CS263123B1 - Myši lymfocytární hybridom produkující protilátku proti lidskému alfa-fetoproteinu - Google Patents

Myši lymfocytární hybridom produkující protilátku proti lidskému alfa-fetoproteinu Download PDF

Info

Publication number
CS263123B1
CS263123B1 CS877926A CS792687A CS263123B1 CS 263123 B1 CS263123 B1 CS 263123B1 CS 877926 A CS877926 A CS 877926A CS 792687 A CS792687 A CS 792687A CS 263123 B1 CS263123 B1 CS 263123B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
afp
fetoprotein
alpha
human alpha
hybridoma
Prior art date
Application number
CS877926A
Other languages
English (en)
Other versions
CS792687A1 (en
Inventor
Ivan Rndr Csc Hilgert
Hana Rndr Kristofova
Vaclav Rndr Csc Horejsi
Irena Rndr Stefanova
Pavla Rndr Csc Angelisova
Original Assignee
Hilgert Ivan
Kristofova Hana
Horejsi Vaclav
Stefanova Irena
Angelisova Pavla
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hilgert Ivan, Kristofova Hana, Horejsi Vaclav, Stefanova Irena, Angelisova Pavla filed Critical Hilgert Ivan
Priority to CS877926A priority Critical patent/CS263123B1/cs
Publication of CS792687A1 publication Critical patent/CS792687A1/cs
Publication of CS263123B1 publication Critical patent/CS263123B1/cs

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomů, produkujícího protilátku proti lidskému alfa-fetqproteinu, uloženého ve sbírcg hybridomů U3tavu molekulární genetiky C3AV pod označením IMG CZAS AFP-01. Samotná monoklonální protilátka hybridomů AFP-01 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýze ke stanovení alfa-fetoproteinu a pro čištění lidského alfa-fetoijroteinu afinitni chromatografií. Pro zvýšení citlivosti enzyinoimunologické a radioimunologické analýzy je možno použít sendvičového testu v kombinaci s jinými monoklonálními protilátr kam.i proti lidskému alfa-fetoproteinu (AFP- -03 nebo AFP-11) připravenými na Ústavu molekulární genetiky.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O-Ag14 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti lidskému alfa-fetoproteinu.
Protilátky proti alfa-fetoproteinu se mohou vyrábět tak, že alfa-fetoprotein je opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvantitativní stanovení plazmatického alfa-fetoproteinu metodou radioimunologické nebo enzymoimunoanalytické analýzy. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality.
Nevýhodu konvenčních sér proti alfa-fetoproteinu v principu odstraňuje použití hybridoraové technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je namířena proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridomů je pravděpodobné, že se z něho podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která je namířená proti určité antigenní determinantě molekuly lidského alfa-fetoproteinu. Znamená to, že mohou být konstruovány klony molekulárních protilátek proti různým antigenním determinantám řetězce molekuly alfa-fetoproteinu. Výhodnost získání monoklonálních protilátek proti několika antigenním determinantám je hlavně v možnosti využití kombinací protilátek namířených proti různým deter- 2. 263 12^ minantám ke zvýšení citlivosti analytických testů pro stanovení alfa-fetoproteinu v tělních tekutinách. Tento přístup, tj. příprava hybridomů produkujících monoklonálni protilátky specificky rozeznávající alfa-fetoprotein, byl použit několika autory (např. Tsung, Y.-K., Milunsky,
A., Alpert, E.: Derivation and characterization of a monoclonal hybridoma antibody specific for human alpha-fetoprotein, J. Immunol. Meth. 39:363^368, 1980; Stenman, U.H., Sutinen, M.L., Selander, R.K., Tontti, K., Schroder, J.: Characterization of a monoclonal antibody to human alpha-fetoprotein and its use in affinity chromátography, J. Immunol. Meth. 46:337^345, 1981; Uotila, M., Ruoslahti, E., Engvall, E.: Two-site sandwich enzyme iramunoassay with monoclonal antibodies to human alpha-fetoprotein, J. Immunol. Meth. 42:11(^15, 1981; Hunter, W.M., Bennie, J.G., Brock, D.J.H., Van Heyningen, V.: Monoclonal antibodies for use in an immunoradiometric assay for (X-fetoprotein, J. Immunol. Meth. 50:1 33ie1 44, 1982.; Van Heyningen, V., Barron, L., Brock, D.J.H., Crichton, D., Lawrie, S.: Monoclonal antibodies to human cX-f etoprotein: analysis of the behaviour of three different antibodies, J. Immunol. Meth. 5O:123te131, 1982).
Dvě skupiny také použily připravených monoklonálních protilátek k přípravě antigenu, tj. alfa-fetoproteinu imunoafinitní chromatografií na imobilizované monoklonální protilátce (Stenman a spol.; Van Heyningen a spol., viz výše uvedené citace). Čistého antigenu se používá jako standardu pro stanovení ve vzorcích sér a jiných biologických materiálech.
K uvolnění antigenu navázaného na imunosrobent se používá roztoků o vysoké koncentraci chaotropních látek (chlorid hořečnatý nebo močovina), které mohou poškodit nativní strukturu alfa-fetoproteinu a tak' ovlivnit spolehlivost získaného standardu.
Podstatného pokroku se dosáhne, jestliže se k izolaci alfa-fetoproteinu imunoafinitní chromatografií použije monoklonální protilátky produkované hybridomem, uloženým ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4,
263 123
Vídeňská δ. 1083, pod označením IMG CZAS AFP-01. Při použití této monoklonální protilátky k izolaci alfa-fetoproteinu lze použít velmi šetrných podmínek pro vymytí antigenu.
Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tačtics,
J. Immunol. Meth., 35:1«21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266:550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie Sp2/O-Ag14 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných lidským alfa-fetoproteinem.
Výhodou hybridomů je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidským alfa-f etoproteinem. Hybridom AFP-01 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALE/c. Z konserv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem AFP-01, reaguje s lidským alfa-fetoproteinem a není třeba se zbavovat protilátek balast nich.
Příklad 1
Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 5 x 10^ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myší 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0.5 ml intraperitoneálně). Po 10 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 2 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 6,5 mg/ml imunoglobulinu. Protilátka AFP-01 reagovala se specifickým antigenem (lidským
I
- 4 263 123 alfa-fetoproteinem) v enzymoimunologickém testu (při použití prasečí antimyší protilátky značené křenovou peroxidázou) až do ředění 1:10 a v radioimunologickém precipitačním testu (při použití králičího antiséra proti myšímu imunoglobulinu a polyethylenglykolu k precipitaci komplexů antigen-monoklonáiní protilátka) až do ředění 1:10^. Tento hybridom produkuje monoklonální protilátku, která může být použita též pro stanovení koncentrace alfa-fetoproteinu v sendvičovém enzymoimunologickém testu v kombinaci s jinými monoklonálními protilátkami proti alfa-fetoproteinu (AFP-11 nebo AFP-03), a to bučí s použitím imobilizované protilátky AFP-01 a protilátek AFP-11 nebo AFP-03 konjugovaných s peroxidázou, nebo naopak s použitím imobilizovaných protilátek AFP-11 resp. AFP-03 a konjugátu s peroxidázou. Monoklonální protilátky AFP-01, AFP-03 a AFP-11 reagují s různými místy (antigenními epitopy) na molekule lidského alfa-fetoproteinu.
Příklad 2
Ze 4 ml ascitické tekutiny obsahující protilátku AFP-01 byla připravena globulinová frakce precipitaci síranem amonným a navázána na 2 ml CNBr-aktivované Sepharosy 4B. Kolonka připravená z tohoto imunosorbentu byla promyta 5 ml 0.1 M glycin-HCl pufru pH 2,8 a pak fyziologickým roztokem. Potem bylo přes tuto kolonku přefiltrováno během 4 hodin při 4°C 40 ml séra z novorozenecké pupečníkové krve, kolonka byla promyta 20 ml fyziologického roztoku obsahujícího 0.5 M NaCl a specificky adsorbovaný alfa-fetoprotein byl z kolonky vymyt při 37°C fyziologickým roztokem obsahujícím 50 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové (pH upraveno na 7,2). Celkový výtěžek byl 2,9 mg alfa-fetoproteinu, jehož čistota sledovaná elektroforeticky a vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií byla nejméně 90%. Imunoglobulin, který kontaminoval některé získané preparáty, mohl být odstraněn gelovou chromatografií.
Buňky hybridomu AFP-01 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. In vitro rostou jako polosuspenzní
26T 12T kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3 mM), pyruvát sodný (1 mM). Toto médium (označované jako KÉMI, Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomů AFP-01 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0.05 mM), HEPES (kyselina N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N *-2-ethansulfonová) (10 mM) a inaktivovaným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%). Hybridom je kultivován při 37°C. Střední generační čas je 19,8 hod. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgG1 s lehkými řetězci typu K , její isoelektrický bod je v rozmezí pH 6,6« 6,8.
Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem AFP-01, reaguje specificky s lidským alfa-fetoproteinem.
Hybridom AFP-01 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti lidskému alfa-fetoproteinu v metodách analytických nebo preparativních.
Monoklonální protilátka hybridomů AFP-01 může být využita pro analytické stanovení alfa-fetoproteinu při klinické diagnostice ve zdravotnických zařízeních, zvláště pro diagnóza nádorových onemocnění (hepatomy, teratomy atd.) nebo kongenitální malformace (rozštěp páteře - spina bifida plodu). Imobilizované monoklonální protilátky může být použito k čištění alfa-fetoproteinu pomocí afinitní chromatografie ze séra novorozenecké pupečníkové krve.

Claims (1)

  1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU
    Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS AFP-01, vyznačující se tímř že produkuje monoklonální protilátku podtřídy IgOl proti lidskému alfa-fetoproteinu.
CS877926A 1987-11-05 1987-11-05 Myši lymfocytární hybridom produkující protilátku proti lidskému alfa-fetoproteinu CS263123B1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS877926A CS263123B1 (cs) 1987-11-05 1987-11-05 Myši lymfocytární hybridom produkující protilátku proti lidskému alfa-fetoproteinu

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS877926A CS263123B1 (cs) 1987-11-05 1987-11-05 Myši lymfocytární hybridom produkující protilátku proti lidskému alfa-fetoproteinu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS792687A1 CS792687A1 (en) 1988-08-16
CS263123B1 true CS263123B1 (cs) 1989-04-14

Family

ID=5429234

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS877926A CS263123B1 (cs) 1987-11-05 1987-11-05 Myši lymfocytární hybridom produkující protilátku proti lidskému alfa-fetoproteinu

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS263123B1 (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
CS792687A1 (en) 1988-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bazin et al. Rat monoclonal antibodies. I. Rapid purification from in vitro culture supernatants
CN1598586A (zh) 用于检测有机磷农药残留的免疫抗体及其应用
CN114989144A (zh) 一种苯醚甲环唑半抗原、完全抗原、抗体及其制备方法和应用
JPH02486A (ja) 遊離n−アセチルノイラミン酸を認識するモノクローナル抗体
CS263123B1 (cs) Myši lymfocytární hybridom produkující protilátku proti lidskému alfa-fetoproteinu
Enghofer et al. Immunoglobulins with different specificities have similar idiotypes
CS240846B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS IN - 04
JP5448424B2 (ja) ヒトIgGのFcを含有するタンパク質の測定試薬
CS263121B1 (cs) i.iyóí lymfocytúrní hybridom produkující protilátku proti lidskému alfa-fetoproteinu
CS263122B1 (cs) Myší lymfocytární hybridorn produkující protilátku pr >ti lidskému alfa-1'etoproteinu
CS234935B1 (cs) Myší lymfocytární hybridem IMG CZAS B2M-01
RU2093572C1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к l -цепям иммуноглобулинов свиньи
SU1685997A1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS.мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к тиреотропному гормону человека
CS248383B1 (cs) Myši lymfocytárni hybridem IMG CZAS MEM-09
CS228858B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom produkující protilátku proti prasečímu imunoglobulinu 6
CS228857B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom produkující protilátku proti lidskému transferům
CS243348B1 (cs) Myší lymfocytární hybridem IMG-CZAS HTF-21
CN119504994A (zh) 抗雌二醇抗体或其抗原结合部分及其应用
CS228860B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom produkující protilátku proti lidskému transferinu
CS253337B1 (cs) Myši lymfocytárnf hybridem IMG CZAS RT-14
CS233810B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom produkující protilátku proti praseSímu a lidskému insulinu
JPH01269487A (ja) モノクローナル抗体産生細胞ラインおよびモノクローナル抗体
CS253240B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom HBslC6B12
CS253336B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS RT-12
CS228856B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom produkující protilátku proti prasečímu imunoglobulinu G