CS223535B1 - Myší lymfocytární hybridom - Google Patents

Abstract

Vynález se týká myšího lymfoeytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti tabulinu, zejména prasečímu, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením TU-01. Samotná monoklonární protilátka hybridomu TU-01 je vhodné pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analyse a při vizualizaci mikrotubulů v buňkách na úrovni optického a elektronového mikroskopu.

Description

Vynález se týká nového hybridomů, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúzí myší myelomové linie P3-X63-AgS.653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkují- : cí protilátku proti prasečímu tubulinu.

Doposud se protilátky proti'tubulinu vyrábějí tak, že je tu-_; i ulin opakované injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejČastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro identifikaci buněčných struktur, obsahujících tubulin. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu; ty je nutné ze.sér odstraňovat složitým způsobem, zvaným vysycování. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality.

Pro výrobu každé Šarže je třeba připravit značně čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám. ,

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom,produkující monoklonální protilátku proti prasečímu tubulinu, uloženy ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňské ul. č ,.1083, pod označením IMG GAS TU-01.

~2

223 535

Uvedený' hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury /Pazekas de,-St., Groth, S., Scheidigger, D.: Production of monoclonal antíbodies: Stratégy and tactics, J. Imiaunol. íčeth., 35:1-21, 1980; Galfré, G., ílowe, S.G., Milstein, G_e, Butcher, G.U., Howard, J.C.: Antíbodies to major histočompatibili ty antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře, 266x550,

1977/ klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí myší myelomové linie P3-X63-Ag8.ó53 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene Balb/c, imunizovaných prasecím tubulinem.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s prasečím tubulinem, ale i s tubulinem řady dalších druhů /mezi jinými též s lidským tubulinem/. hybridom TU-01 je možné

Z · v kultivovat in vitro v mediích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene Balb/c Z konserv, uchovávaných ^v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem TU-01, je specifická výhradně pro tubulin a není třeba se -zbavovat protilátek balastních.

Příklad:

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 1 x 10 buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 9 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem /0,5 ml intraperitoneálně/. Po 14 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla mys zabita a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 5,0 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 9 wg/ml imunoglobulinu. Protilátka reagovala se specifickým antigenem v enzymoimunologickém testu /při použití prasečí antimyší protilátky značené křenovou peroxidázou/ až do ředění 1:10^. Za pomoci nepřímé imonofluorescenční techniky byl takto získanou protilátkou zobrazen mikrotubulární ‘komplex v buňkách myší fibroblastoidní linie G^H původu.

Buňky hybridomu TU-01 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné

223 S35 a na membrány vázané polyribosomy. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním mediem je Eaglovo minimální esenciální medium s Hanksovou solnou směsí a doplněné o neasenciální aminokyseliny, L-glutamin /3 mM/, pyruvát sodný A mM/. Toto medium, /označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV/, je pro kultivace hybridomu TU-01' doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem /0.05 mM/ pufrem HEPES AO mM/ a inaktivovaným bovinním sérem /Bioveta, Ivanovice na Rané, 10 %/. Hybridom je kultivován při 3^G. Střední generační čas je 13*1 hod. a pět měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 82. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGl.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem TU-01 analogicky s konvenčními protilátkami reaguje s tubulinem řady dru- . hů. Je proto využitelná k detekci buněčných cytoskeletálních struktur většiny druhů obsahujících tubulin.

Hybridom TU-01 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti tubulinu v metodách analytických nebo pre parat ivní ch·

Claims (1)

1. Myší lymfocytární hybridom IMG GAS TU-01, produkující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti tubulinu, zejména prasečímu.