CS264946B1 - Myší lymfocytární hybridom NF-01 produkující protilátku proti 210 kDa proteinu neurofilament - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárníbo hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému 210 kDa proteinu neurofilament, uloženého ve sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze pod označením IMG CZAS NF-01. Samotná monoklonální protilátka hybridomu NF-01 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýze, testování tkání, buněk a tělních tekutin, jakož i pro vizualizaci 210 kDa proteinu neurofilament v buňkách na úrovni optického a elektronového mikroskopu a i imunohistochemického průkazu 210 kD a proteinu neurofilament na tkáňových řezech.

Description

(57) Řešení se týká myšího lymfocytárníbo hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému 210 kDa proteinu neurofilament, uloženého ve sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze pod označením IMG CZAS NF-01. Samotná monoklonální protilátka hybridomu NF-01 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýze, testování tkání, buněk a tělních tekutin, jakož i pro vizualizaci 210 kDa proteinu neurofilament v buňkách na úrovni optického a elektronového mikroskopu a i imunohistochemického průkazu 210 kD a proteinu neurofilament na tkáňových řezech.

DQ (O

OT (O

CS 2

CS 264 946 Bl

Vynález se týká myšího lymfocytárního hybridomu NF-01 produkujícího monoklonální protilátku proti 210 kDa proteinu neurofilament.

Doposud se protilátky obecně vyrábějí imunizací zvířat tak, že je antigen opakovaně aplikován zpravidla spolu s adjuvans pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům, morčatům, prasatům či kozám. Sérum takto imunizovaných zvířat se odebírá po určité době působení antigenu a slouží jako zdroj protilátek, které se používají pro diagnostiku a léčbu řady onemocnění, ale i pro studium výskytu a funkce těchto antigenů v buněčné patofyziologii. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu, které je nutné ze sér odstraňovat složitým způsobem zvaným vysycování. V případě antisér proti proteinům neurofilament je situace komplikována jejich značnou vzájemnou podobností, takže připravit konvenční antisérum proti jedinému proteinu neurofilament vysycováním je pracné. Výrobní šarže konvenčních antisér se proto dají jen velmi nesnadno standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit značně čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám č· proti podobným molekulám, jako je např. vimentin, desmin nebo keratiny.

Tyto nedostatky jsou odstraněny použitím hybridomu produkujícího homogenní monoklonální protilátku proti 210 kDa proteinu neurofilament podle vynálezu.

Tento myší lymfocytární hybridom NF-01 byl získán způsobem známým z odborné literatury (Kohler G., Milstein C.: Continuous cultures of fused cells sergeting antibody of predefined specifity, Nátuře 256:495, 1975; Galfré G., Howe S. C., Milstein C., Butcher G. W., Howard J. C.: Antibodies to major histocompatibility antigen produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266:550, 1977; Fazekas de St. Groth S., Scheidigger D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth. 35:1 až 21, 1980) klonováním souboru hybridních buněk vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie Sp 2/0 a buněk získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných izolovaných cytoskeletálním preparátem získaným z prasečího mozku.

Výhodou myšího lymfocytárního hybridomu NF-01 je, že se váže na cílovou strukturu neurofilament, která je stabilní i při relativní drastické fixaci lidského materiálu formaldehydem a následném zalití do parafinu, což je rutinně používaná fixace histologického materiálu ve všech histopatologických laboratořích. Jiné v zahraničí známé protilátky např. protilátka proti proteinům neurofilament fy Labsystems, Helsinki, Finsko, reagují na obdobně připravených řezech až po enzymovém natráveni nebo vyžadují šetrnější speciální fixaci. Žádné z protilátek proti lidskému 210 kDa proteinu neurofilament produkovaných dosud popsanými hybridomy nemají schopnost reagovat na parafinových, nenatrávených řezech. Protilátka NF-01 dává velmi dobré výsledky i na mražených tkáňových řezech. Tabulka č. 1 ukazuje sílu reakce protilátky NF-01 při použití různých způsobů zpracování tkáně:

Tabulka 1

Intenzita reakce protilátky NF-01 na tkáňových řezech fixovaných třemi různými způsoby (++ silná reakce, - nereaktivita).

Použitá fixace metanol/aceton metakarn formaldehyd

Příprava tkáně zmražené parafinované parafinované

Výsledná reakce ++ ++ ++

Výsledky ukazuji, že tato protilátka může být využita na všech patologických odděleních pro rutinní diferenciální diagnostiku k odlišení nádorů pocházejících z neuronů.

CS 264 946 Bl

Hybridom NF-01 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro pěstování živočišných buněk nebo v podmínkách in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Hybridom NF-01 je vhodný k dlouhodobému uchovávání v konzervách uložených v kapalném dusíku. Produkci monoklonální protilátky je možno zahájit po rozmražení buněčné konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu. Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem NF-01, reaguje s lidským 210 kDa proteinem neurofilament a nereaguje s žádným dalším proteinem středních filament ani s dalšími lidskými buněčnými bílkovinami, jak bylo zjištěno imunoblotingem, enzymoimunologickým testem, nepřímou imunoperoxidázou a nepřímou imunofluorescenční metodou.

Průkaz této specifičnosti byl získán po elektroforetickém přenosu rozsáhlého spektra buněčných a tkáňových lysátů a preparátů izolovaného cytoskeletu různých lidských tkání a buněčných linií, a to po separaci bílkovinných komponent v polyakrylamidovém gelu v prostředí dodecylsulfátu sodného za redukujících podmínek. Po přenosu rozdělených bílkovin na nitrocelulózovou membránu byl 210 kDa protein neurofilament specificky vizualizován (detekován) s použitím NF-01 a následně prasečího antiséra proti myším imunoglobulinům konjugovaného s křenovou peroxidázou (OSOL, Praha). Jako pozitivní kontrola sloužila monoklonální protilátka proti proteinům neurofilament od firmy Labsystems, Helsinki, Finsko, která dávala obdobné výsledky.

Pomocí imunoperoxidázové reakce na tkáňových řezech lidských tkání, kterou potvrzovaly i výsledky dosažené při nepřímé imunofluorescentní metodě, byla u protilátky NF-01 zjištěna reaktivita na výběžcích gangliových buněk míšních a kůry mozečku.

V nepřímé imunofluorescenci využívající protilátky NF-01 a následné inkubace s prasečím antisérem proti myším imunoglobulinům označeným fluorescein-izo-thio-kyanátem nedocházelo u testovaných buněčných typů několika druhů k zobrazení intermediálních filament vimentinového, gliového i keratinového typu. Mikrotubuly ani mikrofilamenta odlišitelné svojí charakteristickou lokalizací a citlivostí ke kolcemidu a cytochalasinu B s protilátkou NF-01 nereagovaly .

Myší lymfocýtární hybridom NF-01 je uložen ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze pod označením IMG CZAS NF-01.

Příklad

Za účelem pomnožení buněk hybridomů NF-01 v podmínkách in vivo bylo aplikováno IxlO⁶ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovanýcn buněk, byla myš 14 dnů před přenosem buněk hybridomů ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml peritoneálně). Po 14 dnech růstu hybridomů v peritoneální dutině byla myš usmrcena a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 2,0 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 3,0 mg/ml imunoglobulinu. Specificita získané protilátky byla testována na zmražených řezech lidského mozku, a to jak v nepřímé imunofluorescenci s využitím prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu značné fluorescein-izo-thiokyanátem a imunoperoxidázovou reakcí s prasečí protilátkou proti myšímu Ig označenou křenovou peroxidázou (ÚSOL, Praha), tak i po elektroforetickém přenosu tkáňového lyzátu připraveného z lidského mozku na nitrocelulózovou membránu s následnou detekcí nepřímým imunoperoxidázovým testem (viz výše). Výsledky jsou shrnuty v tabulce č. 2 a 3.

Tabulka 2

Reaktivita protilátky NF-01 s normálním lidskými tkáněmi (+ pozitivita, - negativita,

V-vimentín, D-desrain, G-GFAP, N-pro^einy neurofilament, K-keratiny).

Tkáň Typ stř. filament Reakce

Mozeček, neurony Mozeček, astrocyty

CS 264 946 Bl

Tabulka 2 pokračováni

Tkáň	Typ	stř. filament	Reakce
Mícha, neurony		N	+
Mícha, astrocyty		G	-
Ependymální buňky		V	-
Vazivo a cévy měkké pleny		V + D	-
Jazyk - epitel, žlázky		K	-
Jazyk - svalovina, cévy		D,V	-
Jazyk - vazivo		V	-
Jazyk - periferní nervy		N
Rectum - epitel		K	-
Rectum - svalovina, cévy		V,D	-
Rectum - vazivo		V	-
Rectum - periferní nervy		N	+1
Pankreas - endokrimní parenchyn	K	-
Pankreas - exokrinní perenchyn	K	-
Pankreas - cévy, vazivo		V + D	-
Pankreas - periforní nervy		N
Trachea - epitel, žlázky		K	-
Trachea - cévy, vazivo		V + D
Trachea - chrupavka		V	-
pozn. 1 - zmražené řezy int-	ί , i vnější reakce
) u 1 k a 3
Reaktivita protilátky NF-01	s nádory	lidského centrálního nervového :
ta, - negativita, K-keratin,	. V-vimentin, G-GFAP, N-	-proteiny neurofil.
Nádor	Typ	stř. filament	Reakce
Papilární ependymom		K,V	-
Meduloblastom		V,N	-
Astrocytom		G, V	-
Ganglioyliom		G,N	+ 1
Meingeom		V	-

- v gangliové části

Z výsledků uvedených v tabulce č. 2 a 3 je zřejmé, že protilátka NF-01 reaguje výhradně s lidskými proteiny neurofilament. Úzká specificita protilátky byla potvrzena v imunoblotingu, kde byla nalezena silná reakce s 210 kDa proteinem přičemž ostatní testované cytoskeletální proteiny byly negativní (viz. tab. č. 4).

Tabulka 4

Reaktivita protilátky NF-01 s cytoskeletálními proteiny z lidského mozku (+ reaktivita,

- negativita)

Cytoskeletální protein

Reakce v imunoblotingu alfa-tubulin beta-tubulin vimentin

CS 264 946 Bl

Tabulka 4 pokračování

Cytoskeletální protein Reakce v imunoblotingu

proteiny neurofilament - 68	kDa	-
- 160	kDa	-
- 210	kDa	+
GFAP		-

Specificita získané protilátky byla dále testována na panelu buněk z tkáňových kultur, a to jak v nepřímé imunofluorescenci s využitím prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu značené fluorescein-izo-thiokyanátem, tak i po elektroforetickém přenosu buněčných lyzátů na nitrocelulózovou membránu s následnou detekcí nepřímým imunoperoxidázovým testem. Výsledky jsou shrnuty v tabulce č. 5.

Tabulka 5

Reaktivita protilátky NF-01 s buňkami různých linií (V-vimentin, K-keratiny, N-proteiny neurofilament, IF-imunofluorescence, IB-imunobloting)

Druh	Tkáňový původ	Název	Typ interm. filament	Reakce
IF	IB
člověk	plícnx fibroblast	LED	V	-	-
	kaulatobuněčný karcinom	U1280	Κ + N	+	+
	epidermoidní karcinom	A 431	K
myš	fibroblast	3T3 Swiss	V	-	-
	neuroektoderm	C 1300	N	-	-
krysa	gliom	C6	G + V	-	-

Buňky hybridomu NF-01 mají morfologický obraz typických myelomových buněk. V podmínkách in vitro rostou v podobě polosuspenzních kultur. Základním kultivačním médiem je RPMI doplněné L-glutaminem (3mM), penicilinem, streptomycinem, gentamycinem a inaktivovaným koňským sérem. Hybridom je kultivován při 37 °C, střední generační čas je 18,5 hodiny a modální počet chromosomů 7 měsíců po sestrojení hybridomu byl 79. Produkovaná protilátka je myší monoklonální imunoglobulin třídy IgM.

Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem NF-01 reaguje specificky s lidským 210 kDa proteinem neurofilament na formaldehydem fixovaných histologických řezech zalitých parafinem a je tedy využitelná ve všech histopatologických laboratořích za použití různých testů imunohistochemických, enzymoimunologických, imunofluorescenčních, imunoblotingu.

Kromě lékařské praxe je využitelná v oblasti teoretického výzkumu lidských intermediálních filament.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Myší lymfocytární hybridom IMG C-ZAD NF-01 produkující monoklonální protilátku třídy IgM proti lidskému 210 kDa proteinu neurofilament.