CS263121B1 - Mouse lymphocytaric hybridome producing antibody against human alpha-fetoproteine - Google Patents
Mouse lymphocytaric hybridome producing antibody against human alpha-fetoproteine Download PDFInfo
- Publication number
- CS263121B1 CS263121B1 CS877924A CS792487A CS263121B1 CS 263121 B1 CS263121 B1 CS 263121B1 CS 877924 A CS877924 A CS 877924A CS 792487 A CS792487 A CS 792487A CS 263121 B1 CS263121 B1 CS 263121B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- fetoprotein
- human alpha
- hybridoma
- alpha
- mouse
- Prior art date
Links
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract 1
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 15
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 208000006097 Spinal Dysraphism Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 201000010829 Spina bifida Diseases 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012801 analytical assay Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000011833 salt mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení ae týká myšího lymfocylárního hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskémij alfa-fetoproteinu, uložené^0 ve sbírce Ústavu molekulární genetik.v ČSAV pod označením II,;G CZAS APP-03. Samotná monoklonulní protilátku hybridomu APP-O? je vhodná pro použití v sendvičovém cnzymoimunologickém testu v kombinaci s jinými mojjoklonálními protilátkami přepravenými v IJstavu molekulární genetik?/ ČSAV (ΛΡΡ-01 nebo APP-11) ke stanovení koncentrace lidského alfa-fe to prote inu.The solution ae concerns mouse lymphocyte antibody-producing hybridoma human alpha-fetoprotein, stored ^ 0 in collection of the Institute of Molecular Genetics in the Czechoslovak Academy of Sciences under the designation II, G CZAS APP-03. Monoclonal alone antibody hybridoma APP-O? Yippee suitable for use in sandwich cnzymoimmunological test in combination with others myoclonal antibodies transported in the Institute of Molecular Genetics? / CSAV (01-01 or APP-11) to determine concentration human alpha-fe to protein.
Description
Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O-Ag14 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti lidskému alfa-fetoproteinu.The invention relates to a novel hybridoma, i.e., a hybrid unicellular organism, constructed by fusing a mouse myeloma cell line Sp2 / O-Ag14 and a mouse spleen lymphoid cell producing an antibody against human alpha-fetoprotein.
Protilátky proti alfa-fetoproteinu se mohou vyrábět tak, že alfa-fetoprotein je opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat,. odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvantitativní stanovení plazmatického alfa-fetoproteinu metodou radioimunologické nebo enzymoimunoanalytické analýzy. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality.Alpha-fetoprotein antibodies can be produced by alpha-fetoprotein being injected repeatedly as an antigen into test animals, most commonly rabbits. Serum of the immunized animals. taken after a period of antigen exposure, serves as a source of antibodies, used in particular for the quantitative determination of plasma alpha-fetoprotein by radioimmunoassay or enzyme-immunoassay analysis. This procedure, called conventional immunization, has several disadvantages. In the serum of immunized animals there is a heterogeneous mixture of antibodies whose spectrum varies and does not repeat in each individual organism. Generally, in addition to antibodies to the desired antigen, the organism will produce antibodies against the impurities of the antigen preparation. Consequently, batches of conventional sera are difficult to standardize and are based on production in a wide quality range.
Nevýhodu konvenčních sér proti alfa-fetoproteinu v principu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je namířena proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridoraů, je pravděpodobné, že se z něho podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která je namířená proti určité antigenní determinantě molekuly lidského alfa-fetoproteinu. Znamená to, že mohou být konstruovány klony molekulárních protilátek proti různým antigenním determinantám řetězce molekuly alfa-fetoproteinu. Výhodnost získání monoklonálních protilátek proti několika antigenním determinantám je hlavně v možnosti využití kombinací protilátek namířených proti různým deter- L263 121 minantám ke zvýšení citlivosti analytických testů pro stanovení alfa-fetoproteinu v tělních tekutinách, Tento přístup, tj. příprava hybridomů produkujících monoklonální protilátky specificky rozeznávající alfa-fetoprotein, byl použit několika autory (např.; Tsung, Y.-K., Milunsky, A., Alpert, E.: Derivation and characterization of a monoclonal hybridoma antibody specific for human alpha-fetoprotein,In principle, the use of hybridoma technology eliminates the disadvantage of conventional sera against alpha-fetoprotein. The hybridoma product - a monoclonal antibody - is directed against a single antigenic determinant. If a sufficiently large set of hybridoras is constructed, it is likely that a hybridoma synthesizing an antibody directed against a particular antigenic determinant of the human alpha-fetoprotein molecule is likely to be found. This means that molecular antibody clones can be constructed against various antigenic determinants of the alpha-fetoprotein molecule chain. The advantage of obtaining monoclonal antibodies against several antigenic determinants is mainly in the possibility of using combinations of antibodies directed against different deter- L263 121 minants to increase the sensitivity of analytical assays for the determination of alpha-fetoprotein in body fluids. -fetoprotein, has been used by several authors (e.g., Tsung, Y.-K., Milunsky, A., Alpert, E .: Derivation and characterization of a monoclonal hybridoma antibody specific for human alpha-fetoprotein,
J. Iramunol. Meth. 39:363*368, 1980; Stenman, U.H., Sutinen, M.L., Selander, R.K., Tontti, K., Schroder, J.: Characterization of a monoclonal antibody to human alpha-fetoprotein and its use in affinity chromatography, J. Immunol. Meth. 46:337«345, 1981; Uotila, M., Ruoslahti, E., Engvall, E.: Two-site sandwich enzyme immunoassay with monoclonal antibodies to human alpha-fetoprotein, J. Immunol. Meth. 42: 11«15, 1981; Hunter, W.M., Bennie, J.G., Brock, D.J.H., van Heyningen, V.: Monoclonal antibodies for use in an immuno radiometric assay for ot-fetoprotein, J. Immunol. Meth. 50: 133»é144, 1982; Van Heyningen, V., Barron, L., Brock, D.J.H., Crichton, D., Lawrie, S.: Monoclonal antibodies to human Ot-fetoprotein: analysis of the behavious of three different antibodies, J. Iramunol. Meth. 50:123*131, 1982). Bylo též popsáno použití sendvičového enzymoimunologického testu s využitím dvou monoklonálních protilátek ke stanovení koncentrací alfa-fetoproteinu v biologických vzorcích (Uotila a spol., viz výše uvedená citace). Tato metoda má výhodu v tom, Že při ní není potřeba používat vysoce Čištěného radioaktivně značeného antigenu, že je rychlá a jednoduchá. Monoklonální protilátky použité pro sestavení sendvičového enzymoimunologického testu autory Uotila a spol. byly získávány ze supernatantů tkáňových kultur hybridomů, v nichž jsou koncentrace monoklonálních protilátek velmi nízké. Uvedenými autory byly pozorovány nepříznivé nespecifické efekty neředěného lidského séra, které byly odstraněny teprve ředěním vzorků 1:10.J. Iramunol. Meth. 39: 363-368, 1980; Stenman, U.H., Sutinen, M.L., Selander, R.K., Tontti, K., Schroder, J .: Characterization of a monoclonal antibody to human alpha-fetoprotein and its use in affinity chromatography, J. Immunol. Meth. 46: 337-345, 1981; Uotila, M., Ruoslahti, E., Engvall, E., Two-site sandwich enzyme immunoassay with monoclonal antibodies to human alpha-fetoprotein, J. Immunol. Meth. 42: 11-15, 1981; Hunter, W.M., Bennie, J.G., Brock, D.J.H., van Heyningen, V .: Monoclonal Antibodies for Use in the Immuno-Radiometric Assay for α-Fetoprotein, J. Immunol. Meth. 50: 133, 144, 1982; Van Heyningen, V., Barron, L., Brock, D.J.H., Crichton, D., Lawrie, S., Monoclonal Antibodies to Human Ot-Fetoprotein: Analysis of the Behavious of Three Different Antibodies, J. Iramunol. Meth. 50: 123-131 (1982). The use of a sandwich enzyme immunoassay using two monoclonal antibodies to determine alpha-fetoprotein concentrations in biological samples has also been described (Uotila et al., Supra). This method has the advantage that it does not need to use highly purified radiolabeled antigen to be quick and simple. The monoclonal antibodies used to construct the sandwich enzyme immunoassay by Uotila et al. were obtained from tissue culture supernatants of hybridomas in which monoclonal antibody concentrations are very low. These authors observed adverse non-specific effects of undiluted human serum, which were only removed by 1:10 dilution of samples.
Tyto nevýhody odstraňuje použití monoklonální protilátky produkované hybridorném uloženým ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1083, podThese disadvantages are eliminated by the use of a monoclonal antibody produced by the hybridoma deposited in the Collection of Hybridomas of the Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences in Prague 4, Vídeňská No. 1083, under
263 121 označením IMG CZAS AFP-03· Tento hybridom dobře roste jak ve tkáňové kultuře in vitro, tak in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c, takže je možno v ascitické tekutině produkovat za ekonomicky výhodných podmínek velké množství monoklonólní protilátky. Monoklonální protilátku AFP-03 je možno použít v kombinaci s jinými monoklonálními protilátkami (AFP-O1 nebo AFP-11) připravenými v Ústavu molekulární genetiky ČSAV k sestavení sendvičového enzymoimunologického testu. V tomto uspořádání se neprojevují nepříznivé vlivy způsobené neředěnými vzorky lidského séra.This hybridoma grows well in both tissue culture in vitro and in vivo in the peritoneal cavity of BALB / c mice, so that large amounts of monoclonal antibody can be produced in ascitic fluid under economically advantageous conditions. The monoclonal antibody AFP-03 can be used in combination with other monoclonal antibodies (AFP-O1 or AFP-11) prepared by the Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences for the compilation of a sandwich enzyme immunoassay. This arrangement does not exhibit adverse effects caused by undiluted human serum samples.
Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, L.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth. 35:1:21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.G.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266: 550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fůzí buněk myší myelomové linie Sp2/O-Ag14 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných lidským alfa-fetoproteinem.Said hybridoma was obtained by a method known in the literature (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, L .: Production of monoclonal antibodies: Strategies and tactics, J. Immunol. Meth. 35: 1: 21, 1980; Galfré, G Howe, SC, Milstein, C., Butcher, GW, Howard, JG: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell line, Nature 266: 550, 1977) by cloning a set of hybrid cells resulting from fusion of mouse myeloma cell line Sp2 / O-Ag14 and cells obtained from the spleen of BALB / c mice immunized with human alpha-fetoprotein.
Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklnální, která je schopna specificky reagovat s lidským alfa-fetoproteinem. Hybridom AFP-03 je možné kul* tivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konxerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem AFP-03, reaguje s lidským alfa-fetoproteinem a není třeba se zbavovat protilátek balastních.The advantage of the hybridoma is that it produces a homogeneous antibody, the so-called monoclonal antibody, which is capable of specifically reacting with human alpha-fetoprotein. The AFP-03 hybridoma can be cultured in vitro in animal cell media and is adapted for growth in vivo in the peritoneal cavity of BALB / c mice. From the preserves stored in liquid nitrogen, antibody production can be initiated without additional antigen. The antibody produced by the AFP-03 hybridoma reacts with human alpha-fetoprotein and does not need to be rid of ballast antibodies.
Příklad 1Example 1
Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 5 x 10^ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0.5 ml intraperitoneálně). Po 10 dnech růstu hybridomu vTo expand the hybridoma cells in vivo, 5 x 10 6 cells were injected into the peritoneal cavity of mice. To improve attachment of the cells applied, the mouse was treated with paraffin oil (0.5 ml intraperitoneally) 14 days prior to transfer of the hybridoma cells. After 10 days of hybridoma growth
263 121 peritoneální dutině byla myš zabita a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 2 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 4,5 mg/ml imunoglobulinu. Protilátka AFP-03 reagovala se specifickým antigenem (lidským alfa-fetoproteinera) v enzymoiraulologickém testu (při použití prasečí antimyší protilátky značené křenovou peroxidázou) až do ředění 1:10^ a v radioimunologickém precipitačním testu (při použití králičího antiséra proti myšímu imunoglobulinu a polyethylenglykolu k precipitaci komplexů antigen-monoklonální protilátka) až do ředění 1:1(/.In the peritoneal cavity, the mouse was killed and unproduced ascites fluid collected. A total of 2 ml of ascites fluid containing 4.5 mg / ml immunoglobulin was obtained. AFP-03 antibody reacted with a specific antigen (human alpha-fetoproteinera) in an enzyme-linked immunoassay (using a horseradish peroxidase labeled porcine anti-mouse antibody) up to a 1: 10µ dilution and in a radioimmunoassay (using a rabbit antiserum against mouse immunoglobulin and polyethylene glycol) precipitation of antigen-monoclonal antibody complexes) up to a 1: 1 dilution (/.
Příklad 2Example 2
Monoklonální protilátku AFP-03 bylo možno použít pro stanovení koncentrace alfa-fetoproteinu v sendvičovém enzymoimunologickém testu v kombinaci s jinými monoklonálními protilátkami pro alfa-fetoproteinu (AFP-01 nebo AFP-11),a to s použitím imobilizované protilátky AFP-01 nebo AFP-11 a protilátky AFP-03 konjugovane s peroxidázou.The monoclonal antibody AFP-03 could be used to determine the alpha-fetoprotein concentration in a sandwich enzyme immunoassay in combination with other alpha-fetoprotein monoclonal antibodies (AFP-01 or AFP-11) using immobilized AFP-01 or AFP- 11 and the AFP-03 antibody conjugated to peroxidase.
Příslušná monoklonální protilátka (AFP-01 nebo AFP-11) byla částečně čištěna z ascitické tekutiny srážením nasyceným roztokem síranu amonného do 50¾ nasycení, naředěna fyziologickým roztokem na koncentraci 5O£2OO/Ug/ml a imobilizována adsorpcí na povrch jamek polystyrénových kultivačních destiček s plochým dnem (1 h při 37°C). Po promytí jamek fyziologickým roztokem byla zbývající adsorpčně aktivní místa na polystyrénovém povrchu jamek blokována inkubací s roztokem želatiny ve fyziologickém roztoku (2 h, 37°C). Vzorky standardů lidského séra (0,1 ml) obsahující známé koncentrace alfa-fetoproteinu (0e200 ng/ml) byly inkubovány v takto připravených jamkách 16 h při 4°C a po promytí fyziologickým roztokem bylo přidáno 0,1 ml roztoku konjugátu monoklonální protilátky AFP-03 s peroxidázou (připraven metodou popsanou v odborné literatuře (Tijssen, P., Kurstak, E.: Highly efficient and simple methods for the preparation of peroxidaseThe respective monoclonal antibody (AFP-01 or AFP-11) was partially purified from the ascites fluid by precipitation with saturated ammonium sulfate solution to 50¾ saturation, diluted with saline to a concentration of 50,000? 200 / Ug / ml, and immobilized by adsorption to the wells of flat polystyrene culture plates. day (1 h at 37 ° C). After washing the wells with saline, the remaining adsorption active sites on the polystyrene surface of the wells were blocked by incubation with a gelatin solution in saline (2 h, 37 ° C). Samples of human serum standards (0.1 ml) containing known concentrations of alpha-fetoprotein (0e200 ng / ml) were incubated in the thus prepared wells for 16 h at 4 ° C, and after washing with saline, 0.1 ml of the monoclonal antibody AFP conjugate solution was added. -03 with peroxidase (prepared by method described in scientific literature (Tijssen, P., Kurstak, E .: Highly efficient and simple methods for preparation of peroxidase)
263 121 and active peroxidase-antibody conjugates for enzyme immunoassays, Anal. Biochem. 136:451«457, 1984), naředěn na koncentraci 10«100yUg/ml v 50% hovězím séru ve fyziologickém roztoku). Po 2 h inkubace při 4°C byly jamky promyty fyziologickým roztokem,bylo přidáno 0,1 ml substrátového roztoku (0,1% roztok o-diaminobenzen dichloridu v 0,1 M fosfátovém pufru pH 6,0 obsahujícím 0,02% peroxid vodíku) a po 10<20 minutách byla chromogenní enzymatická reakce zastavena přidáním 0,1 ml 2 M roztoku kyseliny sírové a byla změřena intenzita vzniklého zabarvení spektrofotometru při 492 nm (OD^^). Jako negativní srovnávací vzorek, k němuž byly získané hodnoty vztahovány, byl použit standard lidského séra neobsahující žádný alfa-fetoprotein detekovatelný komerční rádioimunologickou soupravou. Typické hodnoty 0D^52 byly O,O5bžP,2 pro vzorky obsahující 10 ng/ml alfa-fetoproteinu a 0,7«ž1 ,2 pro vzorky obsahující 100 ng/ml, v závislosti na použité imobilizované monoklonální protilátce a na použitém ředění konjugátu AFP-03 s peroxidázou. Tyto hodnoty ukazují, že s využitím uvedených monoklonálních protilátek lze sestavit sendvičový enzymoimunologický test použitelný pro stanovení koncentrací alfa-fetoproteinu v diagnosticky žádoucím oboru koncentrací (alespoň 10 ng/ml).263 121 and active peroxidase-antibody conjugates for enzyme immunoassays, Anal. Biochem. 136: 451-457 (1984), diluted to a concentration of 10-100 µg / ml in 50% bovine serum in saline). After 2 h incubation at 4 ° C, the wells were washed with saline, 0.1 ml substrate solution (0.1% o-diaminobenzene dichloride solution in 0.1 M phosphate buffer pH 6.0 containing 0.02% hydrogen peroxide) was added. ) and after 10 <20 minutes, the chromogenic enzymatic reaction was stopped by adding 0.1 ml of a 2 M sulfuric acid solution and the intensity of the resulting color of the spectrophotometer was measured at 492 nm (OD). A human serum standard containing no alpha-fetoprotein detectable by a commercial radioimmunoassay was used as a negative control to which the values were related. Typical 0D- 52 values were 0, 50bP, 2 for samples containing 10 ng / ml alpha-fetoprotein and 0.7 µ1, 2 for samples containing 100 ng / ml, depending on the immobilized monoclonal antibody used and the AFP conjugate dilution used. -03 with peroxidase. These values indicate that a sandwich enzyme immunoassay useful for determining alpha-fetoprotein concentrations in a diagnostically desirable concentration range (at least 10 ng / ml) can be constructed using said monoclonal antibodies.
Buňky hybridomu AFP-03 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsdj doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3 caM), pyruvát sodný (1 mM). Toto médium (označované jako RPMI, Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu AFP-03 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0.05 mM) pufrem HEPES (kyselina N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N*-2 ethansulfonová) (10 mM) a inaktivovaným bovinním sérern (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%). Hybridom je kultivován při 37°C. Střední generační čas je 18,2 hod. Produkovaná protilátka je monoklonální imuno263 121 globulin podtřídy IgG1 s lehkými řetězci typu K. , její isoelektrický bod je v rozmezí pH 6,7ež7,O.AFP-03 hybridoma cells have an ultrastructural pattern of typical myeloma cells. They grow in vitro as semi-suspension cultures. The basic culture medium is Eagle's minimum essential medium with Hanks salt mixture supplemented with non-essential amino acids, L-glutamine (3 caM), sodium pyruvate (1 mM). This medium (referred to as RPMI, Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences) is supplemented with penicillin, streptomycin, gentamycin, 2-mercaptoethanol (0.05 mM) in HEPES buffer (N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N * -2) ethanesulfone) (10 mM) and inactivated bovine serum (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%). The hybridoma is cultured at 37 ° C. The mean generation time is 18.2 hrs. The antibody produced is monoclonal immuno263 121 globulin subclass IgG1 with light chain type K. Its isoelectric point is in the range of pH 6.7 to 7.0.
Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem AFP-03 reaguje specificky s lidským alfa-fetoproteinem.The monoclonal antibody produced by the AFP-03 hybridoma reacts specifically with human alpha-fetoprotein.
Hybridom AFP-03 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti lidskému alfa-fetoproteinu v metodách analytických nebo preparativních.The AFP-03 hybridoma can be used industrially as a source of monoclonal antibody against human alpha-fetoprotein in analytical or preparative methods.
Monoklonální protilátka hybridomu AFP-03 může být využita pro analytické stanovení alfa-fetoproteinu při klinické diagnostice ve zdravotnických zařízeních, zvláště pro diagnosu nádorových onemocnění (hepatomy, teratomy atd.) nebo kongenitální malformace (rozštěp páteře - spina bifida plodu).The monoclonal antibody of AFP-03 hybridoma can be used for analytical determination of alpha-fetoprotein in clinical diagnostics in health care facilities, especially for diagnosis of cancer (hepatoma, teratoma etc.) or congenital malformations (cleft spine - fetal spina bifida).
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS877924A CS263121B1 (en) | 1987-11-05 | 1987-11-05 | Mouse lymphocytaric hybridome producing antibody against human alpha-fetoproteine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS877924A CS263121B1 (en) | 1987-11-05 | 1987-11-05 | Mouse lymphocytaric hybridome producing antibody against human alpha-fetoproteine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS792487A1 CS792487A1 (en) | 1988-08-16 |
| CS263121B1 true CS263121B1 (en) | 1989-04-14 |
Family
ID=5429208
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS877924A CS263121B1 (en) | 1987-11-05 | 1987-11-05 | Mouse lymphocytaric hybridome producing antibody against human alpha-fetoproteine |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS263121B1 (en) |
-
1987
- 1987-11-05 CS CS877924A patent/CS263121B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS792487A1 (en) | 1988-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Uotila et al. | Two-site sandwich enzyme immunoassay with monoclonal antibodies to human alpha-fetoprotein | |
| Stähli et al. | [20] Distinction of epitopes by monoclonal antibodies | |
| WO2021190587A1 (en) | Broad-spectrum microcystin monoclonal antibody and preparation method therefor | |
| ES2382487T3 (en) | Antibody for analysis of ADAMTS activity13 and activity analysis method | |
| Borrebaeck et al. | Production and characterization of a monoclonal antibody against the seed lectin of the Dolichos biflorus plant. | |
| KR101159011B1 (en) | hapten compound and antibody | |
| CS263121B1 (en) | Mouse lymphocytaric hybridome producing antibody against human alpha-fetoproteine | |
| CS263122B1 (en) | Mouse lymphocytaric hybridom producing antibody against human alpha-fetoproteine | |
| SU1685997A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to human thyrotropin | |
| CS240846B1 (en) | Mouse lymphatic hybridom img czas in-%4 | |
| CS243348B1 (en) | Mousy lymphocytoid hybridom img-czas hft-21 | |
| CS263123B1 (en) | Mouse lymphocytaric hybridome producing antibody against human alpha-fetoproteine | |
| CS235850B1 (en) | Mousy lymphocytare hybridome producing anti-matter against human transferine | |
| CS253336B1 (en) | Mouse lymphocytar hybridome img czas rt-12 | |
| CS238780B1 (en) | Mouse-type lymphocytic hybridom img-czas htf %1 | |
| CS228858B1 (en) | Mouse lymphocytic hybridom producing an antisubstance against hog g-immunoglobulin | |
| CS233810B1 (en) | Mousy lymphocytoid hybride generating antimatter against piggish and human insulin | |
| CS236001B1 (en) | Mousy lymphocytare hybridome producing anti-substace against human transferine | |
| FR2652163A1 (en) | METHOD OF DETECTING BIOLOGICAL SUBSTANCE USING LIGANDS | |
| SU1712411A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to immunoglobulin g of baboons | |
| CS244398B1 (en) | Mousy lymphocytoid hybridome img-czas al 01 | |
| CS222781B1 (en) | Electromotor with friction brake with decreased noise | |
| CS239761B1 (en) | Agent img czas t3-01 protecting from triiodidetyronine | |
| CS248383B1 (en) | Mousy lymphocite hybridome img czas mem-19 | |
| CS228857B1 (en) | Mouse lymphocytic hybridom producing an antisubstance a |