CS233810B1 - Myší lymfocytární hybridom produkující protilátku proti praseSímu a lidskému insulinu - Google Patents

Abstract

Vynález se týká myáího lymfocytárního hybridomů, produkujícího protilátku proti praseSímu a lidskému insulinu, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod oznaSením IN-05. Samotná monoklonální protilátka hybrodmu IN-05 je vhodná pro použití v enzymoimunologická a radioimunologické analýze a pro SiStění insulinu afinitní chromatografií.

Description

Vynález β· týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fází baňky myší myeloaové linie P3-X63-Ag8.653 a myší elezinné lymfoidní baňky, produkující protilátka proti prasečímu a lidskému insulinu.

Doposud se protilátky proti insulinu vyrábějí tak, že je insulin opakované injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji morčatům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigonu, slouží jako zdroj protilátek, užívanýeh zejména pro kvantitativní stanovení plasnatiokého insulinu metodou radioimunologické analýzy. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séra imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigonu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu. Výrobní šarže konvenčníeh sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit čistý imunizační antigen a dalěí antigeny pro vysyeení balastních protilátek proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výěe zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k disposici hybridem, produkující monoklonální protilátku proftřl insulinu, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky. ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1083, pod označením IK6 CZAS ΏΓ-05.

Uvedený hybridem byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Schoidigger, D.: Produotion of monoclonal antibodies: Stratégy and tactios, J. Immunol. Meth·, 35:1-21, 1980} Galfré, G., Hově, S.C.,

- 3 233 810

Mlstein, C., Butoher, G.W., Howard, J.C.: Antibodiea t© major histoeompatibility antigens produced by hybrid cell llaoa, Bature 266:550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fusí buněk myší myelomové linie P3-X63-AgG. 653 a buněk, získaných ze sleziny myěí kmene BalbZc, imunizovaných prasečím insulinem.

Výhodou hybridami jo, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklenální, která je sehopna specificky reagovat s prasečím i lidským insulinem. Hybrido» ZB-G5 je možně kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a jo adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BalbZc. Z konserv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalěího antlgenu. Protilátka, produkovaná hybridomem H-05, reaguje jak s prasečím, tak lidským insulinem (tj. rozeznává determinantu společnou pro tyto dva velmi podobné peptidy) a není třeba se zbavovat protilátek balast nich.

Příklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 5 x Ιθθ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (Θ.5 ml lntraperitoneálně). Po 22 dnech růstu hýbridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a neprodukovaná asoitioká tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 2.5 ml asoitieké tekutiny, která obsahovala 11 mgZml imunoglobulinu. Protilátka reagovala se specifickým antigenem (lidským nebo prasečím insulinem) v enzymoimunologickém testu (při použití prasečí antimyší protilátky značené křenovou peroxidázou) až do ředění l:loL Po navázání protilátky na agarosový gol bylo možno na tomto imunosorbentu izolovat insulin metodou afinitní chromátografie.

233 810

Buňky hýbridomu IH-05 nají ultrastruktumí obraz typických myelomových buněk. Banky hybridovi nají dra typy jader. První typ má tvar kulovitý, druhý typ jo eharaktorisován značnou polymorflí. Cytoplaama obou typů obsahuje velké množství polyrlbosonů, nitoohondrle a slabě vyvinuté endoplasmatieké retikulum. In vitro rostou jako polosuspensní kultury. Základním kultivačním médiem je Bagleve minimální esenciální médium s Haaksovou solnou směsí doplněné o noosoneiální aminokyseliny, L-glutamin (3 ml), pyruvát sodný (1 *). Toto médium (označované jako H-MBMo, Ústav molekulární genetiky ČSAV) jo pro kultivaci hybridonu IH-O5 doplněno penicilinem, stroptomyolnom, gentamycinem, 2-morkaptoetanelem (0.05 mH) pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaným bovinnín sérem (Biovota, Ivanovice na Hané, 10%). Hybridem jo kultivován při 37°C. Střední generační Sas jo 19.8 hod. a 10 měsíců po sestrojonl byl modální počet chromosomů 91. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGl s lehkými řetěze! typu tc, její iseelektrlcký bod je v rozmezí pH 6.2-6,4.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem IH-05 reaguje specificky s prasečím a lidským insulinem.

Hybridom IH-05 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti insulinu v metodách analytických nebo proparatlvníoh.

Monoklonální protilátka hýbridomu IH-05 může být využita pro analytické stanovení insulinu při klinické diagnostice v zdravotnických zařízeních, zvláště endokrinologicky zaměřených. Zmobilizované monoklonální protilátky může být použito k čištění insulinu pomocí afinitní chromatografio.

Claims (1)

1. pSbdbžt vii/le zn

   233 810 lymfooytární hybridem DíG CZAS UJ-05, produkující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti prasečími a lidskému insulinu.