SU1645295A1 - Штамм культивируемых гибридных клеток животных МUSмUSсULUS L - продуцент моноклональных антител против В-лимфоцитов крупного рогатого скота - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к гибридной технологии и может быть использовано дл  определени  В-лимфоцитов коров „ Цель изобретени  - получение штамма культивируемых гибридных клеток , продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) против IgM коровы UTOMM получают гибридизацией клеток миеломы РЗ.Х63 Ag8u653 с клетками селезенки мышей Balb/c, иммунизированных лимфоцитами крови коров, больных хроническим лимфолейкозом.Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 10% сыворотки эмбриона коровы и стандартными добавками, Штамм прививаетс  in vivo в сингенних мылах в виде асцитной опухоли, Птамм проду щруют монАТ класса IgG2b. НонАТ направлены против IgM, наход щегос  на поверхности клеточ и растворимого в сьшоротке, МонАТ провл ют 1унтотоксическое действие в отношении В-лимфоцитов. Титр монАТ в культуральной жидкости 128, в асцитной жидкости 2048, 1Лтамм депонирован под номером ВСКК(П) К1 295D 5 Кл

Description

Изобретение относитс  к гибридом - ной технологии и может быть использовано дл  определени  В-лимфоцитов коров о

Цель изобретени  - получение штамма культивируемых гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) против IgH коровы,

Ытамм получают следующим образом,.

Мышей Ва1Ъ/с весом 18-20 г иммунизируют В-лимфоцитами крови больного хроническим лимфолейкозом крупного рогатого скота (1СРС) , В-лимфоциты из крови животных выдел ют методом аффинной хроматографии

Иммунизаци  включает цикл из инъекций В-лимфоцитами (2x10 кл/мл) внутрибрюшично в полном адъюванте Фрейда В процессе иммунизации у животных определ ют титр антител к В-лимфоцитам КРС методом твердофазного ИМФ анализа „ Выход гибридом, гфодуцирукщих спе- циоические антитела, наибольший, если дл  сли ни  берут клетки на 3-5-е сутки после бустерной иммунизации

Дл  получени  гибридомы используют клеточную линию миеломы РЗх x63Ag8.653. Клетки миеломы культи- - вируют на среде ДМЕМ с добавлением 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, 2 мМ глутанина, 20 мМ буфера IIEPES, 200 мкг/мл гентамици- на0 При гибридизации в качестве сли- ваюцего агента используют 50%-ный

05 4

сд

1C

СО

ел

полиэтиленгликоль (ПЭГ) МсМ„ 15000 Родительские клетки миеломы P3x63Ag8.

.653 примен ют в логарифмической фазе роста. Из селезенки Balb/с мышей, иммунизированных В-лимфоцитами, извлекают спленоцнты. Спленоциты и клетки миеломы промывают трижды в среде ДМЕН с двукратной концентрацией антибиотика (гентамицина) без снво- роткио Дл  сли ни  смешивают 10 клеток миеломы и 10 лимфоцитов селезенки мыии Ва1Ь/с„ Перед сли нием клетки смешивают и совместно осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин. К осадку клеток добавл ют 0,3 мл ПЭГ, тщательно перемешивают и инкубируют 60 с. Далее клетки разбавл ют средой ДНЕМ без сыворотки. Первые 10 мл среды добав- л ют в течение 10 мин, далее разбавление провод т быстрее, довод  объем до 100 мло Клетки центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. Осадок

I суспендируют в среде ГАТ с 20% сы- воротки эмбрионов крупного рогатого скота и помещают в 96-луночные платы из расчета 1-1,5x10 клеток миеломы на одну лункуо За день до гибридизации в лунки плат помещают макрофаги брюыной полости мышей по 1«10 - клеток в лунку. Платы с клетками инкубируют при 37°С в атмосфере 5%-ной На 14-е сутки среду ГАТ, в которой культивировали гибридные клоны, мен ют в ГТ (гипоксантин 110 И, тимидин ), а затем на обычную среду культивировани „ Клоны, синтезируюыие антитела, перевод т в 24-луночные платы, после чего замора- живают и клонируют методом предельных разведений в 96-луночных платахо Клетки , синтезируюцие. антитела (10 - 10 клеток на 1 мл), ввод т в брюшную

.полость мыией Balb/c, обработанных пристанем (0,5 мл на мышь внутрибрю- шинно) за 4-10 дней до введени  клеток дл  получени  асцитов о

Отбор клонов провод т путем определени  антител к В-лимфоцитам в Куль туральной среде, в которой росли клоны . Антитела определ ют твердофазным иммуноферментным методом Титр антител в культуральной жидкости составл ет 128.

..Штамм обозначен BBL-E и депонирован под номером ВСКК(П) ff 295D. Культуральные свойства.

5 0

5 0 , Q

$

0

5

Штамм культивируют на ростовой среде Игла в модификации Дульбенко (ДМЕМ) с добавлением 10% эмбриональной тел чьей сыворотки, 4 г/л глюкозы , 20 мМ буфера HEPES, 2 мМ глутами- на и 50 мкг/мл гентамицина. „

Клетки культивируют в суспензии в матрасах объемом 0,5 л; посевна  концентраци  10 клеток/мл, кратность рассева 1:60

Прививка клеток мышам на разных пассажах культивировани  стабильно вызывает образование асцитных опухолей у мыиейо

Образованию асцита способствует предварительна  инъекци  пристана животнымо Его ввод т за 4-10 дней до введени  клеток по 0,5 мл на 1 мышь, внутрибрюииннОо Суспензию гибридных клеток 10у- 10 (4 мл) на 1 мышь также инъекцируют внутрибрюыинно,, Опухоли образуютс  через 7-14 дней после прививкио От одного животного удаетс  получить около 5 мл асцита, Мон- АТ высаливают 45%-ным раствором сульфата аммони  с последующей очисткой на ионнообменной колонке с ДЭАЭ-целлю- лозой„ Концентрацию иммуноглобулинов определ ют в 96-луночных планшетах дл  микротигровашик В лунки внос т 20 мкл исследуемого образца и добавл ют по 200 мкл раствора дл  определени  белка, содержащего 0,01%-ный раствор Кумасси Р-250, 5% этанола и 10% II.РО , Оптическую плотность измер ют через 5 мин на спектрометре (Бекман И-8В, СНА) при длине волны 620 нм„ В качестве стандарта дл  калибровочной кривой используют раствор мыпиного IgG в концентрации от 0,1 до 0,8 мг/мл„ Концентрации стандартного раствора определ ют спектрофото- метрически при длине волны 280 нм с учетом коэффициента экстинкции В асците концентраци  иммуноглобулинов составл ла 5 мг/мл,,

Крноконсервацию провод т в среде ДМЕМ с 50% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота и 10% ДМСО„ Жизнеспособность замораженных клеток составл ет 72-85% от общего числа клеток о

Характеристика полезного продукта.

Специфичность полученных монАТ определ ют с помощью непр мого имму- ноферментного (ИМФ) и радиоиммунологического (РИА) чнализов. Анализы провод т на лимфоцитах, выделенных

из периферической крови здоровых (НЛ и больных хроническим лимфолейкозом (ЛЛ) коров о Полученные МКА про вл ют специфичность в 5-6 раз выше к ЛЛ, чем к нормальным, а также специфически реагируют с белками сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС)J а именно с IgM, выделенным из сыворотки КРСо

Дл  исследовани  молекул рной специфичности монАТ, продуцируемых штампом BBL-Dg, приготавливают колонку с иммуносорбентомо В качестве носител  берут сефарозу 4В, активированную бромцианомо На 1 мл егл  берут 6 мг очищенных из асцитной жидкости. На приготовленный иммуно- сорбент нанос т меченые J поверхностные белки НЛ и ЛЛ и инкубируют колонку 1 ч при 37°С, легко перемешива  „ Несв занные белки элюируют 0,1 И боратным буфером рН 8,3„ Специфически св занные белки элюируют 0,2 М НС1-глициновым буфером, элюат нейтрализуют 1 М NaOH и диализируют против ФСБ.

Иодирование белков клеточной поверхности провод т с помощью лакто- пероксндази0 В суспензию клеток 5-10х107 в 1 мл ФБС добавл ют 100 мкл лактопероксидазы (2 мг/мл), 40 1Шк Ма г53 и 100 мкл 0,03% Смесь инкубируют 4 мин, осторожно переметша , и оп ть добавл ют 100 мкл 0,03% НгОа„ Через 4 мин инкубации клетки 3 раза промывают ФСБ и лизируют 0,5%-ным раствором дезоксихолата натри  на боратном буфере, рН 8,3, имеющим 1 мМ PMSF (уенилметилсульфонилфторида)„ Эффективность мечени  белков устанавливают с 10%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ) , Установлено, что иммуно- сорбент с MICA специфически св зывает 0,79% белков, сн тых с НЛ, и 1,36% белков, сн тых с ЛЛ0

Элюат с специфически св занными белками исследуют с помощью электрофореза в столбиках полиакриламидного гел  в присутствии додецилсульфата натри  (ПААГ-ДСН)„ Используют 7,5% и 10% полиакриламидные гели„ В качестве буферной системы используют 0,025 М грис, 0,192 М глицина, 0,1% ДСН, рН 8,3 Белковые пробы перед электрофорезом разбавл ют буфером нанесени  в соотношении 4:1 и инкубируют в течение 2-3 мин в кип щей вод ной бане.

5

0

5

,- 0

0 5

Буфер нанесени  готов т, смешива  с. 0,5 11 трис-НС1,-рН 6,8, 0,9 мл 87% глицерина, 1,6 мл 10% ДСН, 0,4 мл 2-меркаптоэтанола, 0,2 мл 0,015% бромфенолового синего и дистиллированной воды до конечного объема 8 мл Электрофорез в концентрирующем геле провод т при посто нном токе 17 мА на гель При переходе краски в раздел ющий гель силу тока увеличивают до 25 мА на гель.

Фиксацию и окрашивание гел  провод т в течение часа в растворе, содержащем 25% этанола, 10% уксусной кислоты и 0,1% красител  .Кумасси Р-250. Гель отмывают в 25%-ном водном растворе этанола с 10%-ной уксусной кислотойр В качестве маркерных белков используют комплект маркерных белков дл  электрофореза: фос- форилазу (94 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), овальбумин (43 кДа), карбоновую ангидразу (30 кДа), ингибитор трипсина (20,1 кДа), и J -лактальбумин (14,4 кДа), Пластинки гелей с мечен- .ными белками сушат под вакуумом и провод т радиоавтографию на пленке рентгенографической медицинской. Столбики гелей с мечеными J белками режут на кусочки по 2 им и измер ют излучение У -счетчиком (LKB) .

Установлено, что иммуносорбент специфически св зывает поверхностные белки лимфоцитов, которые имели молекул рную эмассу около 83-90 килодаль- тоНо Из литературных данных известно, что такую молекул рную массу имеет т жела  цепь поверхностного иммуноглобулина М„

Дл  проверки провод т ИОА отдельных классов иммуноглобулинов, очищенных из сыворотки крови КРС. В лунки 96-луночной пластинки разливают по 100 мкл отдельных классов Ig (IgM,, IgG 1 и IgG 2, концентраци  10мкг/мп) Б карбонатном буфере рН 9,6. Пластинки инкубируют 3 ч при комнатной тем- пературе, жидкость стр хивают, лунки, блокируют 0,4%-ным БСА 1 .ч при и отмывают 5 раз ФСБ с 0,05%-ным твин-20 После инкубации с монАТ (1 ч при 37°С) и с антителами к Ig мышей, мечеными пероксидазой, получают, что монАт специфически св зывает только

IgHo

Установлено, что монАТ св зывают IgM КРС, но не реагируют с IgM, вы

.к i i HIM из сыворотки крови крыс, кроликов и человека,, Этим показано, что монAT, продуцируемые штаммом RBL-D опознают специфические детерминанты на молекуле Igll, свойственные только IgM у КРСС

Определение класса и подкласса мопАТ провод т иммуноферментным методом , МопАТ BBL-D. принадлежат к классу 1цС2Ь.

При культивировании клеток штамма BBL-DQ in vivo в мышах линии Balb/c 01 одной мыии получают 1-5 мл асцит- ной жидкости. Из 1 мл асцитной жидкости получено 5 мг МКа. Титр антител в асцитной жидкости составл ет . П48,

LlT.-iMM хранитс  в специализированной коллекции клеточных культур инсти тута Цитологии АН СССР - ВСКК.

Регистрационный номер депонировани  ВСКК(II) К 295 D.

Использование штамма иллюстрируетс  следующим примером использо- ваии  1донАТ BBL-D- в методах ИФА и Р11А дл  определени  взаимодействи  MoiiAT с клетками периферической кропи здоровых коров и больных лим- (ролей коз ом, а также с клетками из различных ломфоидпых органов (тимуса , костного мозга, эмбрнонных лим- (о июв и селезенки) „

1 р и м е р„ Дл  определени  спе- щи- (носги мопАТ методом ИФА в асцитной /П1ДКОСТН и после их выделени  из периферической крови здоровых и больных хроническим лимгюлейкозом коров ID L n- iMHir лимфоциты при 4°С в градиенте плотности 17%-ного верографина,, Выделенные клетки трижды отмьшают фосоатло-солевьсм буфером (ФСБ) рн 7, н с успендируют до концентрации

1x10 клеток/мл. Дл  экспериментальных исследований используют суспензи ашюоцитов, содержащие не менее 90% tni ux клеток с )(изнеспособность 1пм роцитов определ ют с помощью (}305%-ного раствора трипанового сиш 106

Суспензию клеток (1x10 мл) по

j мкл разливают в лунки 96-луночной плоскодонной пластинкио Пластинки ле ю встр хивают, чтобы клетки равномерно распределились на дне лунок, и высупивают в термостате при 37 С„ Такие пластинки с прикрепленными клека DI можно хранить длительное врем  при +4°С0 Перед использованием лунки

регидратируют с 100 мкл ФСБ в течение 10 мин „ В лунки добавл ют по 100 мкл ФСБ, имеющего 10 БСА, и инкубируют пластинки 1 ч при 37°С„ Пластинки отмьшают 5 раз ФСБ, содержащим 0,05 твин-20о В лунки внос т по 50 мкл мопАТ и контрольных сывороток: сыворотку мыией, иммунизированных ЛЛ (положительный контроль), и сыворотку здоровых мышей линии Balb/c (отрицательный контроль) в разведении 1:1000 Пластинки с антителами инкубируют при комнатной температуре 3 ч, а затем оставл ют на ночь при +49С„ Пластинки вновь отмывают описанным выше способом и в лунки вливают овечьи антитела к Ig мышей, меченые пероксида- зой, в разделении 1:1000 В ФСБ с 1% БСАь Пластинки инкубируют 1 ч при 37 С, отмывают 5 раз и в каждую лунку вливают по 100 мкл субстрата АБТС (2,2 азино-диаэтилбензтиозолинсульфа- та)с Пластинки инкубируют 20 мин при 37°С в темноте„ Реакцию останавливают добавлением 100 мкл 2,1%-ного раствора лимонной кислоты Учет результатов провод т спектрофотуметром при длине волны 416 нм„ Па основе результатов анализа устанавливают,что титр асцитной жидкости составл ет 2048, а оптимальна  концентраци  очищенного монАТ - 2-5мкг/мл„

Дл  определени  специфичности монАТ методом радноиммунологического анализа (РИА) клетки лимфоидных органов и лимфоциты периферической крови (106/мл) разливают по 100 мкл в каж- дуи лунку и добавл ют по 100 мкл МКА или контрольных антисывороток. Инкубируют 1 ч при 37 С и на ночь при 4 Со После инкубации пластинки центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин, суперна- тант отсасывают, клетки 5 раз промывают ФСБ, В каждую лунку внос т по 50 мк ( 50„000 имп/мин) меченых J овечьих антител против Ig мыией (Amersham, Англи ) и инкубируют 1 ч при 37°С„ После инкубации клетки промывают 5 ра ФСБ н определ ют радиоактивность„Как метод ИФА, так и РИА показал, что моиAT св зываютс  более интенсивно с лимфоцитами коров, больных лейкозом, чем здоровых„

Полученные результаты в РИА на клетках разных лимсХ ид.ных органов взрослых коров и их эмбрионов также показывают, что наибольший процент

91643295 О

реактивности дают клетки эмбрнональ-И А дл  определени  уровн  раствориных лимфатических узлов и селезенки,мого в сыворотке коров„

а такие клетки костного мозга взрос-уормула изобретени  лих коров, где преобладают клетки В- Штамм культивируемых гидридных

типа°клеток животных Musmusculus L,

Кроме того, монАТ обладают цитоток-ВСКК(Н) К 295 D - продуцент моноклосическим действием в отноиении В-лим-нальных антител против В-лимфоцитов

фоцитов, а также используютс  в методекрупного рогатого скотао

Claims (1)

1. Формула изобретения Штамм культивируемых гидридных клеток животных Musmusculus L.

   ВСКК(П) К^! 295 D - продуцент моноклональных антител против В-лимфоцитов крупного рогатого скота.