CS248383B1 - Myši lymfocytárni hybridem IMG CZAS MEM-09 - Google Patents

Abstract

Řešeni se týká myšího lymfocytárního hybridami, produkujícího protilátku proti lehkánu řetězci typu kappa lidských imunoglobulinů, uloženého ve sbírce hybridomů ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MEM-09. Monoklonální protilátka hybridami MEM-09 je vhodná pro použití v radioimunologické, nepřímé enzymoimunologické a imunofluorescenční analýze a pro čištění afinitní chronatografií lidských imunoglobulinů obsahujících lehké řetězce typu kappa.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myěí myelomové linie Sp2/O-Agl4 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti kappa lehkým řetězcům lidských imunoglobulinů.

Doposud se protilátky proti lehkým řetězcům imunoglobulinů vyrábějí tak, že kappa řetězce imunoglobulinu jsou opakovaně injikovány jako antigen pokusným zvířatům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvantitativní stanovení kappa řetězců imunoglobulinu v séru nebo na lymfoidních nebo leukemickcých buňkách metodou radlolmunologické analýzy nebo nepřímé imunofluorescenční analýzy.

Tento postup, nazývaný konvenčni imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu.

Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit čistý imuni2ační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridou, produkující monoklonální protilátku proti kappa řetězcům lidského imunoglobulinu, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1083, pod označením IMG CZAS MEM-09.

Uvedený hybridem byl získán způsobem známým z odborné literatury /Fazekas de St. Groth, S., Scheidegger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactlcs, J. Immunol. Meth., 35:1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. : Antibodies to major histoccmpatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře,

266:550, 1977/ klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelaitové linie Sp2/O-Agl4 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c imunizovaných lidským imunoglobulinem.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s kappa lehkými řetězci lidských imunoglobulinů. Hybridom MEM-09 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c.

Z konzerv uchovávaných v kapalném dusíku je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka produkovaná hybridomem MEM-09 reaguje specificky jak s lidským imunoglobulinem, tak s populacemi lidských B buněk nesoucích jako složku buněčné membrány kappa řetězce imunoglobulinové molekuly a není třeba se zbavovat protilátek balastních.

Přikladl

Za účelem pannožení hybridcmových buněk in vivo bylo aplikováno 5 x 10® buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk byla myš 10 dní před, přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem /0,5 ml intraperitoneálně/. Po 14 dnech růstu hybridomu v peritoneální dtuině byla myš zabita a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána.

Celkem bylo získáno 1,5 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 10 mg/ml imunoglobulinu.

Protilátka reagovala se specifickým antigenem /lidským imunoglobulinem/ v enzymoimunologickém testu /při použití prasečí antimyší protilátky značené křenovou peroxidázou/ až do ředění

Monoklonální protilátka reagovala specificky v nepřímém imunofluorescenčním nebo enzymoimunologickém testu s částí lymfocytů periferní krve. Oběma metodami bylo zjištěno 15 až 20 * pozitivních buněk v enzymolmunologickém testu až do řešení ascitické plazmy lilO⁴ a v testu nepřímo fluorescence až do ředění 1:1θ\ Při použití čištěných populací τ _a b iymfoeytú byla zjištěna reaktivita protilátky MEM-09 s 50 až 60 % B lymfocytů a 1 % T lymfocytů. Negativní byly monocyty, granulocyty a erytrhocyty.

Příklad 2

Ze 2 ml ascitické tekutiny obsahující protilátku MEM-09 byla připravena globulinová frakce precipitací síranem amonným a navázána na 2 ml CNBr-aktivované Sepharosy 4B. Na 1 ml kolonku připravenou z tohoto imunosorbentu bylo naneseno 0,5 ml lidského séra a po promytí 10 ml fyziologického roztoku byl specificky adsorbovaný antigén vymyt celkem 2,5 ml 0,1 M glycin-HCl pufru pH 2,2 a eluát byl ihned neutralizován 1 M fosfátovým pufrem pH 7,2.

Celkový výtěžek byl 4 mg imunoglobulinu, jehož identita a čistota byla prokázána elektroforetickými metodami. Preparát obsahoval převážně IgG a poskytoval v dvojité imunodifuzi v agarosovém gelu preclpitační linii s králičím antisérem proti lidským kappa řetězcům, ale nikoli s antisérem proti lambda řetězcům /Sevac, Praha/.

Po 3x opakovaném nanesení původního vzorku séra na regenerovanou kolonku imunosorbentu /regenerace provedena prostým převedením do neutrálního fyziologického roztoku až se z imunosorbentu již žádný antigén nevymýval/ jsme získali nenavázanou část séra, která již neposkytovala precipitační linii s antisérem proti kappa řetězcům, ale precipitovala s antisérem proti lambda řetězcům.

Po SDS PAGE lidského séra nebo antigénu izolovaného afinitní chromatografií na imobilizované protilátce MEM-09 a převedení separovaných komponent na nitrocelulózu se enzyraoimunologicky barvila výrazně komponenta o relativní molekulové hmotnosti 26 000. Všechny tyto výsledky souhlasí se závěrem, že protilátka MEM-09 reaguje s determinantou na lehkých řetězcích imunoglobulinů typu kappa.

Buňky hybridomu MEM-09 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. Cytoplazma obsahuje velké množství polyriboscmů, mitochondrie a slabě vyvinuté endoplasmatické retikulum. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin /3 mM/, pyruvát sodný /1 mM/.

Toto médium /označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV/ je pro kultivaci hybridcmu MEM-09 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem /0,05 mM/, pufrem HEPES /10 mM/ a inaktivovaným bovínním sérem /Bioveta, Ivanovice na Hané,

V·

Hybridem je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 17,2 hod. a 10 měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 94. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGl s lehkými řetězci typu kappa, její isoelektrický bod je pH 5,8 až 6,3.

Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem MEM-09 reaguje specificky s kappa lehkými řetězci lidských imunoglobulinů.

Hybridem MEM-09 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti lehkým řetězcům typu kappa lidských imunoglobulinů v metodách analytických anebo preparativních.

Monoklonální protilátka hybridomu MEM-09 může být využita pro analytické stanovení lidských imunoglobulinů s lehkým řetězcem typu kappa /v séru nebo jiných tělních tekutinách/ nebo ke kvantitativnímu stanovení subpopulace B lymfocytů nebo typu leukemických buněk nesoucích lehké řetězce kappa typu imunoglobulinů při klinické diagnostice ve zdravotnických zařízeních, zvláště při poruchách imunologického systému a nádorových onemocněních.

imobilizované monoklonální protilátky může být použito k čištění kappa řetězce lidských imunoglobulinů pomocí afinitní chromatografie.

Claims (1)

1. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS MEM-09 produkující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti kappa řetězcům lidských imunoglobulinů.