CS239761B1 - Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS T3-01 produkující protilátku proti trijodtyroninu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti trijodtyroninu, uloženého ve sbírce hybridomů ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením IMG CZAS T3-01. Monoklonální protilátka.hybridomu T3-01 je vhodná pro použití v raaioimunologické analýze a v imunohistochemickém vyšetřování mikroskopických preparátů štítné žlázy.

Description

(54) Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS T3-01 produkující protilátku proti trijodtyroninu

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti trijodtyroninu, uloženého ve sbírce hybridomů ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením IMG CZAS T3-01. Monoklonální protilátka.hybridomu T3-01 je vhodná pro použití v raaioimunologické analýze a v imunohistochemickém vyšetřování mikroskopických preparátů štítné žlázy.

V

Vynález se týká nového hybridomů, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie FO a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti trijodtyroninu.

Doposud se protilátky proti trijodtyroninu vyrábějí tak, že konjugát trijodtyroninu s bílkovinou, jako je sérový albumin nebo imunoglobulin, je opakovaně podáván jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům.

Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antlgenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvantitativní stanovení plasmatického trijodtyroninu metodou radioimunologické analýzy.

Tento postup nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu růzhé a neopakovatelné.

Organismus zpravidla vytvoří protilátky, které vedle trijodtyroninu reagují slabě též s tyroxlnem, reverzním trijodtyroninem, dijodtyroninem, monojodtyroninem a dalšími deriváty tyroninu.

Výrobní šarže kovenčních sér se dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit konjugát trijodtyroninu s bílkovinou v co nejvyšší čistotě.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridům produkující monoklonální protilátku proti trijodtyroninu, uložený ve Sbír,ce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, vídeňská č. 1083, pod označením IMG CZAS T3-01.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury /Fazekas de St. Groth S., Scheidiggéř D: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and taotics. J. Immunol. Meth. 35, 1 až 21, 1980, Galfré G., Howe S. C., Milstein C., Butcher G. W., Howard J. C.: Antibodies to major histooompatlbility antigens produced by hybrid cell lineš. Nátuře 266, 550, 1977/.

Imunizace myší kmene Balb/c byla provedena opakovaným podáním konjugátu trijodtyroninu s hovězím imunoglobulinem připraveným metodou podle Ghariba /Gharib H., Ryen R. J., Mayberry W. E., Hookert T.: Radioimmunoassay | for triiodthyronine /T₃/.

I. Affinity and specifity of the antibody for T^. J. Clin. Endocr. Metab. 33, 509 až 516, 1971/. V tomto konjugátu bylo na molekulu bílkoviny navázáno 17 zbytků trijodtyroninu. Hybridní buňky vznikly fúzí buněk myší myelomové linie FO a buněk ze sleziny myší imunizovaných konjugátem trijodtyroninu s hovězím imunoglobulinem.

Selekce hybridomů bylo dosaženo testováním supernatantů buněčných kultur jednotlivých hybridních populací radioimunologlckou metodou /Nedvídková J., Felt V.: Radioimunologioká stanovení trijodtyroninu v séru. Cas. Lék. čes. 120, 1565, 1981/.

Výhodou hybridomů je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s trijodtyroninem. Hybridom T3-01 je možno kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene Balb/c.

Z konzerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu a Imunizace zvířat. Protilátka produkovaná hybridomem T3-01 reaguje pouze s trijodtyroninem, nereaguje s tyroxlnem, reverzním trijodtyroninem a ani s dijodtyroninem.

Příklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 2,5 χ 10⁶ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, bylo myším podáno po 0,5 ml parafinového oleje intraperitoneálně 10 dnů před aplikací hybridomu.

Po 12 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byly myši zabity a odebrána ascitická tekutina. Bylo získáno průměrně 4,2 ml ascitické tekutiny z jedné myši. Ascitická tekutina obsahovala 3 až 4 mg/ml imunoglobulinu.

Imunoglobulin byl z ascitické tekutiny izolován metodou podle Hořejšího a Smetany /Hořejší J., Smetana R.: 0 vlivu rivanolu na plazmatické bílkoviny. Chem. Listy 48. 756 až 764, 1954/ a pro další použití upraven do roztoku o koncentraci 5,3 mg/ml ve fyziologickém roztoku a konzervován přídavkem azidu sodného.

Specifita monoklonální protilátky T3-O1 byla ověřena radioimunologickou metodou /Nedvíd ková J., Felt V.: Radioimunologické stanovení trijodtyroninu v séru. Čas. Lék. čs. 120,

1565, 1981/.

Komplex antigen-protilátka byl vysrážen pomocí vysokomolekulárního polyetylenglykolu m.h. 6000. ¹⁷^I-trijodtyronin byl užit v maáarské provenienci /Ústav pro izotopy maáarské akademie věd/. 0,1 ml T3-01 protilátky ředěné veronalovým pufrem na koncentraci 80 umol/1 125 váže 50 % 66 pg , I-trijodtyroninu.

Monoklonální protilátka T3-01 v koncentraci 14 nmol/1 je schopna detekovat 10 nmolů trijodtyroninu ve vzorku. Ascitační konstanta vazby trijodtyroninu byla vypočtena podle Jacobse /Jacobs S., chang K. J., Cuatrecasas P.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 66,687,

1975/ a je 3,9 x 1O⁷ 1/mol.

Monoklonální protilátka T3-01 vykazovala specifickou reakci s trijodtyroninem v metodě nepřímé imunohistochemické enzymoimunodetekce s mikroskopickými preparáty připravenými z lidské štítné žlázy. Protilátka dávala pozitivní reakci ještě v koncentraci 15 ^ug/ml.

Buňky hybridomu T3-01 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. Cytoplazma obsahuje velké množství polyribosomů, mitochondrie a endoplazmatické retikulum.

In vitro rostou jako polosuspenzní kultury.

Základním kultivačním médiem je RPMI 1640, které je pro kultivaci hybridomu T3-01 doplněné o L-glutamin /2 mmol/1/, pyruvát sodný /1 mM/, penicilín, streptomycin, gentamycin, pufr HEPES /11 mM/ a inaktivované hovězí sérum /Bioveta, Ivanovice na Hané, 10 %/.

Hybridom je kultivován při 37 °C v inkubátoru s atmosférou obsahující 5 % oxidu uhličitého. Střední generační čas je 13,4 h. 4 měsíce po sestrojení byl modální počet chromozomů 89. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGl, s lehkými řetězci typu X. ,

Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem T3-01 reaguje v radioimunologické metodě pozitivně s trijodtyroninem, nemá měřitelnou křížovou reakci s reverzním trijodtyroninem, dijodtyroninem. Křížová reaktivita s tyroxinem je menší než 0,5 %.

Hybridom T3-01 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti trijodtyroninu. Monoklonální protilátka proti trijodtyroninu může sloužit k analytickému stanovení trijodtyroninu při výrobě farmaceutických přípravků nebo v endokrinologickém výzkumu.

Další možné použití monoklonální protilátky proti trijodtyroninu je v imunohistochemii štítné žlázy. Obraz po vizualizaci protilátky v mikroskopickém preparátu konjugátem anti-myší protilátky s peroxidasou ukazuje obsah a relativní rozložení trijodtyroninu v závislosti na aktuálním stavu štítné žlázy.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Myší lymfocytární hybridom IMG CZAST3-O1, produkující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti trijodtyroninu.