CS259995B1 - Myší lymfooytární hybridom produkující o monoklonální protilátku proti akrozínu - Google Patents

Abstract

Myší lymfooytární hybridom, produkující protilátku proti akrozínu, která reaguje 0 akrozínem prasete, býka, berana a myši je uložen ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MO. AKR. 4. Samotná monoklonální protilátka hybridomů MO. AKR. 4 je vhodná pro použití v radioimunologická nebo enzymoimunologické analýze stanovení množství prasečího, býčího, beraního a myšího akrozínu. V imunofluoreecenčním testu značí nepoškozený akrozóm u prasete, býka, berana, myši.

Description

Vynález se týká nového hybridomů, t j. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúzí myelomové myší linie a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti prasečímu akrozínu.

Protilátky proti akrozínu se vyrábějí tak, že je akrozín opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji myším nebo potkanům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebrané po určité době působení antigenů, slouží jako zdroj protilátek, užívaných pro stanovení akrozínu u poškozených spermií. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod· V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní*směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytváří kromě protilátek vůči žádanému antigenů i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu$ ty je nutné ze sér odstraňovat vysycovéním.Šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit čistý imunizační anti gen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.

Je. známá monoklonální protilátka proti prasečímu akrozínu,

AKR.l, který je uložen ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Víděňská č. 1083, pod označením IMG CZAS MO. AKR 1.

Další monoklonální protilátku proti akrozinu produkuje nový hybridom MO AKR.4 podle vynálezu, který je uložen ve· Sbírce, hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská

δ. 1083, pod označením IMG CZAS MO. AKR. 4. Tento hybridom produkuje monoklonální protilátku proti prasečímu, býčímu, beraní mu a myšímu akrozinu, reaguje tedy mezidruhovš, podobně, jako konvenčním způsobem připravená protilátka; zároveň má však všechny výhody monoklonální protilátky /homogénnost, standartnost, snadná příprava velkého množství protilátky/. V imunofluorescenčnim testu./Immunochemistry in: Immunochemistry in Practice, eds. A. Johnstone, R. Thorpe, p 256. 1982/ značí monoklonální protilátka hybridomu MO. AKR. 4 akrozom prasete, býka, berana a myší u nepoškozených spermií.

»

Ok

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury /Fazekas de St. Groth, So, Scheidigger, 0.: Produktion of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Met., 35: 1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S.G., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266:550, 1977/ klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí myší myelomové linie Sp 2/o - Ag 14 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných akrozínem.

Hybridom MO. AKR. 4 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konzerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu.

příklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 2.10^ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 10 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem /0,5 ml intraperitoneálně/. Po 10 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 5 ml ascitické tekutiny, která obsahovala >

mg/ml imunoglobulinu, třídy IgM. Monoklonální protilátka obsažená v ascitické tekutině reaguje s akrozínem různých druhů ~ 5 ~ zvířat /prase, býk, beran, myš/ v ELISA testu do ředění /ÍO“^/.

Buňky hybridomu MO. AKR. 4 mají ultrastrukturální obraz typických rayelomových buněk. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je médium RPMI 1640 /Moore, G.E. a spol. J. Am. Med. Assoc., 199:519, 1967/ připravené Ústavem molekulární genetiky ČSAV, doplněné glutaminem, HEPES-em, antibiotiky a 10% telecího séra /Bioveta, Ivanovice na Hané/. H.ybridom je kultivován při 37 °C a 5 % CO2. Střední generační čas je 17,3 hod.

Hybridom MO. AKR. 4 může být průmyslově využíván jako zdroj protilátky nejen proti prasečímu akrozínu, ale i akrozínu býků, beranů a ve výzkumu u myší. Pomocí této protilátky lze stanovit množství uvolněného akrozínu u poškozených spermií různých druhů zvířa^ a tím otestovat různé inseminační dávky spermatu po rozmražení a vybrat vhodné /fertilní, nepoškozené/ pro inseminaci.

V ELISA testu je množství akrozínu stanoveno tak, že supernatant z odebraných spermií od zvířat nebo rozmražených spermií, který obsahuje uvolněný akrozín je nakapán do Terasakiho destiček /Dalečín/. K nakapanému antigenu - akrozínu je přidána monoklonální protilátka MO. AKR. 4 ředěná geometrickou řadou.* Po inkubaci antigenu s monoklonálnX protilátkou je přidána prasečí protilátka proti myším iraunoglobulinům značená peroxidázou /SwAM Px, USOL, Praha/, po přidání ortho-phenyldiaminu /substrát pro peroxidázu/ vzniká barevná reakce, kterou lze vizuálně odečíst.

Claims (1)

1. Myší lymfocytární h.ybridom IMG CZAS MO. AKR. 4, vyznačující se tím, že produkuje monoklonální protilátku proti akrozínu, která reaguje s akrozínem prasete, býka, berana a myší.

   Užgorodský výrobně-poligrafický podnik Patent”, Gagarina 101, užgorod H· 2330 , Cena 2,40 Kce