CS255844B1 - Myší lymfocytární hybridom produkující monoklonální protilátku proti prasečímu akrozínu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytámího hybridomu, produkujícího protilátku proti prasečímu akrozínu (beta-formě akrozínu)., uloženého ve sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MO.AKR.l. Samotná monoklonální protilátka hybridomu MO.AKR.l je vhodná pro použití v radioimunologické nebo enzymoimunologické analýze pro stanovení množství prasečího akrozínu.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúzí. myší myelomové linie SP 2/0 - Ag 14 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti prasečímu akrozínu.

Pokud se vyrábějí protilátky proti akrozínu, vyrábějí se tak, že je akrozín opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji myším nebo potkanům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebrané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných pro stanovení akrozínu u poškozených spermií. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu; ty je nutné ze sér odstraňovat vysycováním. šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit čistý imunizační antigen a další antigeny.pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám. Konvenční protilátka proti akrozínu často reaguje s proakrozínem, který se nachází v nepoškozených spermiích a proto nelze jednoznačně takovou protilátkou určit míru poškození spermií, která je dána uvolněním enzymu akrozínu.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom produkující monoklonální protilátku proti prasečímu akrozínu, uložený ve Sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1 083, pod označením IMG CZAS MO.AKR 1.

Uvedený -hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, s., Schei.digger, .0.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Met., 35: 1 až 21 1980; Galfré, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard,

J. C.: Antibodies tó major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266: 550,' 1977)· klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí myší myelomové linie SP 2/0-Ag 1.4 a' buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných akrozínem.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní .protilátku tzv. protilátku monoklonální, která je schopná' specificky reagovat s prasečím akrozínem (specificky s beta-formou akrozínu). Hybridom MO.AKR 1 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konserv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky běz dalšího antigenu.

Příklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk/in vivo bylo aplikováno 1,5.10® buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 10 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitoneálně). Po 16 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 5 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 7 mg/ml imunoglobulinu. Monoklonální protilátka obsažená v ascitické tekutině reaguje specificky s beta-akrozínem v ELISA testu do ředění (10 ). Specifita monoklonální protilátky byla dále zjišťována po elektroforetickém přenosu antigenu děleného SDS PAGE (Laemmli, U. K., Nátuře, 227:680, 1970) na nitrocelulosovou membránu a detekci nepřímým enzymoimunologickým testem (Towbin, H., a spol., Proč, Nať. Acad. Sci., 76:4 350, 1979). Monoklonální protilátka (MO.AKR 1) reagovala pouze ze zonou odpovídající molekulové hmotnosti beta-akrozínu (m. v. 34 000).

Buňky hybridomu MO.AKR 1 mají ultrastrukturální obraz typických myelovových buněk. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je médium RPMI 1 640 (Moore, G. E. a spol. J. Am. Med. Assoc., 199:519, 1967) připravené Ostavem molekulární genetiky ČSAV, doplněné glutaminem, merkaproetanolem, HEPES-em, antibiotiky a 10% telecího séra (Bioveta, Ivanovice na Hané). Hybridom je kultivován při 37 °C a 5% CO₂. Střední generační čas je 16,7 hod. Modální počet chromosomů je 86.

Hybridom MO.AKR 1 může být průmyslově využíván jako zdroj protilátky proti prasečímu akrozínu. Protože protilátka specificky reaguje s beta-formou akrozínu, lze pomocí této protilátky stanovit množství uvolněného akrozínu u poškozených spermií a tím otestovat různé inseminační dávky spermatu po rozmražení a vybrat vhodné (fertilní, nepoškozené) pro inserainaci.

Claims (1)

1. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS MO.AKR 1, produkující monoklonální protilátku proti prasečímu akrozínu beta-formě.