CS255643B1 - Myši lymfocytární hybridom produkující monoklonální protilátku proti a a β podjednotce tubulinu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hydridomu produkujícího monoklonální protilátku protiíX.- a/3-podjednotce tubulinu řady druhů, uloženého ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod punačením IMG- -CZAS TU-10. Monoklonální protilátka hybridomu TU-10 je vhodná pro použití v enzymoimuno- logické a radioimunologické analýze tubu- linu, nebo při vizualizaci mikrotubulů v buňkách na úrovni optické a elektronové mikroskopie.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/0 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti alfa- a beta-podjednotce tubulinu (tj. oytoskeletálnímu proteinu, který je stavební komponentou mikrotubulů).

Protilátky proti tubulinu se připravují klasickým způsobem tak, že je tubulin opakovaně injikován pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek užívaných zejména pro indentifikaci buněčných struktur obsahujících tubulin. Tento postup nazývaný konvenční imunizací má několik nevýhod. Vzhledem k tomu, že tubulin patří mezi vysoce konzervativní proteiny, je opakované získáváni dobře imunizovaných zvířat obtížné.

V séru se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Zpravidla jsou v séru přítomny vedle protilátek proti žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu; tyto protilátky se musí složitým způsobem odstraňovat. Připravené šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a mají široké rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit značně čistý imunizační antigen.

Nevýhody konvenčních sér proti tubulinu v principu odstraňuje hybridomová technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je zaměřen vždy proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridomů, je pravděpodobné, že se z něho podaří vyhledat hybridom syntezující protilátku, která rozeznává antigenní determinantu přítomnou jak na alfa-, tak i na beta-podjednotce tubulinu.

Pokroku v detailní analýze mikrotubulárních struktur, projevujícího se v současné identifikaci obou podjednotek tubulinu, se dosáhne, je-li k dispozici hybridom produkující monoklonální protilátku proti alfa- i beta-podjednotce tubulinu, uložený ve Sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská 1083, pod označením IMG CZAS TU-10.

Uvedený hybridom byl získán způsobem z odborné literatury (Fazekas de, St., Groth,

S.S. Scheidegger, O.: Produkction of monoclonal antibodies: stratégy and tactics. J. Immunol. Meth. 35: 1-21, 1980 Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to major hostocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš. Nátuře 266: 550-552, 1977) klonováním souboru hybridních buněk vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie Sp2/0 a buněk, získaných ze slezin myší kmene BALB/c imunizovaných mikrotubulárními proteiny prasečího mozku. Mikrotubulární proteiny byly připraveny dvěma následnými cykly poymeraci-depolymerace z homogenátu mozku (Shelanski, M.L., Gaskin, F., Cantor, C.R.: Microtubule assembly in the absence of added mucleotides. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 70: 765-768, 1973) .

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní monoklonální protilátku, která je schopna specificky reagovat s alfa- i beta-podjednotkami tubulinů různých živočišných druhů. Hybridom TU-10 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konzerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem TU-10, reaguje s podjednotkami tubulinu specificky a není třeba odstraňovat protilátky balastní.

Příklad g

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 1 x 10 buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitoneálně). Po 11 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem byly získány 2 ml ascitické tekutiny obsahující přibližně 1 mg/ml imunoglobulinu.

Monoklonální protilátka, ve formě ascitické tekutiny, reagovala se specifickým antigenem (purifikovaným prasečím tubulinem,) v nepřímém enzymoimunologickém testu při použití prasečí protilátky myšímu imunoglobulinu značené křenovou peroxidázou (Ostav sér a očkova5 cích látek, Praha), do ředění 1:10 . K vazbě nedocházelo, by-li namísto tubulinu použít hovězí sérový albumin, lidský transferin nebo myší vimentin. Rovněž v kontrolních experimentech při použití myší monoklonální protilátky TEC-01 (IgM, lehký řetězec kapa), která je namířena proti diferenciačnímu antigenu myších teratokarcinomových buněk (Dráber, Pe., Pokorná, z.: Differentiation antigens of mouše teratocarcinoma stem cells defined by monoclonal antibodies. Cell Differentiation 15: 109-113, 1984) k vazbě nedocházelo.

K průkazu, že monoklonální protilátka TU-10 specificky reaguje pogze s tubulinem bylo použito dvou přístupů.

a/ Při imunoblotingu byly proteiny separovány elektroforézou v polyakrylamidovém gelu za redukujících podmínek a elektroforeticky přeneseny z gelu na nitrocelulózovou membránu.

Po inkubaci repliky s monoklonální protilátkou (ředění 1:10 ) byla vazba navázané protilátky detegována enzymoimunologicky s použitím komplexu peroxidáza (myší monoklonální protilátka) proti křenové peroxidáze (Viklický, V., Dráber, Pa., Macků, B., Dráberová, E., Rozprimová,

L.: Monoclonal antibodies against horseradish peroxidase. Fol. Biol. /Praha/ 30: 378-382,

1984) . Tu-10 protilátka se vázala na alfa- a beta-podjednotky purifikovaných tubulinů různých druhů (prasečí, hovězí, myší, krysí, králičí), v mikrotubulárních proteinech prasečího mozku a v celých lyzátech prasečí mozkové tkáně se vázala pouze na proteiny v poloze alfaa beta-podjednotky tubulinu. V žádném případě se nevázala na proteiny asociované s mikrotubuly (MAP-1, MAP-2, tau proteiny). V celých buněčných lyzátech buněčných linií LEP (lidský plicní fibroblast), T-24 (lidský karcinom močového měchýře), MOLT-4 (lidský T-lymfoblast),

C-l 300 (myší nuetoblastom) se protilátka TU-10 vázala pouze na proteiny s elektroforetickou pohyblivostí odpovídající poloze alfa- a beta- podjednotky tubulinu. V kontrolních experimentech s monoklonální protilátkou TEC-01 k vazbě nedocházelo.

b/ Při nepřímé imunofluorescenci byly adherentní buňky linie LEP inkubovány 2 min. s 0,15% Tritonem X-100 ve stabilizačním pufru pro cytoskelet (Smáli, J.V., Celíš, J.E.: Filaments arrangements in negatively stained cultured cells: the organizatíon of actin. Cytobiologie 16, 308-325, 1978) doplněném o 4% polyetylenglykol 4 000 a fixovány 30 min.

3% paraformaldehydem. Na takto připravený cytoskelet byla aplikována protilátka TU-10 (ředění 1:200) a její vazba na cytoskeletální struktury byla sledována imunofluorescenční mikroskopií při použití prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu značné fluorescein izothiokyanátem (Ostav sér a očkovacích látek, Praha). TU-10 protilátka se vázala pouze na mikrotubulární struktury interfázních a mitotických buněk a nebyly znázorněny další cytoskeletální struktury - mikrofilamenta a střední filamenta. Po působení vinblastinu docházelo k tvorbě typických parakrystalů. Při dvojím značení cytoskeletálních struktur metodou nepřímé/přímé imunofluorescence s monoklonální protilátkou TU-10 a myší monoklonální protilátkou TU-04 přímo značenou rhodaminem, která je namířena proti alfa-podjednotce tubulinu řady druhů (Dráber,

Pa., Dráberová, E., Zicconi, D., Sellitto, C., Viklický, V., Cappuccinelli, P.: Heterogeneity of microtubules recognized by monoclonal antibodies to alpha-tubulín. Eur. J. Cell Biol.

41: 82-88, 1986), docházelo k vazbě obou protilátek na identická vlákna mikrotubulů. V kontrolních experimentech s monoklonální protilátkou TEC-01 nebyly cytoskeletální struktury znázorněny.

Buňky hybridomu TU-10 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk, kde převažující orgánelou jsou volné a na membrány vázané polyribosomy. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí, doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3 mM) , pyruvát sodný (1 mM) . Toto médium (označené jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV), je pro kultivace hybridomu TU-10 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0,05 mM), pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaným bovinním šerem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%) .

Hybridom je kultivován při 37 °C; střední generační čas je 16,4 hod. a 6 měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 80. Produkovaná protilátka je imunoglobulin třídy IgM s lehkými řetězci typu kapa.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomu TU-10, reaguje, analogicky s konvenčními, protilátkami, s tubuliny různých druhů a je proto využitelná k detekci buněčných mikrotubulárních struktur. Hybridom TU-10 může být průmyslově využíván jako zdroj minoklonálních protilátek proti alfa- a beta-podjednotce tubulinu v metodách analytických nebo preparativních.

Claims (1)

1. Myší lymfooytární hybridom IGM CZAS TU-10, produkující monoklonální protilátku třídy IgM proti alfa a beta tubulinu řady druhů.