CS263121B1 - i.iyóí lymfocytúrní hybridom produkující protilátku proti lidskému alfa-fetoproteinu - Google Patents

Abstract

Řešení ae týká myšího lymfocylárního hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskémij alfa-fetoproteinu, uložené^0 ve sbírce Ústavu molekulární genetik.v ČSAV pod označením II,;G CZAS APP-03. Samotná monoklonulní protilátku hybridomu APP-O? je vhodná pro použití v sendvičovém cnzymoimunologickém testu v kombinaci s jinými mojjoklonálními protilátkami přepravenými v IJstavu molekulární genetik?/ ČSAV (ΛΡΡ-01 nebo APP-11) ke stanovení koncentrace lidského alfa-fe to prote inu.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O-Ag14 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti lidskému alfa-fetoproteinu.

Protilátky proti alfa-fetoproteinu se mohou vyrábět tak, že alfa-fetoprotein je opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat,. odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvantitativní stanovení plazmatického alfa-fetoproteinu metodou radioimunologické nebo enzymoimunoanalytické analýzy. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality.

Nevýhodu konvenčních sér proti alfa-fetoproteinu v principu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je namířena proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridoraů, je pravděpodobné, že se z něho podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která je namířená proti určité antigenní determinantě molekuly lidského alfa-fetoproteinu. Znamená to, že mohou být konstruovány klony molekulárních protilátek proti různým antigenním determinantám řetězce molekuly alfa-fetoproteinu. Výhodnost získání monoklonálních protilátek proti několika antigenním determinantám je hlavně v možnosti využití kombinací protilátek namířených proti různým deter- L263 121 minantám ke zvýšení citlivosti analytických testů pro stanovení alfa-fetoproteinu v tělních tekutinách, Tento přístup, tj. příprava hybridomů produkujících monoklonální protilátky specificky rozeznávající alfa-fetoprotein, byl použit několika autory (např.; Tsung, Y.-K., Milunsky, A., Alpert, E.: Derivation and characterization of a monoclonal hybridoma antibody specific for human alpha-fetoprotein,

J. Iramunol. Meth. 39:363*368, 1980; Stenman, U.H., Sutinen, M.L., Selander, R.K., Tontti, K., Schroder, J.: Characterization of a monoclonal antibody to human alpha-fetoprotein and its use in affinity chromatography, J. Immunol. Meth. 46:337«345, 1981; Uotila, M., Ruoslahti, E., Engvall, E.: Two-site sandwich enzyme immunoassay with monoclonal antibodies to human alpha-fetoprotein, J. Immunol. Meth. 42: 11«15, 1981; Hunter, W.M., Bennie, J.G., Brock, D.J.H., van Heyningen, V.: Monoclonal antibodies for use in an immuno radiometric assay for ot-fetoprotein, J. Immunol. Meth. 50: 133»é144, 1982; Van Heyningen, V., Barron, L., Brock, D.J.H., Crichton, D., Lawrie, S.: Monoclonal antibodies to human Ot-fetoprotein: analysis of the behavious of three different antibodies, J. Iramunol. Meth. 50:123*131, 1982). Bylo též popsáno použití sendvičového enzymoimunologického testu s využitím dvou monoklonálních protilátek ke stanovení koncentrací alfa-fetoproteinu v biologických vzorcích (Uotila a spol., viz výše uvedená citace). Tato metoda má výhodu v tom, Že při ní není potřeba používat vysoce Čištěného radioaktivně značeného antigenu, že je rychlá a jednoduchá. Monoklonální protilátky použité pro sestavení sendvičového enzymoimunologického testu autory Uotila a spol. byly získávány ze supernatantů tkáňových kultur hybridomů, v nichž jsou koncentrace monoklonálních protilátek velmi nízké. Uvedenými autory byly pozorovány nepříznivé nespecifické efekty neředěného lidského séra, které byly odstraněny teprve ředěním vzorků 1:10.

Tyto nevýhody odstraňuje použití monoklonální protilátky produkované hybridorném uloženým ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1083, pod

263 121 označením IMG CZAS AFP-03· Tento hybridom dobře roste jak ve tkáňové kultuře in vitro, tak in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c, takže je možno v ascitické tekutině produkovat za ekonomicky výhodných podmínek velké množství monoklonólní protilátky. Monoklonální protilátku AFP-03 je možno použít v kombinaci s jinými monoklonálními protilátkami (AFP-O1 nebo AFP-11) připravenými v Ústavu molekulární genetiky ČSAV k sestavení sendvičového enzymoimunologického testu. V tomto uspořádání se neprojevují nepříznivé vlivy způsobené neředěnými vzorky lidského séra.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, L.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth. 35:1:21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.G.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266: 550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fůzí buněk myší myelomové linie Sp2/O-Ag14 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných lidským alfa-fetoproteinem.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklnální, která je schopna specificky reagovat s lidským alfa-fetoproteinem. Hybridom AFP-03 je možné kul* tivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konxerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem AFP-03, reaguje s lidským alfa-fetoproteinem a není třeba se zbavovat protilátek balastních.

Příklad 1

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 5 x 10^ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0.5 ml intraperitoneálně). Po 10 dnech růstu hybridomu v

263 121 peritoneální dutině byla myš zabita a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 2 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 4,5 mg/ml imunoglobulinu. Protilátka AFP-03 reagovala se specifickým antigenem (lidským alfa-fetoproteinera) v enzymoiraulologickém testu (při použití prasečí antimyší protilátky značené křenovou peroxidázou) až do ředění 1:10^ a v radioimunologickém precipitačním testu (při použití králičího antiséra proti myšímu imunoglobulinu a polyethylenglykolu k precipitaci komplexů antigen-monoklonální protilátka) až do ředění 1:1(/.

Příklad 2

Monoklonální protilátku AFP-03 bylo možno použít pro stanovení koncentrace alfa-fetoproteinu v sendvičovém enzymoimunologickém testu v kombinaci s jinými monoklonálními protilátkami pro alfa-fetoproteinu (AFP-01 nebo AFP-11),a to s použitím imobilizované protilátky AFP-01 nebo AFP-11 a protilátky AFP-03 konjugovane s peroxidázou.

Příslušná monoklonální protilátka (AFP-01 nebo AFP-11) byla částečně čištěna z ascitické tekutiny srážením nasyceným roztokem síranu amonného do 50¾ nasycení, naředěna fyziologickým roztokem na koncentraci 5O£2OO/Ug/ml a imobilizována adsorpcí na povrch jamek polystyrénových kultivačních destiček s plochým dnem (1 h při 37°C). Po promytí jamek fyziologickým roztokem byla zbývající adsorpčně aktivní místa na polystyrénovém povrchu jamek blokována inkubací s roztokem želatiny ve fyziologickém roztoku (2 h, 37°C). Vzorky standardů lidského séra (0,1 ml) obsahující známé koncentrace alfa-fetoproteinu (0e200 ng/ml) byly inkubovány v takto připravených jamkách 16 h při 4°C a po promytí fyziologickým roztokem bylo přidáno 0,1 ml roztoku konjugátu monoklonální protilátky AFP-03 s peroxidázou (připraven metodou popsanou v odborné literatuře (Tijssen, P., Kurstak, E.: Highly efficient and simple methods for the preparation of peroxidase

263 121 and active peroxidase-antibody conjugates for enzyme immunoassays, Anal. Biochem. 136:451«457, 1984), naředěn na koncentraci 10«100yUg/ml v 50% hovězím séru ve fyziologickém roztoku). Po 2 h inkubace při 4°C byly jamky promyty fyziologickým roztokem,bylo přidáno 0,1 ml substrátového roztoku (0,1% roztok o-diaminobenzen dichloridu v 0,1 M fosfátovém pufru pH 6,0 obsahujícím 0,02% peroxid vodíku) a po 10<20 minutách byla chromogenní enzymatická reakce zastavena přidáním 0,1 ml 2 M roztoku kyseliny sírové a byla změřena intenzita vzniklého zabarvení spektrofotometru při 492 nm (OD^^). Jako negativní srovnávací vzorek, k němuž byly získané hodnoty vztahovány, byl použit standard lidského séra neobsahující žádný alfa-fetoprotein detekovatelný komerční rádioimunologickou soupravou. Typické hodnoty 0D^₅₂ byly O,O5bžP,2 pro vzorky obsahující 10 ng/ml alfa-fetoproteinu a 0,7«ž1 ,2 pro vzorky obsahující 100 ng/ml, v závislosti na použité imobilizované monoklonální protilátce a na použitém ředění konjugátu AFP-03 s peroxidázou. Tyto hodnoty ukazují, že s využitím uvedených monoklonálních protilátek lze sestavit sendvičový enzymoimunologický test použitelný pro stanovení koncentrací alfa-fetoproteinu v diagnosticky žádoucím oboru koncentrací (alespoň 10 ng/ml).

Buňky hybridomu AFP-03 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsdj doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3 caM), pyruvát sodný (1 mM). Toto médium (označované jako RPMI, Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu AFP-03 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0.05 mM) pufrem HEPES (kyselina N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N*-2 ethansulfonová) (10 mM) a inaktivovaným bovinním sérern (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%). Hybridom je kultivován při 37°C. Střední generační čas je 18,2 hod. Produkovaná protilátka je monoklonální imuno263 121 globulin podtřídy IgG1 s lehkými řetězci typu K. , její isoelektrický bod je v rozmezí pH 6,7ež7,O.

Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem AFP-03 reaguje specificky s lidským alfa-fetoproteinem.

Hybridom AFP-03 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti lidskému alfa-fetoproteinu v metodách analytických nebo preparativních.

Monoklonální protilátka hybridomu AFP-03 může být využita pro analytické stanovení alfa-fetoproteinu při klinické diagnostice ve zdravotnických zařízeních, zvláště pro diagnosu nádorových onemocnění (hepatomy, teratomy atd.) nebo kongenitální malformace (rozštěp páteře - spina bifida plodu).

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS AFP-03, vyznačující se tim, že produkuje monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti lidskému alfa-fetoproteinu.