CS264947B1 - Myší lymfocytární hybridom GF-01 produkující protilátku proti gliovému kyselému proteinu středních filament - Google Patents

Abstract

Řešení ,$e týká lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému gliovému kyselému proteinu středních filament, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze pod označením IMG CZAS GF-01. Samotná monoklonální protilátka hybridomů GF-01 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýze, k testování tkání, buněk a tělních tekutin, jakož i pro vizualizaci gliového kyselého proteinu v buňkách na úrovni optického a elektronového mikroskopu a i imunohistochemického průkazu gliového kyselého proteinu na tkáňových řezech.

Description

Vynález se týká myšího lymfocytárního hybridomu GF-01 produkujícího monoklonální protilátku třídy IgM proti lidskému gliovému kyselému proteinu středních filament (GFAP).

Doposud se protilátky obecně vyrábějí imunizací zvířat tak, že je antigen opakovaně aplikován zpravidla spolu s adjuvans pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům, morčatům prasatům či kozám. Sérum takto imunizovaných zvířat se odebírá po určité době působení antigenu a slouží jako zdroj protilátek, které se používají pro diagnostiku a léčbu řady onemocnění, ale i pro studium výskytu a funkce těchto antigenů v buněčné patofyziologii. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu, které je nutné ze sér odstraňovat složitým způsobem zvaným vysycování. V případě antisér proti proteinům středních filament je situace komplikována jejich značnou vzájemnou podobností, takže připravit konvenční antisérum proti jedinému proteinu středních filament vysycováním je pracné. Výrobní šarže konvenčních antisér se proto dají jen velmi nesnadno standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit značně čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám či proti podobným molekulám, jako je např. vimentin, desmin nebo keratiny.

Tyto nedostatky jsou odstraněny použitím hybridomu produkujícího zcela homogenní monoklonální protilátku proti kyselému proteinu gliálních středních filament (GFAP) podle vynálezu .

Tento myší lymgocytární hybridom GF-01 byl získán způsobem známým z odborné literatury (Kohler G., Milstein C.: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specifity, Nátuře 256:495, 1975: Galfré G., Howe S. C., Milstein C., Butcher G. W., Howard J. C.: Antibodies to major histocompatibility antigen produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266:550, 1977; Fazekas de St. Groth S., Scheidigger D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immuol. Meth. 35: 1-21, 1980) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie Sp 2/0 a buněk získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných izolovaným cytoskeletálním preparátem' získaným z prasečího mozku.

Výhodou myšího lymfocytárního hybridomu GF-01 je, že se váže na cílovou strukturu GFAP, která je stabilní i při relativní drastické fixaci lidského materiálu formaldehydem a následném zalití do parafinu, což je rutinně používané fixace histologického materiálu ve všech histopatologických laboratořích. Jiné v zahraničí známé protilátky např. anti GFAP protilátka fy Labsystems, Helsinki, Finsko reagují na obdobně připravených řezech až po enzymovém natrávení nebo vyžadují šetrnější speciální fixaci. Žádné z protilátek proti lidskému kyselému proteinu gliálních středních filament produkované dosud popsanými hybridomy nemají schopnost reagovat na parafinových, nenatrávených řezech. Protilátka GF-01 dává velmi dobré výsledky i na mražených tkáňových řezech. Tabulka č. 1 ukazuje sílu reakce protilátky GF-01 při použití různých způsobů zpracování tkáně:

Tabulka 1

Intenzita reakce protilátky GF-01 na tkáňových řezech fixovaných třemi různými způsoby (+ středně silná reakce, ++ silná reakce, - nereaktivita)

Použitá fixace metanol/aceton metakarn formaldehyd

Příprava tkáně zmražené parafinované parafinované

Výsledná reakce + ++ ++

Výsledky ukazují, že tato protilátka muže být využita na všech patologických odděleních pro rutinní diferenciální diagnostiku k odlišení nádorů pocházejících z gliových buněk.

CS 264 947 Bl

Hybridom GF-01 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro pěstování živočišných buněk nebo v podmínkách in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Hybridom GF-01 je vhodný k dlouhodobému uchovávání v konzervách uložených v kapalném dusíku. Produkci monoklonální protilátky je možno zahájit po rozmražení buněčné konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu. Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem GF-01, reaguje s lidským GFAP a nereaguje s žádným proteinem středních filament ani s dalšími buněčnými bílkovinami, jak bylo zjištěno imunoblotingem, enzymoimunologickým testem, nepřímou imunoperixidázou a nepřímou imunofluorescenční metodou. Průkaz této specifičnosti byl získán po elektroforetickém přenosu rozsáhlého spektra buněčných a tkáňových, lysátů a preparátů izolovaného cytoskeletu různých lidských tkání a buněčných linií, a to po separaci bílkovinných komponent v polyakrylamidovém gelu v prostředí dodecylsulfátu sodného za redukujících podmínek. Po přenosu rozdělených bílkovin na nitrocelulózovou membránu byl GFAP specificky vizualizován (detekován) s použitím GF-01 a následně prasečího antiséra proti myším imunoglobulinům konjugovaného s křenovou peroxidázou (ÚSOL, Praha). Jako pozitivní kontrola sloužila monoklonální protilátka proti GFAP od firmy Labsystems, Helsinki, Finsko, která dávala obdobné výsledky.

Pomocí imunoperoxidázové reakce na tkáňových řezech lidských tkání, kterou potvrzovaly i výsledky dosažené při nepřímé imunofluorescentní metodě, byla u protilátky GF-01 zjištěna reaktivita s astrocyty a jejich modifikacemi v mozku a míše. Pozitivní reakce byla též prokázána v buňkách astrocytomů a ependymomů. V nepřímé imunofluorescenci využívající protilátky GF-01 a následné inkubace s prasečím antisérem proti myším imunoglobulinům označeným fluorescein-izo-thio-kyanátem nedocházelo u testovaných buněčných typů několika druhů k zobrazení intermediálních filament vimentinového, neutrálního i keratinového typu. Nebyla též prokázána reaktivita s buňkami gliomu krysy. Mikrotubuly ani mikrofilamenta odlišitelné svojí charakteristickou lokalizací a citlivostí ke kolcemidu a cytochalasinu B s protilátkou GF-01 nereagovaly. Rovněž nereagovaly ostatní struktury testovaných buněk s výjimkou nematinových struktur u 3T3 buněk, které mohou být totožné nebo podobné GFAP (Willingham M.

C., Richert W. D., Rutterford A. V.: Experimental Cell Research 171: 285-295, 1987). Tento pozitivní nález však v žádném případě nemůže vést k záměně v identifikaci třídy intermediálních filament, nebot jde o zcela odlišné struktury.

Myší lymfocytární hybridom GF-01 je uložen ve sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze pod označením IMG CZAS GF-01.

Příklad

Za účelem pomnožení buněk hybridomů GF-01 v podmínkách in vivo bylo aplikováno 1x10^ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dnů před přenosem buněk hybridomů ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml peritoneálně). Po 12 dnech růstu hybridomů v peritoneální dutině byla myš usmrcena a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 2,5 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 2,5 mg/ml imunoglobulinu. Specificita získané protilátky byla testována na zmražených řezech lidského mozku, a to jak v nepřímé imunofluorescenci s využitím prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu značené fluorescein-izo-thiokyanátem a imunoperoxidázou reakcí s prasečí protilátkou proti myšímu Ig značenou křenovou peroxidázou (ÚSOL, Praha), tak i po elektroforetickém přenosu tkáňového lyzátu připraveného z lidského mozku na nitrocelulózovou membránu s následnou detekcí nepřímým imunoperoxidázovým testem (viz výše). Výsledky jsou shrnuty v tabulce č. 2.

Tabulka 2

Reaktivita protilátky GF-01 s normálními lidskými tkáněmi (+ pozitivita, - negativita,

V-vimentin, D-desmin, G-GFAP, N-proetiny neurofilament, K-keratiny).

CS 264 947 Bl

Tabulka 2 pokračování

Tkáň	Typ	stř.	filament	Reakce
Mozek, astrocyty		G	+ v	+
Mozeček, astrocyty.	Ber.
glie		G	+ v	+
Mozek, neurony		N		-
Mozeček - gangliové	buňky	N		-
Mícha, astrocyty		G	+ v	+
Buňky, pojivá		V		-

Buňky periferních nervových

pletení		N		v		-
Epitel močového	měchýře	Kí		18'	19	-
Jazyk		V	+	D	+ K	-
Játra		K	+	V		-
Kůže		K	+	V		-
štítná žláza		v	+	K	+ D	-
Cévy		v	+	D		-

Z výsledků uvedených v tabulce č. 2 je zřejmé, že protilátka GF-01 reaguje výhradně s lidským kyselým gliovým fibrilárním proteinem. Úzká specificita protilátky byla potvrzena v imunoblotingu, kde byla nalezena silná reakce s GFAP, přičemž ostatní testované cytoskeletální proteiny byly negativní (víz tabulka č. 3).

Tabulka 3

Reaktivita protilátky GF-01 s cytoskeletálními proteiny z lidského mozku (+ reaktivita,

- negativita)

Cytoskeletální protein Reakce v. imunoblotingu alfa-tubulin beta-tubulin vimentin proteiny neurofilament

GFAP +

Specifita získané protilátky byla dále testována na panelu buněk z tkáňových kultur, a to jak v nepřímé imunofluorescenci z tkáňových kultur, a to jak v nepřímé imunofluorescenci s využitím prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu značené fluorescein-izo-thiokyanátem, tak i po elektroforetickém přenosu buněčných lyzátů na nitrocelulózovou membránu s následnou detekcí nepřímým imunoperoxidázovým testem. Výsledky jsou shrnuty v tabulce č. 4.

Tabulka 4

Reaktivita protilátky GF-01 s buňkami různých linií (V-vimentin, K-keratiny, N-proteiny, neurofilament, IF-imunofluorescence, IB-imunobloting)

Druh Tkáňový původ Název Typ interm. Reakce filament IF IB

LEP V -^X člověk plicnl fibroblast kulatobuněčný karcinom

U 1280

CS 264 947 Bl

Tabulka 4 pokračování

Druh	Tkáňový původ	Název	Typ interm. filament	Reakce IF IB
	epidermoidní karcinom	A 431	K	-
myš	fibroblast	3T3 Swiss	V	x
	neuroektoderm	C 1300	N	-
krysa	gliom	C6	G + V

x pozitivita nematinových struktur

Buňky hybridomu GF-01 mají morfologický obraz typických myelomových buněk. V podmínkách in vitro rostou v podobě polosuspenzních kultur. Základním kultivačním médiem je RPMI doplněné L-glutaminem (3mM), penicilinem, streptomycinem, gentamyci-nem a inaktivovaným koňským sérem. Hybridom je kultivován při 37 °C, střední generační čas je 19 hodin a modální počet chromosomů 7 měsíců po sestrojení hybridomu byl 76. Produkovaná protilátka je myší monoklonální imunoglobulin třídy IgM.

Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem GF-01 reaguje specificky s lidským gliovým kyselým fibrilárním proteinem i na formaldehydem fixovaných histologických řezech zalitých parafinem a je tedy využitelná ve všech histopatologických laboratořích za použití různých testů ímunohistochemických, enzymoimunologických, imunofluorescenčních, imunoblotingu. Kromě lékařské praxe je využitelná v oblasti teoretického výzkumu lidských intermediálních filament.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS GF-01, produkující monoklonální protilátku třídy IgM proti lidskému glíovému kyselému proteinu středních filament.