CS243348B1 - Myší lymfocytární hybridem IMG-CZAS HTF-21 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému a králičímu transferinu uloženého ve sbírce hybrldomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením HTF-21. Samotná monoklonální protilátka hybridomu HTF-21 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologioké analýze.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie P3-X63-Ag. 8653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti lidskému transferinu.

Doposud se protilátky proti transferinu vyrábějí tak, že je transferin opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům a prasatům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvantitativní stanovení plazmatického transferinu metodou jednoduché radiální imunodifuze.

Tento postup nazývaný konvenční imunizací má několik výhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné.

Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu; ty je nutné ze sér odstraňovat vysycováním. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti lidskému transferinu,, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská ul. 1 083, pod označením IMG CZAS HTF-21.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury /Fazekas de St. Groth, S. Scheidigger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth., 35:1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266: · 550, 1977/ klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší;'myelomové linie P3-X63-Ag 8.653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných lidským transferinem.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidským transferinem. Hybridom HTF-21 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c.

Z konzerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka produkovaná hybridomem HTF-21 reaguje specificky s lidským a králičím transferinem a není třeba se zbavovat protilátek balastních.

Příklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 2 x 10® buněk do peritoneální dutiny-myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 10 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem /0.5 ml intraperitoneálně/.

Po 16 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 4.8 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 16 mg/ml Ímunoglobulinu.

Protilátka reagovala se specifickým antigenem v enzymoimunologickém testu /při použití prasečí antimyší protilátky značené křenovou peroxidázou/ až do ředění 1 : 10®. Protilátka HTF-21 křížově reaguje s králičím transferinem až do ředění 1 : 10®.

Ve vazebných testech nereaguje s žádaným lidským sérovým proteinem. Protilátka HTF-21 nereaguje s transferinem navázaným na buněčný transfer.tnový receptor v testu nepřímé imunofluoresoence s použitím komerční prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu /SWAM-FITC, SEVAC/.

Buňky hybridomu HTF-21 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyribosomy. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury.

Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenoiální aminokyseliny, L-glutamin /3 mM/, pyruvát sodný /1 mM/. Toto médium /označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV/ je pro kultivaci hybridomu HTF-21 doplněno penicilinem, streptomyoinem, gentamyoinem, 2-merkaptoetanolem /0.05 mM/, pufrem HEPES /10 mM/ a inaktivovaným bovinním sérem /Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%/.

Hybridom je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 12.8 hod a 12 měsíců po Sestrojení byl modální počet chromosomů 81. Produkovaná protilátka je monoklonální Imunoglobulin podtřídy IgGl s lehkými řetězci typu kappa, jeho izoelektrický bod je pí 6,8-7,1.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem HTF-21 reaguje specificky s lidským a králičím transferinem.

Hybridom HTF-21 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti transferinu použitelné k detekci transferinu v metodách analytických /enzymoimunologických/, nebo preparatlvních /vychytání transferinu ze séra a dalších tělních tekutin a výplachů afinitní chromatograf!í na imobilizované protilátce/.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Myší lymfocytámí hybridom IMG CZAS HTF-21, produkující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti lidskému a králičímu transferinu.