CS253337B1 - Myši lymfocytárnf hybridem IMG CZAS RT-14 - Google Patents

Abstract

Řešeni se týká myšího lymfocytárniho hybridomu produkujícího protilátku proti reverzní transkriptáze, uloženého ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární-genetiky ČSAV pod označením RT-14. Monoklonální protilátka hybridomu RT-14 je vhodná pro použití v metodách enzymoimunologických, radioimunologických a preparativnlch.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp 2/0-Ag 14 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti reverzní transkriptáze.

Doposud se protilátky proti reverzní transkriptáze připravují tak, že je reverzní transkriptáza opakovaně injikována jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům, sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době po podání antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných především pro kvalitativní stanovení reverzní transkriptázy a k izolaci vysoce čistých preparátů tohoto enzymu. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejich spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu; ty je nutné ze sér odstraňovat vysycováním. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit čistý imunizační antigen a další antígeny pro vysyoení balastních protilátek proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti reverzní transkriptáze, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská ul. 1083, pod označením IMG CZAS RT-14.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S. Scheidegger, D.: Production of monoclonal antibodies. Stratégy and tactics. J. Immunol. Meth., 35·: 1-21, 1980; Galfré, G. , Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W. , Howard, J. C.: Antibodies to major histocompatibllity antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266: 550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie Sp 2/D-Ag 14 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene 810.A imunizovaných reverzní transkriptázou izolovanou z virusu pt^čí myeloblastózy (AMV) o 50% čistotě.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna.specificky reagovat s oběma podjednotkami reverzní transkriptázy, jak bylo zjištěno po přenosu virových proteinů (separovaných na elektroforéze za redukujících podmínek) na nitrocelulózovou membránu a po specifické detekci nepřímým imunologickým testem (s využitím protilátky RT-14 a prasečí 'protilátky proti myšímu imunoglobulinukonjugované s peroxidázou; ÚSOL, Praha). V blokovacích pokusech nebyl zjištěn efekt protilátky RT-14 na enzymatickou aktivitu reverzní transkriptázy.

Hybridom RT-14 je možno kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší hybridů F^ (BIO.A + BALB/c). Z konzerv hybridomovýoh buněk uchovávaných v kapalném dusíku je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu.

Příklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 2x10^ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 10 dní před převodem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitoneálně). Po 12 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 2,5 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 4 mg/ml imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala se specifickým antigenem v enzymoimunologickému testu (při pog užití prasečí antimyši protilátky značené křenovou peroxidázou) až do ředění 1:10 .

Buňky hybridomu RT-14 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyribosomy. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3 mM), pyruvát sodný (1 mM). Toto médium (označené jako H-MEMd, Ostav molekulární genetiky ČSAV), je pro kul tivaci hybridomu RT-14 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoestanolem (0,05 nM), pufrem HEPES (10 nM) a inaktivovaným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%). Hybridom je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 17,8 hod. a 20 měsíců po sestrojení byl mpdální počet chromosomů 76. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgG 2b s lehkými řetězci typu kappa, její izoelektrický bod je pH 7,1-7,5.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem RT-14 reaguje specificky s reverzní transkriptázou.

Hybridom RT-14 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti reverzní transkriptáze v metodách analytických nebo preparativních.

Claims (1)

1. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS RT-14'produkující monoklonální protilátku podtřídy IgG 2b proti reverzní transkriptáze ptačí myoblastózy.