CS263122B1 - Myší lymfocytární hybridorn produkující protilátku pr >ti lidskému alfa-1'etoproteinu - Google Patents

Abstract

idomů, produkujícího protilátku proti lidokému alfa-fetoproteinu, uloženého ve sbírce hybridomů Uatavu molekulární genetiky ČSAV pod označením IMG CZAS AFP-ll. Samotná .monoklonální protilátka hybridomů AFP-ll je vhodná pro použití v radioimunologické analýze ke stanovení ulfa-fctoprotuinu a v sendvičovém enzymoimunologickém testu v kombinaci c jinými monoklonálními protilátkami přepravenými v Ústavu molekulární genetiky ČSAV (AFP-01 nebo AFi’-O.>) ke stanovení koncentrace lidského alfa-fetonroteinu.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O-Ag14 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti lidskému alfa-fetoprotéinu.

Protilátky proti alfa-fetoproteinu se mohou vyrábět tak, že alfa-fetoprotein je opakovaně injikovánjako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvantitativní stanovení plasmatického alfa-fetoproteinu metodou radioimunologické nebo enzymoimunoanalytické analýzy. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality.

Nevýhodu konvenčních sér proti alfa-fetoproteinu v principu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je namířena proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridom^ je pravděpodobné, že se z něho podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která je namířená proti určité antigentfí determinantě molekuly lidského alfa-fetoproteinu. Znamená to, že mohou být konstruovány klony molekulárních protilátek proti různým antigenním determinantám řetězce molekuly alfa-fetoproteinu. Výhodnost získání monoklonálních protilátek proti několika antigenním determinantám je hlavně v možnosti využití kombinací protilátek namířených proti různým deter263 122

-Z minantám ke zvýšení citlivosti analytických testů pro stanovení alfa-fetoproteinu v tělních tekutinách. Tento přístup, tj. příprava hybridomů produkujících monoklonální protilátky specificky rozeznávající alfa-fetoprotein, byl použit několika autory (např· Tsung, Y.-K., Milunsky, A·, Alpert, E.: Derivation and characterization of a monoclonal hybridoma antipody specific for human alfa-fetoprotein,

J. Immunol. Meth. 39:363oř368, 1980; Stenman, U.H., Sutinen, M.L., Selander, R.K., Tontti, K., Schroder, J.: Characterization of a monoclonal antibody to human alpha-fetoprotein and its use in affinity chromátography, J. Immunol. Meth. 46:337«345, 1981; Uotila, M., Ruoslahti, E., Engkvall, E.: Two-site eandwich enzyme immunoassay with monoclonal antibodies to human alpha-fetoprotein, J. Immunol. Meth. 42:

11«15, 1981;. Hunter, W.M., Bennie, J.G., Brock, D.J.H.,

Van Heyningen, V.: Monoclonal antibodies for use in an immunoradiometric assay for oc-foetoprotein, J. Immunol. Meth. 50:133oř144, 1982; Van Heyningen, V., Barron, L., Brock, D.J.H., Crichton, D., Lawrie, S.: Monoclonal antibodies to human Ot-foetoprotein: analysis of the behaviour of three different antibodies, J. Immunol. Meth. 50: 123«ř131, 1982). Bylo též popsáno použití sendvičového enzymoimunologického testu s využitím dvou monoklonálních protilátek ke stanovení koncentrací alfa-fětoproteinu v biologických vzorcích (Uotila a spol., viz výše uvedená citace). Tato metoda má výhodu v tom, že při ní není potřeba používat vysoce čištěného radioaktivně značeného antigenu, že je rychlá a jednoduchá. Monoklonální protilátky použité pro sestavení sendvičového enzymoimunologického testu autory Uotila a spol, byly získány ze supernatantů tkáňových kultur hybridomů, v nichž jsou koncentra ce monoklonálních protilátek velmi nízké. Uvedenými autory byly pozorovány nepříznivé nespecifické efekty neředěného lidského séra, které byly odstraněny, teprve ředěním vzorků 1:10.

Tyto nevýhody odstraňuje použití monoklonální protilátky produkované hybridomem uloženým ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1083 pod

263 12?

označením IMG CZAS AFP-11. Tento hybridom dobře roste jak ve tkáňové kultuře in vitro, tak in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALIV c, takže je možno v ascitické tekutině produkovat za ekonomicky výhodných podmínek velké množství monoklonální protilátky· Monoklonální protilátku AFP-11 je možno použít v kombinaci s jinými monoklonálními protilátkami (AFP-O1 nebo AFP-O3) připravenými v Ústavu molekulární genetiky ČSAV k sestavení sendvičového enzymoimunologického testu· V tomto uspořádání se neprojevují nepříznivé vlivy způsobené neředěnými vzorky lidského séra.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth. 35:1dř21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to major h.istocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266:550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie Sp2/0-Ag14 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných lidským alfa-fetoproteinem.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidským alfa-fetoproteinem. Hybridom AFP-11 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konzerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem AFP-11 , reaguje s lidským alfa-fetoproteinem a není třeba se zbavovat protilátek balast nich.

Příklad 1

Za účelem pomnožení hybridoraových buněk in vivo bylo aplikováno 5 x 10^ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní

-Λ 263 122 před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0.5 ml intraperitoneálně). Po 10 dnech růstu hybridomu v peritoneólnl dutině byla myě zabita a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 2 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 3,5 mg/ml imunoglobulinu. Protilátka AFP-11 reagovala se specifickým antigenem (lidským alfa-fetoproteinem) v enzymoiraunologickém testu (při použití prasečí antimyěí protilátky značené křenovou peroxidázou) až do ředění 1:10^ a v radioimunologickém precipitačním testu (při použití králičího antiséra proti myšímu imunoglobulinu a polyethylenglykolu k precipitaci komplexů antigen-moc noklonální protilátka) až do ředění 1:1(r. Monoklonální protilátku AFP-11 bylo možno použít ke stanovení alfa-fetoproteinu pomocí precipitačního radioimunologického testu v oboru koncentrací 5-200 ng^ml, při použiti ascitické tekutiny ředěné 1:10⁵.

Příklad 2

Monoklonální protilátku AFP-11 bylo možno použít pro stanovení koncentrace alfa-fetoproteinu v sendvičovém enzymoimunologickém testu v kombinaci s jinými monoklonálními protilátkami proti alfa-fetoproteinu (AFP-01 nebo AFP-03), a to s použitím imobilizované protilátka AFP-11 a protilátky AFP-01 nebo AFP-03 konjugované s peroxidázou, nebo s použitím iaobilizované protilátky AFP-01 a protilátky AFP-11 konjugované s peroxidázou.

Příslušná monoklonální protilátka (AFP-11 nebo AFP-01) byla částečně čištěna z ascitické tekutiny srážením nasyceným roztokem síranu amonného do 50% nasycení, neředěna fyziologickým roztokem na koncentraci 50dt200/Ug/ml a imobilizována adsorpcí na povrch jamek polystyrénových kultivačních destiček s plochým dnem (1 h při 37°C). Po promytí jamek fyziologickým roztokem byla zbývající adsorpčně. aktivní místa na polystyrénovém povrchu jamek blokována inkubací s roztokem želatiny ve fyziologickém roztoku (2 h, 37°C). Vzorky standardu lidského séra (0,1 ml) obsahující známé koncentrace alfa-fetoproteinu

- !$ 263 12?

(Oa2OO ng/ml) byly inkubovány v takto připravených jamkách 16 h při 4°C a po promytí fyziologickým roztokem bylo přidáno 0,1 ml roztoku konjugátu příslušné monoklonální protilátky (AFP-01, AFP-03 nebo AFP-11) s peroxidázou (fmeíodou^ popsanou v odborné literatuře (Tijssen, P., Kurs tak, E.:

Highly efficient and simple met hod s for the preparation of peroxidase and active peroxidase-antibody conjugates for enzyme immunoassays, Anal. Biochem. 136:451«457, 1984), naředěn na koncentraci 10«100/Ug/ml v 50% hovězím séru ve fyziologickém roztoku). Po 2 h inkubaci při 4°C byly jamky promyty fyziologickým roztokem, bylo přidáno 0,1 ml substrátového roztoku (0.1% roztok o-diaminobenzen dichloridu v 0,1 U fosfátovém pufru pH 6,0 obsahujícím 0,02% peroxid vodíku) a po 10«20 minutách byla chromogenní enzymatická reakce zastavena přidáním 0,1 ml 2 M roztoku kyseliny sírové a byla změřena intenzita vzniklého zabarvení spektrofotometrií při 492 nm (OD^^). Jako negativní srovnávací vzorek, k němuž byly získané hodnoty vztahovány, byl použit standard lidského séra neobsahující žádný alfa-fetoprotein detekovatelný komerční rádioimunologickou soupravou. Typické hodnoty OD^^ byly 0,05«r0,2 pro vzorky obsahující 10 ng/ml alfa-fetoproteinu a O,7zž1,2 pro vzorky obsahující 100 n^ml, v závislosti na použité imobilizované monoklonální protilátce, na použitém konjugátu monoklonální protilátky s peroxidázou a na jeho ředění. Tyto hodnoty ukazují, že s využitím uvedených monoklonálních protilátek lze sestavit sendvičový enzymoimunologický test, použitelný pro stanovení koncentrací alfa-fetoproteinu v diagnosticky žádoucím oboru koncentrací (alespoň>10 ng/ml).

Buňky hybridomů AFP-11 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou'solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3 mM), pyruvát sodný (1 iaM). Toto médium (označené jako RFMI, Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomů AFP-11 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0,05 mM), pufrem

-6 263 122

HBPES (kyselina N- (2-hydroxyethyl) piperazin-N *-2-ethansulfonová) (10 mM) a inkativovaným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%)· Hybridom je kultivován při 37°C. Střední generační čas je 20,2 hod· Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGl s lehkými řetězci typu K , její isoelektrický bod je v rozmezí pH 5,7*6,O.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybrid omem AFP-11 ’··» * reaguje specificky s lidským alfa-fetoproteinem.

Hybridom AFP-11 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti lidskému alfa-fetoproteinu v metodách analytických nebo preparativních.

Monoklonální protilátka hybridomu AFP-11 může být využita pro analytické stanovení alfa-fetoproteinu při klinické diagnostice ve zdravotnických zařízeních, zvláště pro diagnézu nádorových onemocnění (hepatomy, teratomy atd.) nebo kongenitální malformace (rozštěp páteře - spina bifida plodu).

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS AFP-11, vyznačující se tím, že produkuje monoklonální protilátku podtřídy I IgGl proti lidskému alfa-fetoproteinu.