CS248382B1

CS248382B1 - Mouse lymphocyte hybrtoma IMG CZAS MEM-18

Info

Publication number: CS248382B1
Application number: CS406485A
Authority: CS
Inventors: Ivan Hilgert; Vaclav Horejsi; Vladimir Bazil; Hana Kristofova
Original assignee: Ivan Hilgert; Vaclav Horejsi; Vladimir Bazil; Hana Kristofova
Priority date: 1985-06-06
Filing date: 1985-06-06
Publication date: 1987-02-12

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti membránovému antigénu lidských monocytů, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MEM-18. Monoklonální protilátka hybridomu MEM-18 je vhodná pro použití v nepřímé imunofluorescenční a enzymoimunologické analý ze lidských monocytů.The solution concerns a mouse lymphocyte hybridoma producing an antibody against the membrane antigen of human monocytes, stored in the hybridoma collection of the Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences under the designation MEM-18. The monoclonal antibody of the hybridoma MEM-18 is suitable for use in indirect immunofluorescence and enzyme-immunological analysis of human monocytes.

Description

(54) Myší lymfocytární hybrtdom IMG CZAS MEM-18(54) IMG CZAS MEM-18 Murine Lymphocytic Hybrid

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti membránovému antigénu lidských monocytů, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MEM-18. Monoklonální protilátka hybridomu MEM-18 je vhodná pro použití v nepřímé imunofluorescenční a enzymoimunologické analýze lidských monocytů.The invention relates to a murine lymphocyte hybridoma producing an antibody against the membrane antigen of human monocytes deposited in the hybridoma collection of the Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences under the designation MEM-18. The MEM-18 hybridoma monoclonal antibody is suitable for use in indirect immunofluorescence and enzymoimmunological assays of human monocytes.

Vynález se týká nového hybridamu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O-Agl4 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti membránovému antigenu přítomnému na lidských monocytech.The invention relates to a novel hybridoma, i.e., a hybrid unicellular organism, constructed by fusing a mouse myeloma cell line Sp2 / O-Ag14 and a mouse spleen lymphoid cell, producing an antibody against a membrane antigen present on human monocytes.

Monocyty mají základní důležitost v imunitním systému. Počet monocytů se při imunodeficiencích a jiných patologických stavech liší od fyziologické normy.Monocytes are essential in the immune system. The number of monocytes differs from the physiological norm in immunodeficiency and other pathological conditions.

Doposud se protilátky proti membránovým antigenům vyrábějí tak, že buněčné suspenze nebo membránové frakce jsou opakovaně injikovány produkčním zvířatům, nejčastěji králíkům.To date, antibodies against membrane antigens have been produced by cell suspensions or membrane fractions being repeatedly injected into production animals, most commonly rabbits.

Sérum takto imunisovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek.Serum of animals immunized in this way, collected after a period of antigen treatment, serves as a source of antibodies.

Takto jsou například připravovány protilátky proti thymocytům, které jsou používány k imunosupresi při transplantaci orgánů v klinické medicíně. Tento postup, nazývaný konvenční imunisací, má neodstranitelnou nevýhodu v tom, že séra obsahují protilátky proti mnoha membránovým antigenům, z nichž některé jsou přítomny na více typech buněk; séra proto nelze použít k jemnému rozlišení buněčných typů a tříd.Thus, for example, antibodies against thymocytes are prepared which are used for immunosuppression in organ transplantation in clinical medicine. This procedure, called conventional immunization, has the inevitable disadvantage that sera contain antibodies against many membrane antigens, some of which are present on multiple cell types; therefore, sera cannot be used to subtly differentiate cell types and classes.

Nevýhody konvenčních sér proti membránovým antigenům v principu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je zaměřena vždy proti jediné antigenní determinantě.In principle, the use of hybridoma technology eliminates the disadvantages of conventional sera against membrane antigens. The hybridoma product - a monoclonal antibody - is directed against a single antigenic determinant.

Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridomů, je pravděpodobné, že se z něho podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která rozeznává antigenní determinantu charakterizující určitý typ leukocytů.If a sufficiently large set of hybridomas is constructed, it is likely that a hybridoma synthesizing an antibody that recognizes the antigenic determinant characterizing a particular type of leukocyte is likely to be found.

Dosud se obvykle počet monocytů zjištoval histologicky a histochemicky. Většina monocytů je morfologicky odlišitelná od ostatních jaderných buněk v krvi, přesto je přednostně používáno histochemických testů.Until now, the number of monocytes has usually been determined histologically and histochemically. Most monocytes are morphologically distinguishable from other nuclear cells in the blood, yet histochemical assays are preferred.

Podle publikovaných výsledků /Kung, P. C., Talie, M. A., DeMaria, Μ. E., Butler, M. S., Lifter, J., Goldstein, G.s Strategies for generating monoclonal antibodies defining human T-lymphocyte differentiation antigens. Transplant. Proč. 12, Suppl. 1:141-146, 1980/ se dá soudit, že lze připravit monoklonální protilátka specificky detegující monocyty, která by mohla nahradit dosud používané histochemické techniky.According to published results / Kung, P.C., Talie, M.A., DeMaria, Μ. E., Butler, M. S., Lifter, J., Goldstein, G. Strategies for generating monoclonal antibodies defining human T-lymphocyte differentiation antigens. Transplant. Why. 12, Suppl. 1: 141-146, 1980], it can be concluded that a monoclonal antibody specifically detecting monocytes can be prepared which could replace the histochemical techniques used hitherto.

Podstatného pokroku v diagnostice lidských monocytů projevujícího se vyšší spolehlivostí analytického výsledku, se dosáhne, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti antigenu přítomnému na lidských monocytech, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č, 1083, pod označením IMG CZAS MEM-18.Substantial progress in the diagnosis of human monocytes resulting in higher reliability of the analytical result will be achieved when a hybridoma producing a monoclonal antibody against the antigen present on human monocytes is available, deposited in the Hybridoma Collection of the Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences in Prague 4, Vídeňská No. 1083. under the designation IMG CZAS MEM-18.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury /Pazekas de St. Groth,The hybridoma was obtained by a method known in the literature. Groth,

S., Scheidegger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth., 35:1-21, 1980, Galfré, G., Howe S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře, 266:550, 1977/ klonováními souboru hybridních buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c imunizovaných směsí proteinů z moče pacientů s poškozenou ledvinou. Proteinová frakce obsahovala komponentu, která je přítomná na lidských monocytech.S., Scheidegger, D .: Production of Monoclonal Antibodies: Strategies and Tactics, J. Immunol. Meth., 35: 1-21, 1980, Galfre, G., Howe SC, Milstein, C., Butcher, GW, Howard, JC: Antibodies to Major Histocompatibility Antigens Produced by Hybrid Cell Lines, Nature, 266: 550, 1977 cloning a set of hybrid cells obtained from the spleen of BALB / c mice immunized with a mixture of proteins from the urine of patients with renal impairment. The protein fraction contained a component that is present on human monocytes.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidskými monocyty. Hybridom MEM-18 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konzerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez další potřeby antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem MEM-18 reaguje specificky s lidskými monocyty a není třeba se zbavovat protilátek balastních.The advantage of the hybridoma is that it produces a homogeneous monoclonal antibody that is capable of specifically reacting with human monocytes. The MEM-18 hybridoma can be cultured in vitro in animal cell media and is adapted for growth in vivo in the peritoneal cavity of BALB / c mouse mice. From cans stored in liquid nitrogen, antibody production can be started without the need for antigen. The antibody produced by the MEM-18 hybridoma reacts specifically with human monocytes and does not need to be rid of ballast antibodies.

P ř ί k 1 a dExample 1 a d

Za účelem pomnožení hybridcmových buněk in vivo bylo aplikováno 4 x 10⁶ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem /0,5 ml intraperitoneálně/. Po 10 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš uhubena a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána.To expand the hybridoma cells in vivo, 4 x 10 ⁶ cells were injected into the peritoneal cavity of mice. To improve attachment of the cells applied, the mice were treated with paraffin oil (0.5 ml intraperitoneally) 14 days prior to transfer of the hybridoma cells. After 10 days of hybridoma growth in the peritoneal cavity, the mouse was exterminated and the produced ascites fluid was collected.

Celkem bylo získáno 2,5 ml ascltické tekutiny, která obsahovala 3 mg/ml imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala specificky s monocyty periferní krve v nepřímém imunofluorescenčním a enzymoimunologickém testu. Lymfocyty, granulocyty a erythrocyty s protilátkou nereagovaly.A total of 2.5 ml of aspartic fluid containing 3 mg / ml immunoglobulin was obtained. The monoclonal antibody reacted specifically with peripheral blood monocytes in an indirect immunofluorescence and enzyme immunoassay. Lymphocytes, granulocytes and erythrocytes did not react with the antibody.

Specifita protilátky je identická s komerční monoklonální protilátkou MY-4, jak bylo prokázáno opakovanými paralelními stanoveními včetně použití směsí obou protilátek, a to jak v případě směsi periferních lymfocytů, tak u izolovaných monocytů z periferní krve /viz tab./. Reaguje s proteinovou frakcí moče některých pacientů s poškozenou ledvinou.The specificity of the antibody is identical to the commercial monoclonal antibody MY-4, as demonstrated by repeated parallel assays, including the use of mixtures of both antibodies, both for a mixture of peripheral lymphocytes and isolated peripheral blood monocytes (see Table). It reacts with the protein fraction of the urine of some patients with renal impairment.

TabulkaTable

Reaktivita protilátek produkovaných hybrldamem MEM-18 a MY-4¹ s buňkami periferní krveReactivity of antibodies produced hybrldamem MEM-18 and MY-4 ^one with peripheral blood cells

Buňky periferní 2 lidské krve Peripheral cells 2 of human blood % pozitivních buněk reagujících s monoklonální protilátkou v nepřímém enzymoimunologickém3 a imunofluorescenčním testu⁴ % of positive cells reacting with monoclonal antibody in indirect enzyme immuno-immunological3 and immunofluorescence assay ⁴ Směs Mixture + MY-4 + MY-4 MEM-18 MEM-18 MY-4 MEM-18 MY-4 MEM-18 lymfocyty lymphocytes 1 1 1 1 1 1 monocyty monocytes 95 95 95 95 95 95 granulocyty granulocytes 1 1 1 1 1 1 erythrocyty erythrocytes 1 1 1 1 1 1

¹^ Komerční monoklonální protilátka od firmy Coulter Immunology, Hialeah, Floria, USA. ¹ ^ a commercial monoclonal antibody from Coulter Immunology, Hialeah, Florio USA.

2/ Buňky lidské periferní krve byly izolovány popsanou metodou /Boyum, A.: Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Immunol. 5, Suppl. 5:9, 1976/ na Verografln-Ficoll gradientu.2) Human peripheral blood cells were isolated by the method described [Boyum, A .: Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Immunol. 5, Suppl. 5: 9, 1976) on a Verographin-Ficoll gradient.

³/ Byl použit postup podle práce Lansdorp, Ρ. Μ., Astaldi, G. C. B., Oosterhof, F., Janssen, M. C., Zeijlemaker, W. P.: Immunoperoxidase procedures to detect monoclonal antibodies against cell surface antigen. Quantitation of binding and staining of individual cells. J. Immunol. Meth. 39:393-405, 1980. ³ / The procedure of Lansdorp, Ρ. Stal., Astaldi, GCB, Oosterhof, F., Janssen, MC, Zeijlemaker, WP: Immunoperoxidase procedures to detect monoclonal antibodies against cell surface antigen. Quantitation of binding and staining of individual cells. J. Immunol. Meth. 39: 393-405 (1980).

⁴/ Byla použita nepřímá imunofluorescenční technika s využitím-prasečího antimyšího imunoglobulinu značeného fluoresceuinisothiakyanátem /ÚSOL, Praha/. ⁴ ) An indirect immunofluorescence technique using a fluorescein-isothiocyanate-labeled porcine anti-mouse immunoglobulin was used (ÚSOL, Prague).

/ ' Monocyty lidské perferní krve byly izolovány popsanou metodou Recale, H. R.: A simple method of obtaining monocytes in suspenslon. J. Immunol. Meth., 69:71 až 77, 1984.Human peripheral blood monocytes were isolated as described by Recale, H. R., A simple method of obtaining monocytes in suspenslon. J. Immunol. Meth., 69: 71-77 (1984).

Granulocyty lidské periferní krve byly izolovány na diskontinuálním hustotním Percollovém gradientu /Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, švédsko/. Granulocyty byly získány na vrstvě Percollu o hustotě 1.09.Human peripheral blood granulocytes were isolated on a discontinuous density Percoll gradient (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden). Granulocytes were obtained on a Percoll layer with a density of 1.09.

Identita antigenů rozeznávaných protilátkami MEM-18 a MY-4 byla prokázána izolací příslušného antigenů Imunoafinitní chromatografií na Imobillzované protilátce MEM-18 a demonstrací silné reaktivity tohoto antigenů s protilátkou MY-4.The identity of the antigens recognized by MEM-18 and MY-4 was demonstrated by isolation of the respective antigens by Immunoaffinity Chromatography on Immobilized MEM-18 and demonstrating the strong reactivity of these antigens with MY-4.

Tento průkaz byl proveden následovně: částečně vyčištěná protilátka MEM-18 byla navázána na CNBr-Sepharosu 4B /Pharmacia, Uppsala, švédsko/ /5 mg/ml/. Směs proteinů z moče pacientů trpících proteinurií byla získána srážením síranem amonným do 75% nasycení, odsolenim dialysou proti vodě a lyofilizací.This demonstration was performed as follows: partially purified MEM-18 antibody was bound to CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia, Uppsala, Sweden) (5 mg / ml). The protein mixture from the urine of proteinuria patients was obtained by ammonium sulfate precipitation to 75% saturation, desalting by dialysis against water and lyophilization.

Byly vybrány vzorky močí, které obsahovaly co nejvyšší koncentraci rozpustné formy antigenů reagujícího s protilátkou MEM-18 /testovaného i inhibičním enzymolmunologickém testu/. Takto získaná směs proteinů byla rozpuštěna v PBS /0,14 M roztok NaCl pufrovaný 10 mM fosfátem pH 7,2/ a nanesena na kolonku Sepharosy 4B s kovalentně navázanou protilátkou MEM-18.Urine samples were selected that contained the highest concentration of soluble form of the antigen reactive with the MEM-18 antibody (both tested and inhibitory enzyme-immunoassay). The protein mixture thus obtained was dissolved in PBS (0.14 M NaCl buffered with 10 mM phosphate pH 7.2) and loaded onto a Sepharose 4B column with a covalently bound MEM-18 antibody.

Po důkladném promytí byl specificky adsorbovaný antigen vymyt roztokem 2% dodecylsulfátu sodného /SOS/ a. získaný vzorek analyzován elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS.After thorough washing, the specifically adsorbed antigen was eluted with 2% sodium dodecyl sulfate (SOS) solution and the obtained sample was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of SDS.

Po skončení elektroforézy byly separované proteiny elektroforeticky převedeny na nitrocelulózovou membránu /Towbin, H., Stachelin, T., Gordon, J.: Electrophoretic transfer of proteine fran polyaorylamide gels to nitrocellulose sheets: Proceduře and some applications.After electrophoresis, the separated proteins were electrophoretically converted to a nitrocellulose membrane / Towbin, H., Stachelin, T., Gordon, J .: Electrophoretic Transfer of Proteins in Polyaorylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications.

Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. 76:4350-4354, 1979/ a detegovány nepřímým enzymoimunologickým testem s využitím, příslušné monoklonální protilátky a prasečí antimyší protilátky konjugované s peroxidázou /OSOL, Praha/.Why. Nati. Acad. Sci. U. S. 76: 4350-4354, 1979] and detected by an indirect enzyme immunoassay using the appropriate monoclonal antibody and porcine peroxidase-conjugated porcine anti-mouse antibody (OSOL, Prague).

Jak protilátka MEM-18, tak MY-4 reagovaly silně s izolovaným antigenem /m. h. 55 000/.Both MEM-18 and MY-4 reacted strongly with isolated antigen / m. 55 000 h.

Stejný výsledek byl získán i v případě, že jako výchozí materiál pro izolaci antigenů byl 7 použit lyzát monocytů roztokem obsahujícím 1 % detergent NP-40 /10 buněk lýzováno 1 ml roztoku a nerozpustné zbytky odstraněny centrifugaci/.The same result was obtained when monocyte lysate was used as a starting material for antigen isolation with a solution containing 1% NP-40 detergent (10 cells lysed with 1 ml solution and insoluble residues removed by centrifugation).

Identita antigenů rozeznávaných protilátkami MEM-18 a MY-4 byla prokázána také tak, že antigen reagující s protilátkou MEM-18 byl nejprve odstraněn s povrchu monocytů /capping“ následovaný internalizací/ a pak byla testována reaktivita takto pozměněných buněk s protilátkou MY-4.The identity of the antigens recognized by MEM-18 and MY-4 was also demonstrated by first removing the antigen reacting with MEM-18 from the monocyte surface (capping followed by internalization) and then testing the reactivity of the altered cells with MY-4.

Bylo zjištěno, že po odstranění antigenů MEM-18 vymizí také schopnost monocytů vázat protilátku MY-4, zatímco reaktivita s protilátkou B2M-01 /Hilgert, I., Hořejší, V., Krištofová, H.: The use of murine monoclonal antibody B2M-01 for detection and purification of human j-microglobulin. Folia biol. /Praha/ 30:369-376, 1984/ se nezmění.It has been found that the ability of monocytes to bind MY-4 antibody also disappears when MEM-18 is removed, while reactivity with B2M-01 antibody / Hilgert, I., Hořejší, V., Krištofová, H. -01 for detection and purification of human j-microglobulin. Folia biol. (Prague) (30: 369-376, 1984) will not change.

Tento test byl prováděn tak, že roztok protilátky MEM-18 byl inkubován 30 min. při 20 °C s monocyty a poté 30 min. při 37 °C s protilátkou proti myšímu imunoglobulinu. S takto připravenými buňkami byl proveden běžný nepřímý imunofluorescenční test, tj. inkubace s protilátkami MEM-18, MY-4, B2M-01 a ve druhém Kroku s prasečím antimyším imunoglobulinem značeným fluoresceinisothiokyanatem.This assay was performed by incubating the MEM-18 antibody solution for 30 min. at 20 ° C with monocytes and then 30 min. at 37 ° C with an anti-mouse immunoglobulin antibody. The cells thus prepared were subjected to a conventional indirect immunofluorescence assay, i.e. incubation with MEM-18, MY-4, B2M-01 and, in the second step, with a fluorescein isothiocyanate-labeled anti-mouse immunoglobulin.

Buňky hybridami MEM-18 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. Cytoplasma obsahuje velké množství polyribosomů, mitochondrie a slabě vyvinuté endoplasmatické retikulum. In vitro rostou jako polosuspensní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin /3 mM/, pyruvát sodný /1 mM/.Cells with MEM-18 hybrids have an ultrastructural pattern of typical myeloma cells. Cytoplasma contains a large number of polyribosomes, mitochondria and poorly developed endoplasmic reticulum. They grow in vitro as semi-suspension cultures. The basic culture medium is Eagle's minimum essential medium with Hanks salt mixture supplemented with non-essential amino acids, L-glutamine (3 mM), sodium pyruvate (1 mM).

Toto médium /označované jako H-MEMd, Ostav molekulární genetiky ČSAV/ je pro kultivaci hybridomu MEM-18 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem /0,05 mM/, pufrem HEPES /10 mM/ a inaktivovaným bovinním sérem /Bloveta, Ivanovice na Hané,This medium (referred to as H-MEMd, OAS molecular molecular genetic status) is supplemented with penicillin, streptomycin, gentamycin, 2-mercaptoethanol (0.05 mM), HEPES buffer (10 mM) and inactivated bovine serum to cultivate the hybridoma MEM-18. , Ivanovice na Hané,

10%/. Hybridem je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 14,6 hod. a 6 měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 95. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobu lin podtřídy IgG s lehkými řetězci typu kappa, její isoelektrický bod je pH 5,9 až 6,1.10%. The hybrid is cultured at 37 ° C. The mean generation time is 14.6 h and 6 months after construction, the modal number of chromosomes was 95. The antibody produced is a monoclonal immunoglobulin linotype of the kappa light chain subclass IgG, its isoelectric point is pH 5.9 to 6.1.

Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem MEM-18 reaguje specificky s lidskými monocyty. Hybridom MEM-18 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti monocytům v analytických metodách.The monoclonal antibody produced by the MEM-18 hybridoma reacts specifically with human monocytes. The MEM-18 hybridoma can be used industrially as a source of monoclonal antibody against monocytes in analytical methods.

Monoklonální protilátka hybridomu MEM-18 může být využita pro stanovení monocytů v periferní krvi při klinické diagnostice v zdravotnických zařízeních, zvláště při různých imunologických nedostatečnostech a autoimunních onemocněních a při detekci některých typů myeloidních leukémií.The monoclonal antibody of the MEM-18 hybridoma can be used for the determination of peripheral blood monocytes in clinical diagnosis in healthcare facilities, particularly in various immunological deficiencies and autoimmune diseases, and in the detection of some types of myeloid leukemias.

Claims

OBJECT OF THE INVENTION

IMG CZAS MEM-18 mouse lymphocyte hybrid producing a monoclonal antibody of IgG1 subclass against the membrane antigen of human monocytes.