CS244398B1 - Myěí lymfocytámí hybridom IMG - CZAS AL - 01 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytámího hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému albuminu, uloženého ve sbírce hybrldomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením AL - 01. Monoklonální protilátka hybridomu AL - 01 je vhodná pro použití v metodách enzymoimunologickýoh, radioimunologických a preparativníoh.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj· hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší jnyelomové linie P3-X63-Ag8.653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti lidskému albuminu·

Doposud se protilátky proti albuminu vyrábějí tak, že je albumin opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům a prasatům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigonu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvantitativní stanovení plazmatického albuminu a k odstranění albuminu z testovaných sér. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné· Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu; ty je nutné ze sér odstraňovat vysycováním. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom, produkuj-fc-f monoklonální protilátku proti lidskému albuminu, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňské ul'. 1083, pod označením IMG CZAS AL - 01.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury /Fazekas de St. Groth, S·, Scheidigger, D·· Production of monoclonal antibodies. Stratégy and tactics.

J. Immunol. Ifeth., 35: 1-21, 1980; Galfré, G., Howe,S.C., Milstein, C., jautcher, G.W·, Howard, J»C.s Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266:550, 1977/ klonováním souboru hybridních

244 398 buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie P3-X63-Ag 8.653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c imunizovaných směsí lidských sérových bílkovin obsahující zvláště albumin a transferin.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv· protilátku raonoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidským albuminem. Hybridom AL - 01 je možné kultivovat in vitro v mediích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině.myší kmene BALB/c. Z konzerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem AL - 01 reaguje z lidských sérových proteinů pouze s albuminem, jak bylo zjištěno po elektroforetickém přenosu sérových proteinů (separovaných na elektroforéze v polyakrylamidovém gelu v prostředí dodecylsulfátu sodného za redukujících i neredukujících podmínek) na nitrocelulosovou membránu a specifické detekci nepřímým imunologickým testem /s využitím protilátky AL - 01 a praseěí protilátky proti myším imunoglobulinům konjugované s peroxidázou. ÚSOL,Praha/· Protilátka AL - 01 nereaguje s albuminem prasečím, králičím, myším ani hovězím. Příklad:

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 2 x 10θ buněk ďo peritoneální dutiny «ryší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 13 dní před převodem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem /0.5 ml intraperitoneálně/· Po 18 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 4.6 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 5 mg/ml imunoglobulinu· Monoklonální protilátka reagovala se specifickým antigenem /albumin izolovaný iontoměničovou chromátografií krevní plazmy na DEAE-Sepharose, čistý podle výsledků SDS elektroforézy/ v enzymoimunologickém testu /při použití prasečí antimyší protilátky značené křenovou peroxidázou/ až do ředění 1:10^·

Buňky hybridomu AL - 01 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyribosomy. In vitro rostou jako

- 3 244 398 polosuspenzní kultury* Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální medium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin /3mM/, pyruvát sodný 1 mM/* Toto médium /označené jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV/ je pro kultivaci hybridomu AL-01 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycínem, 2-merkapto ethanolem /0.05 nM/, pufrem HEPES /10 raM/ a inaktivovaným bovinním sérém /Bioveta, Ivanovice na Hané 10%/. Hybridom je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 15 »9 hod a 13 měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 80. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgG1, s lehkými řetězci typu kappa, její izoelektrický bod je pH 7,6(08,0.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem AL - 01 reaguje specificky s lidským albuminem.

Hybridom AL - 01 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti albuminu v metodách analytických nebo preparátivních, zejména k odstranění albuminu při detekci minoritních sérových proteinů a pro kvantitativní stanovení velmi nízkých koncentrací albuminu v moči a výplachu plic.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Myší lymfocytámí hybridom IMG CZAS AL-01 , produkující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti lidskému albuminu.