CS222780B1 - Myší lymfocytámí hybridem - Google Patents

Abstract

Vynález se týká myšího lymfocytámího hybridomu IMGCZAS PTF-02, produkujícího protilátku podtřídy IgGl proti prasečímu transferinu, uloženého ve sbírce hybridami} Ústavu molekulární genetiky ČSAV. Samotná monoklonální protilátka hybridomu PTF-02 je vhodná pro použití v radioimunoanalyse nebo enEymolmunoandlyse·

Description

(54) Myší lymfocytámí hybridem

Vynález se týká myšího lymfocytámího hybridomu IMGCZAS PTF-02, produkujícího protilátku podtřídy IgGl proti prasečímu transferinu, uloženého ve sbírce hybridami} Ústavu molekulární genetiky ČSAV.

Samotná monoklonální protilátka hybridomu PTF-02 je vhodná pro použití v radioimunoanalyse nebo enEymolmunoandlyse·

222 780

- 1 222 780

Vynález se týlcá nového hybridorau, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúzí myší myelomové buněčné linie P5-X63-Ag8.653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti prasečímu transferinu.

Dosud se protilátky proti transferinu vyrábějí tak jako protilátky proti jiný» plasmatickým bílkovinám, t j. transferin je injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům, prasatům nebo ovcím. Sérum těchto zvířat, odebrané po určidobě působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek užívá ných v diagnostice, zejména při kvantitativní analyse koncentrace transferinu v plasmě nebo jiných tělních tekutinách. Tento postup, nazývaný konvenční imunisací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se projevuje značně heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v Každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří vedle protilátek vůči Žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátuj ty je nutné ze sér odstraňovat složitým způsobem, zvaným vysycování. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Z toho plyne nutnost srovnávání výsledků s velkým počtem standardů antigenu v diagnostických metodách, postavených na konvenčních sérech. Pro výrobu každé šarže séra je třeba připravit značně čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výše zmíněného dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti prasečímu transferinu, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská ul. Č. 108 j pod označením ILíG-HAS PTF-02.

- 2 222 780

Uvedený hybridom byl získán způsobem znáním z odborné literatury /Fazekas de, St., Groth', S., Scheidigger, D.: Production of mono cl ona 1 antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth., 55:1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Sutchar,

G.Í., Howard, J.C.; Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Naturs 266:550, 1977/ klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí myší myelomové linie P5-X63/Ag6.655 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene Balb/c, imunizovaných prasečím transferinem.

Výhodou hybridomu je, 2c produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s prasečím transferinem. Hybridom PTF-02 je možné, kultivovat in vitro v m/diích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině .myší kmene 3alb/c. 2 lconserv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkcí protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem PTF-02, je specifická výhradně pro transferin a není třeba se zbavovat protilátek balastních.

Příklad provedení

2a účelem pomnožení buněk hybridomu PTF-02 in vivo a získání protilátky jím produkované bylo aplikováno 1x10$ buněk hybridomu do peritoneální dutiny myši kmene Salb/c, která byla 7 dní před injikovéním buněk hybridomu iritována 0,5 ml parafinového oleje podaného intraperitoneálně. Po 24 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a z peritoneální dutiny odebráno celkem 4,5 ml ascitické tekutiny. Ascitická tekutina obsahovala podle elektroforetické analýzy 10 mg/ral imunoglobulinu nesoucího protilátkovou aktivitn. Aktivita protilátky byla měřena enzymoímunologickým testem s prasečím transferinem v pevné fázi a prasečí anti-myší protilátkou značenou křenovou peroxidázou. Positivní reakce byla pozorována až do ředění ascitické tekutiny 1:10^. Využitelnost protilátky produkované hybridomem PTF-02 pro imunoprecipitační reakce byla déle testovaná tak, že ascitická tekutina hybridomu PTF-02 byla smísena ve stejných objemech s ascitickými tekutinami hybridomů PTF-01 a PTF-05. Směs těchto tří tekutin obsahujících jednotlivé monoklonální protilátky proti prasečímu transferinu poskytovala precipitát s prasečím transferinem

-3«ί ?

ve dvojité imunodifuzi v agarovém gelu.

222 780

Buňky hybridoau PTF-02 mají ultrastrukturální obraz typických njyelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyribosomy. In vitro rostou jako polosupenzní kultury. Základním kultivačním m/diera je Eaglovo minimální esenciální mé&ium s Hanksovou solnou směsí a doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin /5 mM/, pyruvát sodný /1 mil/. Toto medium /označované jako H-MEÍid, Ústav molekulární genetiky , ČSAV/, je pro kultivaci hybridomu PTF-02 doplněno penicilinem, streptomyciňem, gentamyčinem, 2-merkaptostanolem /0.05 mM/ pufrem HEPES Λ0 mtl/ a inaktivovaným bovinním sérem /Bioveta, Ivanovice na Hané, 10 %/. Hybridom je kultivován při 37°C. Střední generační čas je 18.5 hod. a půl roku po sestrojení byl modální počet chromosomú 85. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGl.

Specifičnost protilátky byla ověřena křížovou reakcí s transferiny člověka, koně a ovce metodou enzymoimunologické analysy. Reakce protilátky, produkované hybridomem PTF-02 byla nulová. Podobně bylo ověřeno, že protilátka nereaguje s transferinem myším.

Pro sestrojení hybridomu PTF-02 byl použit známý postup, spočívající ve fúzi myelomových buněk s buňkami z imunní sleziny pod vlivem polyethylenglykolu o molekulové hmotnosti 1500 s následnou selekcí v m/diu, obsahujícím hypoxanthin, aminopterin a thymidin. Po identifikaci protilátky produkujících populací hybridních buněk byly tyto populace opakovaně klonovány v polotekutém agaru a testovány na produkci specifické protilátky.

Hybridom PTF-01 může být průmyslově využíván jako zdroj protilátky proti prasečímu transferinu v metodách analytických nebo preparativních. Samotná monoklonální protilátka hybridomu PTF-02 je vhodná pro použití v radioimunoanalyse nebo enzymoimunoanalyse.

Pro svou jednoduchost je výhodné metoda radiální ímunodifúze v gelu. V této metodě se protilátka hybridomu PTF-02 dá

- 4 222 780 použít ve spojení s protilátkami hyhridomů PTF-01 a PTF-03.

Směs těchto tří monoklonálních protilátek poskytuje s prasečím transferinem typický imunní precipitát. Precipitační linie nebo prstence získané v gelu jsou ostřejší než linie a prstence, zís kané pomocí konvenčního séra proti prasečími transferinu.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Myší lymfocytárnf hybridom IMGeAS PIF-02, produkující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti prasečím transferinu.