CS248383B1

CS248383B1 - Mousy lymphocite hybridome img czas mem-19

Info

Publication number: CS248383B1
Application number: CS406585A
Authority: CS
Inventors: Ivan Hilgert; Vaclav Horejsi; Hana Kristofova
Original assignee: Ivan Hilgert; Vaclav Horejsi; Hana Kristofova
Priority date: 1985-06-06
Filing date: 1985-06-06
Publication date: 1987-02-12

Abstract

Řešeni se týká myšího lymfocytárního hybridami, produkujícího protilátku proti lehkánu řetězci typu kappa lidských imunoglobulinů, uloženého ve sbírce hybridomů ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MEM-09. Monoklonální protilátka hybridami MEM-09 je vhodná pro použití v radioimunologické, nepřímé enzymoimunologické a imunofluorescenční analýze a pro čištění afinitní chronatografií lidských imunoglobulinů obsahujících lehké řetězce typu kappa.The solution concerns mouse lymphocytic antibody-producing hybrids human immunoglobulin kappa-type light chain, stored in the hybridoma collection Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences under the designation MEM-09. Monoclonal antibody Hybrid MEM-09 is suitable for use in radioimmunologic, indirect enzyme-immunological and immunofluorescence analysis and pro human affinity chronatography purification immunoglobulins containing light chains kappa type.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myěí myelomové linie Sp2/O-Agl4 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti kappa lehkým řetězcům lidských imunoglobulinů.The invention relates to a novel hybridoma, i.e., a hybrid unicellular organism, constructed by fusing a mouse myeloma cell line Sp2 / O-Ag14 and a mouse spleen lymphoid cell producing an antibody against kappa light chains of human immunoglobulins.

Doposud se protilátky proti lehkým řetězcům imunoglobulinů vyrábějí tak, že kappa řetězce imunoglobulinu jsou opakovaně injikovány jako antigen pokusným zvířatům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvantitativní stanovení kappa řetězců imunoglobulinu v séru nebo na lymfoidních nebo leukemickcých buňkách metodou radlolmunologické analýzy nebo nepřímé imunofluorescenční analýzy.To date, antibodies against immunoglobulin light chains have been produced by immunoglobulin kappa chains being repeatedly injected as antigen into test animals. The serum of the immunized animals collected after a period of antigen treatment serves as a source of antibodies, used in particular for the quantitative determination of immunoglobulin kappa chains in serum or on lymphoid or leukemic cells by the method of radol immunology or indirect immunofluorescence analysis.

Tento postup, nazývaný konvenčni imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu.This procedure, called conventional immunization, has several drawbacks. In the serum of immunized animals there is a heterogeneous mixture of antibodies whose spectrum varies and does not repeat in each individual organism. Generally, in addition to antibodies to the desired antigen, the organism will produce antibodies against the impurities of the antigen preparation.

Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit čistý imuni2ační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.Consequently, batches of conventional sera are difficult to standardize and are based on production in a wide quality range. Pure immunization antigen and other antigens to saturate ballast antibodies against impurities should be prepared for each batch.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridou, produkující monoklonální protilátku proti kappa řetězcům lidského imunoglobulinu, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1083, pod označením IMG CZAS MEM-09.The above mentioned drawbacks of the above-mentioned and hitherto used procedure will be eliminated if it is available by a hybrid producing monoclonal antibody against kappa chains of human immunoglobulin, deposited in the Collection of Hybridomas of the Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences in Prague 4, Vídeňská No. 1083. .

Uvedený hybridem byl získán způsobem známým z odborné literatury /Fazekas de St. Groth, S., Scheidegger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactlcs, J. Immunol. Meth., 35:1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. : Antibodies to major histoccmpatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře,Said hybrid was obtained by a method known in the literature / Fazekas de St. Groth, S., Scheidegger, D .: Production of Monoclonal Antibodies: Strategies and Tactics, J. Immunol. Meth., 35: 1-21 (1980); Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to Major Histocompatibility Antigens Produced by Hybrid Cell Line, Nature,

266:550, 1977/ klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelaitové linie Sp2/O-Agl4 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c imunizovaných lidským imunoglobulinem.266: 550, 1977 / cloning a set of hybrid cells resulting from the fusion of Sp2 / O-Ag14 murine myelaitic cells and cells derived from the spleen of BALB / c mice immunized with human immunoglobulin.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s kappa lehkými řetězci lidských imunoglobulinů. Hybridom MEM-09 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c.The advantage of the hybridoma is that it produces a homogeneous antibody, the so-called monoclonal antibody, which is capable of specifically reacting with kappa light chains of human immunoglobulins. The MEM-09 hybridoma can be cultured in vitro in animal cell media and is adapted for growth in vivo in the peritoneal cavity of BALB / c mouse mice.

Z konzerv uchovávaných v kapalném dusíku je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka produkovaná hybridomem MEM-09 reaguje specificky jak s lidským imunoglobulinem, tak s populacemi lidských B buněk nesoucích jako složku buněčné membrány kappa řetězce imunoglobulinové molekuly a není třeba se zbavovat protilátek balastních.From cans stored in liquid nitrogen, antibody production can be started without additional antigen. The antibody produced by the MEM-09 hybridoma reacts specifically with both human immunoglobulin and human B cell populations carrying the immunoglobulin molecule kappa chain component of the cell membrane and does not need to be rid of ballast antibodies.

PřikladlHe did

Za účelem pannožení hybridcmových buněk in vivo bylo aplikováno 5 x 10® buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk byla myš 10 dní před, přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem /0,5 ml intraperitoneálně/. Po 14 dnech růstu hybridomu v peritoneální dtuině byla myš zabita a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána.5 x 10 6 cells were injected into the peritoneal cavity of mice to hybridize the cells in vivo. To improve attachment of the cells applied, the mice were treated with paraffin oil (0.5 ml intraperitoneally) 10 days before hybridoma cell transfer. After 14 days of hybridoma growth in the peritoneal dtuin, the mouse was killed and the produced ascites fluid collected.

Celkem bylo získáno 1,5 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 10 mg/ml imunoglobulinu.A total of 1.5 ml of ascites fluid containing 10 mg / ml immunoglobulin was obtained.

Protilátka reagovala se specifickým antigenem /lidským imunoglobulinem/ v enzymoimunologickém testu /při použití prasečí antimyší protilátky značené křenovou peroxidázou/ až do ředěníThe antibody reacted with a specific antigen (human immunoglobulin) in an enzyme-linked immunoassay (using horseradish peroxidase labeled porcine anti-mouse antibody) until dilution

Monoklonální protilátka reagovala specificky v nepřímém imunofluorescenčním nebo enzymoimunologickém testu s částí lymfocytů periferní krve. Oběma metodami bylo zjištěno 15 až 20 * pozitivních buněk v enzymolmunologickém testu až do řešení ascitické plazmy lilO⁴ a v testu nepřímo fluorescence až do ředění 1:1θ\ Při použití čištěných populací τ _a b iymfoeytú byla zjištěna reaktivita protilátky MEM-09 s 50 až 60 % B lymfocytů a 1 % T lymfocytů. Negativní byly monocyty, granulocyty a erytrhocyty.The monoclonal antibody reacted specifically in an indirect immunofluorescence or enzyme-immunoassay with a portion of peripheral blood lymphocytes. Both methods were found 15 to 20 * of positive cells enzymolmunologickém assay until solution ascitic plasma Lilo ⁴ and test indirect fluorescence up to a dilution of 1: 1θ \ using purified populations τ _b iymfoeytú was detected reactivity antibody MEM-09 with 50- 60% B lymphocytes and 1% T lymphocytes. Monocytes, granulocytes and erythrocytes were negative.

Příklad 2Example 2

Ze 2 ml ascitické tekutiny obsahující protilátku MEM-09 byla připravena globulinová frakce precipitací síranem amonným a navázána na 2 ml CNBr-aktivované Sepharosy 4B. Na 1 ml kolonku připravenou z tohoto imunosorbentu bylo naneseno 0,5 ml lidského séra a po promytí 10 ml fyziologického roztoku byl specificky adsorbovaný antigén vymyt celkem 2,5 ml 0,1 M glycin-HCl pufru pH 2,2 a eluát byl ihned neutralizován 1 M fosfátovým pufrem pH 7,2.A globulin fraction was prepared from ammonium sulfate precipitation from 2 ml of ascitic fluid containing MEM-09 and bound to 2 ml of CNBr-activated Sepharose 4B. 0.5 ml of human serum was applied to a 1 ml column prepared from this immunosorbent, and after washing with 10 ml of saline, the specifically adsorbed antigen was washed with a total of 2.5 ml of 0.1 M glycine-HCl buffer pH 2.2 and the eluate immediately neutralized. 1 M phosphate buffer pH 7.2.

Celkový výtěžek byl 4 mg imunoglobulinu, jehož identita a čistota byla prokázána elektroforetickými metodami. Preparát obsahoval převážně IgG a poskytoval v dvojité imunodifuzi v agarosovém gelu preclpitační linii s králičím antisérem proti lidským kappa řetězcům, ale nikoli s antisérem proti lambda řetězcům /Sevac, Praha/.The total yield was 4 mg of immunoglobulin, the identity and purity of which was demonstrated by electrophoretic methods. The preparation consisted predominantly of IgG and provided, in double agarose gel immunodiffusion, a preclpitation line with rabbit antisera against human kappa chains but not with antisera against lambda chains (Sevac, Prague).

Po 3x opakovaném nanesení původního vzorku séra na regenerovanou kolonku imunosorbentu /regenerace provedena prostým převedením do neutrálního fyziologického roztoku až se z imunosorbentu již žádný antigén nevymýval/ jsme získali nenavázanou část séra, která již neposkytovala precipitační linii s antisérem proti kappa řetězcům, ale precipitovala s antisérem proti lambda řetězcům.After 3 replicating of the original serum sample onto the regenerated immunosorbent column / regeneration by simple transfer to neutral saline until no more antigen was eluted from the immunosorbent / we obtained unbound portion of serum which no longer provided a precipitation line with antiserum against kappa chains but precipitated with antiserum against lambda chains.

Po SDS PAGE lidského séra nebo antigénu izolovaného afinitní chromatografií na imobilizované protilátce MEM-09 a převedení separovaných komponent na nitrocelulózu se enzyraoimunologicky barvila výrazně komponenta o relativní molekulové hmotnosti 26 000. Všechny tyto výsledky souhlasí se závěrem, že protilátka MEM-09 reaguje s determinantou na lehkých řetězcích imunoglobulinů typu kappa.Following SDS PAGE of human serum or antigen isolated by affinity chromatography on immobilized MEM-09 antibody and conversion of the separated components to nitrocellulose, the 26,000 molecular weight component was enzymatically immunologically stained. All these results agree that MEM-09 reacts with a determinant of kappa immunoglobulin light chains.

Buňky hybridomu MEM-09 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. Cytoplazma obsahuje velké množství polyriboscmů, mitochondrie a slabě vyvinuté endoplasmatické retikulum. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin /3 mM/, pyruvát sodný /1 mM/.MEM-09 hybridoma cells have an ultrastructural pattern of typical myeloma cells. Cytoplasm contains a large number of polyriboscites, mitochondria and poorly developed endoplasmic reticulum. They grow in vitro as semi-suspension cultures. The basic culture medium is Eagle's minimum essential medium with Hanks salt mixture supplemented with non-essential amino acids, L-glutamine (3 mM), sodium pyruvate (1 mM).

Toto médium /označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV/ je pro kultivaci hybridcmu MEM-09 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem /0,05 mM/, pufrem HEPES /10 mM/ a inaktivovaným bovínním sérem /Bioveta, Ivanovice na Hané,This medium (referred to as H-MEMd, Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences) is supplemented with penicillin, streptomycin, gentamycin, 2-mercaptoethanol (0.05 mM), HEPES buffer (10 mM) and inactivated bovine serum for cultivation of hybrid MEM-09. , Ivanovice na Hané,

V·IN·

Hybridem je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 17,2 hod. a 10 měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 94. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGl s lehkými řetězci typu kappa, její isoelektrický bod je pH 5,8 až 6,3.The hybrid is cultured at 37 ° C. The mean generation time is 17.2 h and 10 months after construction, the modal number of chromosomes was 94. The antibody produced is a monoclonal immunoglobulin of IgG1 subclass with light chains of kappa type, its isoelectric point is pH 5.8 to 6.3.

Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem MEM-09 reaguje specificky s kappa lehkými řetězci lidských imunoglobulinů.The monoclonal antibody produced by the MEM-09 hybridoma reacts specifically with kappa light chains of human immunoglobulins.

Hybridem MEM-09 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti lehkým řetězcům typu kappa lidských imunoglobulinů v metodách analytických anebo preparativních.The MEM-09 hybrid can be used industrially as a source of monoclonal antibody against human immunoglobulin kappa-type light chains in analytical or preparative methods.

Monoklonální protilátka hybridomu MEM-09 může být využita pro analytické stanovení lidských imunoglobulinů s lehkým řetězcem typu kappa /v séru nebo jiných tělních tekutinách/ nebo ke kvantitativnímu stanovení subpopulace B lymfocytů nebo typu leukemických buněk nesoucích lehké řetězce kappa typu imunoglobulinů při klinické diagnostice ve zdravotnických zařízeních, zvláště při poruchách imunologického systému a nádorových onemocněních.The monoclonal antibody of the hybridoma MEM-09 can be used for the analytical determination of human kappa light chain immunoglobulins (in serum or other body fluids) or for the quantitative determination of B lymphocyte subpopulations or of leukemic cells carrying immunoglobulin kappa light chain type in clinical diagnostics especially in immunological system disorders and cancer.

imobilizované monoklonální protilátky může být použito k čištění kappa řetězce lidských imunoglobulinů pomocí afinitní chromatografie.immobilized monoclonal antibodies can be used to purify the kappa chain of human immunoglobulins by affinity chromatography.

Claims

Mouse lymphocyte hybridoma IMG CZAS MEM-09 producing a monoclonal antibody of IgG1 subclass against kappa chains of human immunoglobulins.