CS222779B1 - Myší lymfocytární hybridom - Google Patents

Abstract

Vynález se týká myšího lymfocytáraího hybridomu IMGCZAS PTF-01, produkujícího protilátku prasečímu transferinu podtřídy IgGl, uloženého ve sbírce hybridoraů Ústavu molekulární genetiky ČSAV. Samotná monoklonální protilátka hybridomu PTF-01 je vhodná pro použití v radioimunoanalýse a nebo enzymoimunoanalyse.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúzí myší myelomové buněčná linie P3-K63-Ag8.653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti prasečímu transferinu.

Dosud se protilátky proti transferinu vyrábějí tak jako protilátky proti jiným plasmatickým bílkovinám, tj. transferin je injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům, prasatům nebo ovcím. Sérum těchto zvířat, odebrané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek užívaných v diagnostice, zejména při kvantitativní analyse koncentrace transferinu v plasmě nebo jiných tělních tekutinách. Tento postup, nazývaný konvenční imunisací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se projevuje značně heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří vedle protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu; ty je nutné ze sér odstraňovat složitým způsobem, zvaným vysycování. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Z toho plyne nutnost srovnávání výsledků s velkým počtem standardů antigenu v diagnostických metodách, postavených na konvenčních sérech. Pro výrobu každé šarže séra je třeba připravit značně čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výše zmíněného dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti prasečímu transferinu, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňské ul. č. 1US3 pod označením IMG OCAS PTF-O1.

- 2222 77β

Uvedený hybridom byl získán způsobem znaným z odborné literatury /Fazekss de, St., Groth, S., Scheidigger, D.: Froduction of raonoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Iinmunol.

Meth., 35:1-21, 1980j Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to major histocompatibility antigens piOduced by hybrid cell lineš, Náturo 266:550, 1977/ klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí myší myelemové linie P>-Xč3/AgS.65> a buněk, získaných ze sleziny myší kmene Balb/c, imunizovaných prasečím transferinem.

Výhodou hybridomů je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s prasečím transferinem. Hybridom PTF-01 je možné kultivovat xn vitro v mediích vhodných pro živočišné buňky β jo adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině rnyší kmene Balb/c. 2 konserv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem PTF-01, je specifická výhradně pro transferin a není třeba se zbavovat protilátek balastních.

Příklad provedení

2a účelem pomnožení buněk hybridomů PTF-01 in vivo a získání protilátky jím produkované bylo aplikováno 1,5 x 10° buněk hybridomů do peritoneální dutiny myši kmene Balb/c, která byla 14 dní před injikováním buněk hybridomů iritována 0,5 ml parafinového oleje podaného intraperitoneálně. Po 18 dnech růstu hybridomů v peritoneální dutině byla myš zabita a z peritoneální dutiny odebráno celkem 3 ml ascitické tekutiny. Ascitická tekutina obsahovala podle elektiOforetické analýzy 7,7 mg/ml imunoglobulinu nesoucího protilátkovou aktivitu. Aktivita protilátky byla měřena enzymoimunologiclíým testem s prasečím transferinem v pevné fázi a prasečí anti-myší protilátkou značenou křenovou peroxidázou. Positivní reakce byla pozorována až do ředění ascitické tekutiny 1:10^. Využitelnost protilátky produkované hybridomem PTF-02 pro imunoprecipitační reakce tyla dále testována tak, že ascitická tekutina hybridomů PTF-01 byla smísena ve e tejných objemech s ascitickými tekutinami hybridomů PTF-02 a xTF-03. Směs těchto tří tekutin obsahujících jednotlivé mono- 3 222 779 klonální protilátky proti prasečímu transferinu poskytovala precipitát s prasečím transferinem ve dvojité imunodifuzi v azurovém gelu.

Buňky hybridomu PTF-01 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyribosomy. In vitro rostou jako polosuspcnzní kultury. Základním kultivačním mediem je Eaglovo minimální esenciální m/dium s Hankcovou solnou smésí a doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin />mM/, pyruvát sodný A mM/. Toto medium /označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV/, je pro kultivace hybridomu PTF-01 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem /0,05 mM/ pufrem HEPES /10 mlú/ a inaktivovaným bovinním sérem /Bioveta, Ivanovice na Hané, 10 %/. Hybridom je kultivován při 27°C. Střední generační Čas je 18,8 hod. a půl roku po sestrojení byl modální počet chromosomů 92. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGl.

Specifičnost protilátky byla ověřena křížovou reakcí s trans feriny člověka, koná a ovce metodou enzymoi imunologické analysy. Reakce piOtilátky, produkované hybridomem PTF-01 byla nulová. Podobné bylo ověřeno, že protilátka nereaguje s transferinem qysím.

Pro sesti‘ojení hybridomu PTF-01 byl použit znaný postup, spo Sívající ve fúzi myelomových buněk s buňkami z imunní sleziny pod vlivem polyethylenglykolu o molekulové hmotnosti 1500 s následnou selekcí v mediu, obsahujícím hypoxanthin, aminopterin a thymidin.· Po identifikaci protilátky produkujících populací hybridních buněk byly tyto populace opakovaně klonovány v polotekutérn agaru a testovány na produkci specifické protilátky⁷.

Hybridom PTF-01 může být průmyslové využíván jako zdroj protilátky proti prasečímu transferinu v metodách analytických nebo preparativních. Samotná monoklonální protilátka hybridomu PTF-01 je vhodná pro použití v radioimunoanalýse nebe enzymcimunoanalýse.

-4 223 779

Pro svou jednoduchost je výhodné metoda radiální imunodifúze v gelu· V této metodě se protilátka hybridomů PTF-01 dá použít ve spojení s protilátkami hybridomů PTF-02 a PTF-O3· Směs těchto tří monoklonálních protilátek poskytuje s prasečím transferinem typický imunní precipitét. Precipitační linie nebo prstence získané v gelu jsou ostřejší než linie a prstence, získané pomocí konvenčního séra proti prasečímu transferinu.

Claims (1)

1. Myší lymfocytární hybridom IKíGíZAS PTF-01, produkující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti prasečímu transferinu.