CS264946B1 - Myší lymfocytární hybridom NF-01 produkující protilátku proti 210 kDa proteinu neurofilament - Google Patents
Myší lymfocytární hybridom NF-01 produkující protilátku proti 210 kDa proteinu neurofilament Download PDFInfo
- Publication number
- CS264946B1 CS264946B1 CS883398A CS339888A CS264946B1 CS 264946 B1 CS264946 B1 CS 264946B1 CS 883398 A CS883398 A CS 883398A CS 339888 A CS339888 A CS 339888A CS 264946 B1 CS264946 B1 CS 264946B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- neurofilament
- antibody
- hybridoma
- mouse
- cells
- Prior art date
Links
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 title description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 3
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 3
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 3
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010831 Cytoskeletal Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037414 Cytoskeletal Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100021238 Dynamin-2 Human genes 0.000 description 2
- 101000817607 Homo sapiens Dynamin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N (-)-demecolcine Chemical compound C1=C(OC)C(=O)C=C2[C@@H](NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N Demecolcine Natural products C1=C(OC)C(=O)C=C2C(NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010014967 Ependymoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 102000012411 Intermediate Filament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061998 Intermediate Filament Proteins Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001020 neural plate Anatomy 0.000 description 1
- 208000014500 neuronal tumor Diseases 0.000 description 1
- 201000000393 papillary ependymoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000003777 tissue processing method Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Řešení se týká myšího lymfocytárníbo
hybridomu, produkujícího protilátku proti
lidskému 210 kDa proteinu neurofilament,
uloženého ve sbírce hybridomů Ostavu molekulární
genetiky ČSAV v Praze pod označením
IMG CZAS NF-01. Samotná monoklonální
protilátka hybridomu NF-01 je vhodná pro
použití v enzymoimunologické a radioimunologické
analýze, testování tkání, buněk a
tělních tekutin, jakož i pro vizualizaci
210 kDa proteinu neurofilament v buňkách
na úrovni optického a elektronového mikroskopu
a i imunohistochemického průkazu
210 kD a proteinu neurofilament na tkáňových
řezech.
Description
(57) Řešení se týká myšího lymfocytárníbo hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému 210 kDa proteinu neurofilament, uloženého ve sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze pod označením IMG CZAS NF-01. Samotná monoklonální protilátka hybridomu NF-01 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýze, testování tkání, buněk a tělních tekutin, jakož i pro vizualizaci 210 kDa proteinu neurofilament v buňkách na úrovni optického a elektronového mikroskopu a i imunohistochemického průkazu 210 kD a proteinu neurofilament na tkáňových řezech.
DQ (O
OT (O
CS 2
CS 264 946 Bl
Vynález se týká myšího lymfocytárního hybridomu NF-01 produkujícího monoklonální protilátku proti 210 kDa proteinu neurofilament.
Doposud se protilátky obecně vyrábějí imunizací zvířat tak, že je antigen opakovaně aplikován zpravidla spolu s adjuvans pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům, morčatům, prasatům či kozám. Sérum takto imunizovaných zvířat se odebírá po určité době působení antigenu a slouží jako zdroj protilátek, které se používají pro diagnostiku a léčbu řady onemocnění, ale i pro studium výskytu a funkce těchto antigenů v buněčné patofyziologii. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu, které je nutné ze sér odstraňovat složitým způsobem zvaným vysycování. V případě antisér proti proteinům neurofilament je situace komplikována jejich značnou vzájemnou podobností, takže připravit konvenční antisérum proti jedinému proteinu neurofilament vysycováním je pracné. Výrobní šarže konvenčních antisér se proto dají jen velmi nesnadno standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit značně čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám č· proti podobným molekulám, jako je např. vimentin, desmin nebo keratiny.
Tyto nedostatky jsou odstraněny použitím hybridomu produkujícího homogenní monoklonální protilátku proti 210 kDa proteinu neurofilament podle vynálezu.
Tento myší lymfocytární hybridom NF-01 byl získán způsobem známým z odborné literatury (Kohler G., Milstein C.: Continuous cultures of fused cells sergeting antibody of predefined specifity, Nátuře 256:495, 1975; Galfré G., Howe S. C., Milstein C., Butcher G. W., Howard J. C.: Antibodies to major histocompatibility antigen produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266:550, 1977; Fazekas de St. Groth S., Scheidigger D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth. 35:1 až 21, 1980) klonováním souboru hybridních buněk vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie Sp 2/0 a buněk získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných izolovaných cytoskeletálním preparátem získaným z prasečího mozku.
Výhodou myšího lymfocytárního hybridomu NF-01 je, že se váže na cílovou strukturu neurofilament, která je stabilní i při relativní drastické fixaci lidského materiálu formaldehydem a následném zalití do parafinu, což je rutinně používaná fixace histologického materiálu ve všech histopatologických laboratořích. Jiné v zahraničí známé protilátky např. protilátka proti proteinům neurofilament fy Labsystems, Helsinki, Finsko, reagují na obdobně připravených řezech až po enzymovém natráveni nebo vyžadují šetrnější speciální fixaci. Žádné z protilátek proti lidskému 210 kDa proteinu neurofilament produkovaných dosud popsanými hybridomy nemají schopnost reagovat na parafinových, nenatrávených řezech. Protilátka NF-01 dává velmi dobré výsledky i na mražených tkáňových řezech. Tabulka č. 1 ukazuje sílu reakce protilátky NF-01 při použití různých způsobů zpracování tkáně:
Tabulka 1
Intenzita reakce protilátky NF-01 na tkáňových řezech fixovaných třemi různými způsoby (++ silná reakce, - nereaktivita).
Použitá fixace metanol/aceton metakarn formaldehyd
Příprava tkáně zmražené parafinované parafinované
Výsledná reakce ++ ++ ++
Výsledky ukazuji, že tato protilátka může být využita na všech patologických odděleních pro rutinní diferenciální diagnostiku k odlišení nádorů pocházejících z neuronů.
CS 264 946 Bl
Hybridom NF-01 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro pěstování živočišných buněk nebo v podmínkách in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Hybridom NF-01 je vhodný k dlouhodobému uchovávání v konzervách uložených v kapalném dusíku. Produkci monoklonální protilátky je možno zahájit po rozmražení buněčné konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu. Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem NF-01, reaguje s lidským 210 kDa proteinem neurofilament a nereaguje s žádným dalším proteinem středních filament ani s dalšími lidskými buněčnými bílkovinami, jak bylo zjištěno imunoblotingem, enzymoimunologickým testem, nepřímou imunoperoxidázou a nepřímou imunofluorescenční metodou.
Průkaz této specifičnosti byl získán po elektroforetickém přenosu rozsáhlého spektra buněčných a tkáňových lysátů a preparátů izolovaného cytoskeletu různých lidských tkání a buněčných linií, a to po separaci bílkovinných komponent v polyakrylamidovém gelu v prostředí dodecylsulfátu sodného za redukujících podmínek. Po přenosu rozdělených bílkovin na nitrocelulózovou membránu byl 210 kDa protein neurofilament specificky vizualizován (detekován) s použitím NF-01 a následně prasečího antiséra proti myším imunoglobulinům konjugovaného s křenovou peroxidázou (OSOL, Praha). Jako pozitivní kontrola sloužila monoklonální protilátka proti proteinům neurofilament od firmy Labsystems, Helsinki, Finsko, která dávala obdobné výsledky.
Pomocí imunoperoxidázové reakce na tkáňových řezech lidských tkání, kterou potvrzovaly i výsledky dosažené při nepřímé imunofluorescentní metodě, byla u protilátky NF-01 zjištěna reaktivita na výběžcích gangliových buněk míšních a kůry mozečku.
V nepřímé imunofluorescenci využívající protilátky NF-01 a následné inkubace s prasečím antisérem proti myším imunoglobulinům označeným fluorescein-izo-thio-kyanátem nedocházelo u testovaných buněčných typů několika druhů k zobrazení intermediálních filament vimentinového, gliového i keratinového typu. Mikrotubuly ani mikrofilamenta odlišitelné svojí charakteristickou lokalizací a citlivostí ke kolcemidu a cytochalasinu B s protilátkou NF-01 nereagovaly .
Myší lymfocýtární hybridom NF-01 je uložen ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze pod označením IMG CZAS NF-01.
Příklad
Za účelem pomnožení buněk hybridomů NF-01 v podmínkách in vivo bylo aplikováno IxlO6 buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovanýcn buněk, byla myš 14 dnů před přenosem buněk hybridomů ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml peritoneálně). Po 14 dnech růstu hybridomů v peritoneální dutině byla myš usmrcena a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 2,0 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 3,0 mg/ml imunoglobulinu. Specificita získané protilátky byla testována na zmražených řezech lidského mozku, a to jak v nepřímé imunofluorescenci s využitím prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu značné fluorescein-izo-thiokyanátem a imunoperoxidázovou reakcí s prasečí protilátkou proti myšímu Ig označenou křenovou peroxidázou (ÚSOL, Praha), tak i po elektroforetickém přenosu tkáňového lyzátu připraveného z lidského mozku na nitrocelulózovou membránu s následnou detekcí nepřímým imunoperoxidázovým testem (viz výše). Výsledky jsou shrnuty v tabulce č. 2 a 3.
Tabulka 2
Reaktivita protilátky NF-01 s normálním lidskými tkáněmi (+ pozitivita, - negativita,
V-vimentín, D-desrain, G-GFAP, N-pro^einy neurofilament, K-keratiny).
Tkáň Typ stř. filament Reakce
Mozeček, neurony Mozeček, astrocyty
CS 264 946 Bl
Tabulka 2 pokračováni
| Tkáň | Typ | stř. filament | Reakce |
| Mícha, neurony | N | + | |
| Mícha, astrocyty | G | - | |
| Ependymální buňky | V | - | |
| Vazivo a cévy měkké pleny | V + D | - | |
| Jazyk - epitel, žlázky | K | - | |
| Jazyk - svalovina, cévy | D,V | - | |
| Jazyk - vazivo | V | - | |
| Jazyk - periferní nervy | N | ||
| Rectum - epitel | K | - | |
| Rectum - svalovina, cévy | V,D | - | |
| Rectum - vazivo | V | - | |
| Rectum - periferní nervy | N | +1 | |
| Pankreas - endokrimní parenchyn | K | - | |
| Pankreas - exokrinní perenchyn | K | - | |
| Pankreas - cévy, vazivo | V + D | - | |
| Pankreas - periforní nervy | N | ||
| Trachea - epitel, žlázky | K | - | |
| Trachea - cévy, vazivo | V + D | ||
| Trachea - chrupavka | V | - | |
| pozn. 1 - zmražené řezy int- | ί , i vnější reakce | ||
| ) u 1 k a 3 | |||
| Reaktivita protilátky NF-01 | s nádory | lidského centrálního nervového : | |
| ta, - negativita, K-keratin, | . V-vimentin, G-GFAP, N- | -proteiny neurofil. | |
| Nádor | Typ | stř. filament | Reakce |
| Papilární ependymom | K,V | - | |
| Meduloblastom | V,N | - | |
| Astrocytom | G, V | - | |
| Ganglioyliom | G,N | + 1 | |
| Meingeom | V | - |
- v gangliové části
Z výsledků uvedených v tabulce č. 2 a 3 je zřejmé, že protilátka NF-01 reaguje výhradně s lidskými proteiny neurofilament. Úzká specificita protilátky byla potvrzena v imunoblotingu, kde byla nalezena silná reakce s 210 kDa proteinem přičemž ostatní testované cytoskeletální proteiny byly negativní (viz. tab. č. 4).
Tabulka 4
Reaktivita protilátky NF-01 s cytoskeletálními proteiny z lidského mozku (+ reaktivita,
- negativita)
Cytoskeletální protein
Reakce v imunoblotingu alfa-tubulin beta-tubulin vimentin
CS 264 946 Bl
Tabulka 4 pokračování
Cytoskeletální protein Reakce v imunoblotingu
| proteiny neurofilament - 68 | kDa | - |
| - 160 | kDa | - |
| - 210 | kDa | + |
| GFAP | - |
Specificita získané protilátky byla dále testována na panelu buněk z tkáňových kultur, a to jak v nepřímé imunofluorescenci s využitím prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu značené fluorescein-izo-thiokyanátem, tak i po elektroforetickém přenosu buněčných lyzátů na nitrocelulózovou membránu s následnou detekcí nepřímým imunoperoxidázovým testem. Výsledky jsou shrnuty v tabulce č. 5.
Tabulka 5
Reaktivita protilátky NF-01 s buňkami různých linií (V-vimentin, K-keratiny, N-proteiny neurofilament, IF-imunofluorescence, IB-imunobloting)
| Druh | Tkáňový původ | Název | Typ interm. filament | Reakce | |
| IF | IB | ||||
| člověk | plícnx fibroblast | LED | V | - | - |
| kaulatobuněčný karcinom | U1280 | Κ + N | + | + | |
| epidermoidní karcinom | A 431 | K | |||
| myš | fibroblast | 3T3 Swiss | V | - | - |
| neuroektoderm | C 1300 | N | - | - | |
| krysa | gliom | C6 | G + V | - | - |
Buňky hybridomu NF-01 mají morfologický obraz typických myelomových buněk. V podmínkách in vitro rostou v podobě polosuspenzních kultur. Základním kultivačním médiem je RPMI doplněné L-glutaminem (3mM), penicilinem, streptomycinem, gentamycinem a inaktivovaným koňským sérem. Hybridom je kultivován při 37 °C, střední generační čas je 18,5 hodiny a modální počet chromosomů 7 měsíců po sestrojení hybridomu byl 79. Produkovaná protilátka je myší monoklonální imunoglobulin třídy IgM.
Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem NF-01 reaguje specificky s lidským 210 kDa proteinem neurofilament na formaldehydem fixovaných histologických řezech zalitých parafinem a je tedy využitelná ve všech histopatologických laboratořích za použití různých testů imunohistochemických, enzymoimunologických, imunofluorescenčních, imunoblotingu.
Kromě lékařské praxe je využitelná v oblasti teoretického výzkumu lidských intermediálních filament.
Claims (1)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZUMyší lymfocytární hybridom IMG C-ZAD NF-01 produkující monoklonální protilátku třídy IgM proti lidskému 210 kDa proteinu neurofilament.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS883398A CS264946B1 (cs) | 1988-05-19 | 1988-05-19 | Myší lymfocytární hybridom NF-01 produkující protilátku proti 210 kDa proteinu neurofilament |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS883398A CS264946B1 (cs) | 1988-05-19 | 1988-05-19 | Myší lymfocytární hybridom NF-01 produkující protilátku proti 210 kDa proteinu neurofilament |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS339888A1 CS339888A1 (en) | 1988-12-15 |
| CS264946B1 true CS264946B1 (cs) | 1989-09-12 |
Family
ID=5373917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS883398A CS264946B1 (cs) | 1988-05-19 | 1988-05-19 | Myší lymfocytární hybridom NF-01 produkující protilátku proti 210 kDa proteinu neurofilament |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS264946B1 (cs) |
-
1988
- 1988-05-19 CS CS883398A patent/CS264946B1/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS339888A1 (en) | 1988-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4350683A (en) | Antibody production from hybrid cell line | |
| US4965198A (en) | Monoclonal antibody and method of manufacturing hybridoma producing the same | |
| JPH05304979A (ja) | モノクローナル抗体 | |
| US11953504B2 (en) | Antibody specifically binding to bovine pregnancy-associated glycoprotein 1 and use thereof | |
| Dreyer et al. | Tissue specific nuclear antigens in the germinal vesicle of Xenopus laevis oocytes | |
| EP0161638A2 (en) | Monoclonal antibody and method for quantitation of immoglobulins using the same | |
| US5147783A (en) | Methods to screen for ovarian cancer and myocardial infarction | |
| EP0311383B1 (en) | Monoclonal antibody to methamphetamine, preparation of the same, assay method and assay kit of methamphetamine | |
| DE3688204T2 (de) | Monoklonaler antikoerper gegen ein p21-bezuegliches dodekapeptid des ras-onkogens. | |
| Schaart et al. | Baby hamster kidney (BHK-21/C13) cells can express striated muscle type proteins | |
| KR910008637B1 (ko) | 심근 미오신 중사슬에 대한 단일클론항체 | |
| EP0245520B1 (en) | Monoclonal antibody against glutathione s-transferase and its use in the diagnosis of cancer | |
| KR0138534B1 (ko) | 프로좀 단백질에 대한 단일항체의 제조방법 및 그를 이용한 프로좀과 관련된 현상의 검출 및 질병의 진단법 | |
| CS264946B1 (cs) | Myší lymfocytární hybridom NF-01 produkující protilátku proti 210 kDa proteinu neurofilament | |
| JP5058403B2 (ja) | Ｃｋ−ｍｂ活性測定法およびｃｋ−ｍｂ活性測定試薬 | |
| CN106771216B (zh) | 提高免疫试剂检测特异性的方法及其应用 | |
| CS264947B1 (cs) | Myší lymfocytární hybridom GF-01 produkující protilátku proti gliovému kyselému proteinu středních filament | |
| EP0193935B1 (en) | Method for determining human prolyl 4-hydroxylase by immunoassay | |
| EP0307186B1 (en) | Anti-ganglioside GD1a monoclonal antibody MZ, MZ-producing cells and MZ-containing reagent | |
| US4962032A (en) | Anti-lafora body monoclonal antibody | |
| JPS63222699A (ja) | 単クローン性抗体及びこれを用いるシユードウリジンψの測定法 | |
| JPS63258493A (ja) | 抗ガングリオシドｇｍ↓１単クロ−ン性抗体、これを産生する細胞及びこれから成る試薬 | |
| JP2635946B2 (ja) | 抗ガングリオシドＧＤ１ａ単クローン性抗体ＭＺを産生する細胞 | |
| EP0535084A1 (en) | Improved ascites production of monoclonal antibodies using an immunosuppressive anti-cd4-related antibody | |
| CS245849B1 (cs) | Myší lymfocytární hydridom IMG CZAS VI-01 |