CS240846B1 - Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS IN - 04 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti prasečímu a lidskému insulinu, uloženého ve sbírce hybridomu Ostavu molekulární genetiky ČSAV pod označením IN - 04. Sainotna monoklonální protilátka hybridomu IN - 04 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýze a pro čištění insulinu afinitní chromatografií.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti prasečímu a lidskému insulinu.

Doposud se protilátky proti insulinu vyrábějí tak, že je insulin opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji morčatům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenů, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvantitativní stanovení plasmatického insulinu metodou radioimunologické analýzy. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenů i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k disposici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti insulinu, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ÚSAV v Praze 4, Vídeňská 1083, pod označením IMG CZAS IN-04.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné . literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J.Immunol. Meth., 35:1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C.,

- 3 240 846

Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266:550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALÉ/c, imunizovaných prasečím insulinem.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, které je schopna specificky reagovat s prasečím i lidským' insulinem. Hybridom IN-04 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konserv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit prpdukci protilátky bez dalšího antigenů. Protilátka, produkovaná hybridomem IN-04, reaguje jak s prasečím, tak lidským insulinem (tj. rozeznává determinantu společnou pro tyto dva velmi podobné peptidy) a není třeba se zbavovat protilátek balastních.

Příklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 5 x 10^ buněk do peritbneáiní dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0.5 ml intraperitoneálně). Po 20 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš. zabita a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 2.0 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 7 mg/ml imunoglobulinu. Protilátka reagovala se specifickým antigenem (lidským nebo prasečím insulinem) v enzymoimunologickém testu (při použití prasečí antimyší protilátky značené křenovou peroxidázou) až do ředění 1:10 . Po navázání protilátky na agarosový gel bylo možno na tomto imunosorbentu izolovat insulin metodou afinitní chromatografie.

- 4 240 846

Buňky hybridomů IN-04 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. Buňky hybridomů obsahují jádra charakteristické značnou polymorfií. Cytoplasma buněk obsahuje velké množství polyribosomů, mitochondrie a slabě vyvinuté endoplasmatické retikulum. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačnímnádiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3 mM), pyruvát sodný (1 xnM). Toto médium (označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomů IN-04 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0.05 mM) pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%). Hybridom je kultivován při 37°C. Střední generační čas je 21.5 hod. a 10 měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 89. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgG1 s lehkými řetězci typu , její isoelektrický bod je v rozmezí pH 7.0 - 7.2.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem IN-04 reaguje specificky s prasečím a lidským insulinem.

Hybridom IN-04 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti insulinu v metodách analytických nebo preparativních.

Monoklonální protilátka hybridomů IN-04 může být využita pro analytické stanovení insulinu při klinické diagnostice v zdravotnických zařízeních, zvláště endokrinologicky zaměřených. Imobilizované ánoklonální protilátky může být použito k čištění insulinu pomocí afinitní ohromatografie.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   240 848

   Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS IN-04, produkující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti prasečímu a lid skému insulinu.