CS228858B1 - Myší lymfocytární hybridom produkující protilátku proti prasečímu imunoglobulinu 6 - Google Patents

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúzí myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a myší slezině lymfoidní buňky, produkující protilátku proti prasečímu imunoglobulinu G.

Doposud se protilátky proti imunoglobulinu G vyrábějí tak, že je imunoglobulin G opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům nebo koním. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebrané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvalitativní nebo kvantitativní analýzu imunoglobulinu ve výzkumu a v imunodiagnostické praxi. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu; ty je nutné ze sér odstraňovat vysycováním. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti prosečímu imunoglobulinu G, uložený ve sbírce hybridomů Ostav molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1083, pod označením IMG CZAS PGG-05.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth., 35 : 1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, ]. C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266 : 550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí myši myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene Balb/ /c, imunizovaných prasečím imunoglobulinem G.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s prasečím imunoglobulinem G. Hybridom PGG-05 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene Balb/c. Z konzerv, uchovánaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu.

Příklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 1,5 X 10® buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 15 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,4 ml intraperitoneálně). Po 18 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 6,0 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 9 mg/ml imunoglobulinu. Ascitická tekutina obsahující produkt hybridomu PGG-05 byla smíšena ve stejných objemech s ascitickou tekutinou obsahující produkt hybridomu PGG-02. Směs těchto dvou monoklonálních protilátek poskytovala precipitát s prasečím imunoglobulinem G ve dvojité imunodifúzi v agarovém gelu.

Buňky hybridomu PGG-05 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyribosomy. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovoi solnou směsí a doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3 mMj, pyruvát sodný (1 mMj. Toto médium (označované jako H-MEMd, Ostav molekulární genetiky ČSAVJ, je pro kultivace hybridomu PGG-05 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoethanolem (0,05 mMj pufrem HEPES (10 mMj a inaktivovaným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%). Hybridom je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 16,6 hod. a 8 měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 87. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGl.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem PGG-05 poskytuje ve směsi s monoklonální protilátkou produkovanou hybridomem PGG-02 precipitát s prasečím imunoglobulinem G a též s fragmentem Fc prasečího imunoglobulinu G. Fc fragment získaný limitovanou enzymatickou hydrolýzou trypsinem je složen z C-koncových polovin polypeptidického řetězce y, tj. těžkého řetězce imunoglobulinu G. Fc fragment obsahuje pouze konstantní části řetězce χ, které charakterizují imunoglobulin třídy G. Precipitace fragmentu Fc je důkazem, že monoklonální protilátka produkovaná hybridem PGG-05 je zaměřena proti antigenní determinantě lokalizované v části molekuly imunoglobulinu tvořící Fc fragment.

Hybridom PGG-05 může být průmyslově využíván jako zdroj protilátky proti prasečímu imunoglobulinu G v metodách analytických nebo preparativních. Protože protilátka je specifická pro konstantní část těžkého řetězce imunoglobulinu G, může sloužit k identifikaci imunoglobulinu třídy G a k jeho kvantitativní analýze. Ve směsi s monoklonální protilátkou PGG-02 se dá použít pro kvantitativní analýzu metodou radiální imunodifúze v gelu. Další možné použití je ve funkci druhé protilátky, tj. protilátky piOti protilátce v imunochemických a imunologických metodách v případech, kdy prvá protilátka je konvenční protilátka připravená imunizací pokusných prasat. V imunohistologických a imunohistochemických metodách využívajících optického nebo elektronového mikroskopu se použije monoklonální protilátka samotná po konjugaci s fluorescenčními látkami, enzymy, feritinem nebo biotinem. Pro vytvoření precipitátu druhou protilátkou, například v radioimunoanalýze, nebo pro vytvoření zákalu, například v imunoefelometrii, se použije monoklonální protilátka PGG-05 ve směsi s monoklonální protilátkou PGG-02.

Claims (1)

1. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS PGG-05, produkující monoklonální protilátvynalezu ku podtřídy IgGl proti prasečímu imunoglobulinu.