CS235850B1 - Myší lymfocitární hybridom produkující protilátku proti lidskému -transferinu - Google Patents

Abstract

Vynález se týká myšího lymfocitárního hybridonu, produkujícího protilátku proti lidskému transferinu, uloženo ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární ge - netiky ČSAV pod označením HTP - 04. Samotná monoklonální protilátka hybridonu HTP - 04 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýza a při vizualizaci receptorů pro transferin na úrovni optického a elektronového mikroskopu. Směs protilátek HTP ©4, HTP 06 a HTP 14 je použitelná pro precipitaČní testy.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj, hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie P3-X63-Ag.0653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti lidskému transferinu.

Doposud se protilátky, proti transferinu vyrábějí tak, že je transferin opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům a prasatům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigepu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvantitativní stanovení plasmatického transferinu metodou jednoduché radiální imunodifuze. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek,. jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu; ty je nutné ze sér odstraňovat vysycováním. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti lidskému transferinu, uložený ve Sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňské ul. 1003, pod označením IMG CZAS HTF-04.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury /Fazekas de St.Groth, S,,Scheidigger,D,: Production of monoclonal antibodies: Stratedy and tactics, 3, Immunol, Meth.,35:1-21, 1900; Galfré,G,, Howe,S,C,, Milstein, C,, Butcher,G.W,, Howard,3.C,: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, <· 3 —

235 850

Nátuře 266:550, 1977/ klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie P3-X63-Ag8,653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizo* váných lidským transferinem.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv, protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidským transferinem. Hybridám HTF-04 je možné kultivovat in vitro v mediích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konserv, uchovávaných v kapalném dusíku je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem HTF-04, je specifická výhradně pro lidský transferin a není třeba se zbavovat protilátek balastních.

Příklad:

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo s aplikováno 2 x 10 buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 16 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem /0.5 ml intraperitoneálně/. Po 14 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a naprodukovaná asci tická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 4.Θ ml ascitické tekutiny, která obsahovala 12 mg/ml imunoglobulinů, Proti látka reagovala se specifickým antigenem v enzymoimunologickém testu /při použití prasečí antimyší protilátky značené 7 křenovou peroxidázou/ až do ředění 1:10 , Za pomoci nepřímé imunofluorescenční techniky byl takto získanou protilátkou detekován receptor pro transferin na lidských myelomových buňkách. Směs protilátek HTFO4, HTF 06 a HTF 14 je použitel ná pro precipitační testy.

235 850

Buňky hybridomu HTF-04 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových puněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyríbosomy, In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním mediem je Eaglovo minimální esenciální medium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin /3 mM/, pyruvát sodný /1 mM/. Toto médium /označované jako H-MEMd, Ostav molekulární genetiky ČSAV/, je pro kultivaci hybridomu HTF-04 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem /0,05 mM/ pufrem HEPES /10mM/ a inaktivovaným bovinním sérem /Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%/. Hybridom je kultivován při 37°C. Střední generační čas je 13,1 hod. a 12 měsíců po sestrojení byl modální počet ohromosomů 82, Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtrídy IgG1, kappa typu,

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem HTF-0 reaguje specificky s lidským transferinsm,

Hybridom HTF-04 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti transferinu v metodách analytických nebo preparativních.

Claims (1)

1. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS HTF-04, produkující monoklonální protilátku podtřídy IgG1 proti lidskému transferinu.