseniitin sijasta 0,25 mM fenyyliarsiinioksidia.

ii

Claims (14)

1. Menetelmä bispesifisen monoklonaalisen IgG-vas-ta-aineen tai sen fragmentin valmistamiseksi tunnet- 5. u siitä, että käytetään kahta erilaista monoklonaalista IgG-vas-ta-ainetta tai niiden fragmenttia, joista kumpikin tunnistaa eri antigeenideterminantin ja käsittää kaksi identtistä L-H-puolimolekyyliä, joita yhdistää vähintään yksi di-10 sulfidisilta, katkaistaan disulfidisillat, jotka yhdistävät L-H-puolimolekyylit, jotka tunnistavat eri antigeenidetermi-nantit olosuhteissa, jotka estävät H-ketjujen sisäisten disulfidisiltojen muodostumisen, jolloin kumpikin vasta-15 aine tai vasta-ainefragmentti jakautuu pariksi identtisiä puolimolekyylejä, muodostetaan mainituista eri antigeenideterminant-teja tunnistavista puolimolekyyleistä tioliaktivointiai-neella johdannainen, joka nopeasti reagoi vapaiden tiolien 20 kanssa muodostaen disulfideja ja toinen puolimolekyyli muutetaan tioliaktivoidusta F(ab'):sta vapaaksi tioliksi, tai vaihtoehtoisesti käytetään suoraan vapaita tiolipuoli-molekyylejä, jotka muodostuvat toisen vasta-aineen tai sen fragmentin katkaisureaktiossa, ilman aikaisempaa muutta-25 mistä tioliaktivointireagenssin avulla ja sitä seuraavaa pelkistämistä, sekoitetaan tioliaktivoidut puolimolekyylit vapaiden tiolipuolimolekyylien kanssa, ja erotetaan mahdolliset reagoimattomat puolimolekyy-30 lit bispesifisistä vasta-aineista tai niiden fragmenteista esim. molekyylikoon perusteella.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen monoklonaalisista IgG-vasta-aineista tai 35 vasta-ainefragmenteista käsittää kaksi identtistä L-H- ie 85946 puolimolekyyliä, joita sitoo toisiinsa useampia kuin yksi disulfiäisiltä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että disulfidisiltojen muodostumi- 5 nen H-ketjujen sisäisesti estetään tekemällä halkaiseminen ditiolikompleksointiaineen läsnäollessa.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ditiolikompleksointiaine sisältää arseniitin.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että disulfidisiltojen muodostuminen H-ketjujen sisäisesti estetään tekemällä halkaisu olosuhteissa, joissa H-ketjujen konformaatio muuttuu disulfidisiltojen muodostumisen estämiseksi.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että disulfidisiltojen muodostuminen H-ketjujen sisäisesti estetään poistamalla halkaisun jälkeen kaikki kysteiiniryhmät yhtä lukuunottamatta käyttämällä proteolyyttistä entsyymiä.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tioliaktivointiaine käsittää aromaattisen disulfidin.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aromaattinen disulfidi on 25 5,5'-ditiobis(2-nitrobentsoehappo).

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aromaattinen disulfidi on 2,2'-dipyridiinidisulfidi.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että aromaattinen disulfidi on 4,4-dipyridiinidisulfidi.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että, tioliaktivointiaine käsittää sulfiitin ja tetrationaatin seoksen. i9 85946

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kun molemmista F(ab')-puoli-molekyyleistä on muodostettu johdannaiset tioliaktivoin-tiaineen avulla, toinen puolimolekyyleistä muutetaan käy- 5 tettävissä olevasta tioliaktivoidusta F(ab'):sta vapaaksi tioliksi.

13. Menetelmä nestemäisessä näytteessä olevan tuntemattoman aineen määrän määrittämiseksi, joka aine saatetaan reagoimaan ainakin ensimmäisen entsyymin kanssa, jol- 10 loin muodostuu mitattavissa oleva ioni tai yhdiste, joka muodostunut ioni tai yhdiste toimii mainitun aineen mittana, tunnettu siitä, että mainittu ensimmäinen entsyymi liitetään kiinteään kantajaan tai toiseen, järjestyksessä aiemmin toimivaan 15 entsyymiin käyttämällä patenttivaatimuksen 1 mukaista vasta-ainetta, jonka toinen L-H-puolimolekyyli on spesifinen mainitun ensimmäisen entsyymimolekyylin eräälle antigeeniselle kohdalle ja toinen puolimolekyyli on spesifinen mainitun kantajan tai mainitun toisen entsyymin eräälle anti-20 geeniselle kohdalle, määritetään mitattavissa oleva ioni tai yhdiste näytteessä olevan tuntemattoman aineen määrittämiseksi.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ioni tai yhdiste määritetään 25 mittaamalla fluoresenssi, väri tai luminesenssi. 20 8 5 9 4 6