RU2377299C1 - STRAIN 5A10 OF PERMANENT HYBRIDOMAL LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO IgG OF CATTLE - Google Patents
STRAIN 5A10 OF PERMANENT HYBRIDOMAL LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO IgG OF CATTLE Download PDFInfo
- Publication number
- RU2377299C1 RU2377299C1 RU2008123099/13A RU2008123099A RU2377299C1 RU 2377299 C1 RU2377299 C1 RU 2377299C1 RU 2008123099/13 A RU2008123099/13 A RU 2008123099/13A RU 2008123099 A RU2008123099 A RU 2008123099A RU 2377299 C1 RU2377299 C1 RU 2377299C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cattle
- strain
- monoclonal antibodies
- cells
- igg
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, а именно к получению штаммов гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, которые могут быть использованы при изготовлении высокоспецифических диагностических реагентов для выявления антител крупного рогатого скота к различным инфекционным агентам, в частности вирусу лейкоза крупного рогатого скота.The present invention relates to the field of veterinary biotechnology, namely, to obtain strains of hybrid cells producing monoclonal antibodies that can be used in the manufacture of highly specific diagnostic reagents for the detection of antibodies of cattle to various infectious agents, in particular cattle leukemia virus.
Вирус лейкоза крупного рогатого скота вызывает злокачественное лимфопролиферативное заболевание крупного рогатого скота - лейкоз, который занимает первое место в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота в РФ. Инфекционный процесс характеризуется отсутствием виремии с одновременной продукцией антител к белкам вируса, среди которых преобладают антитела к гликопротеиду вирусной оболочки (gp51).The cattle leukemia virus causes a malignant lymphoproliferative disease in cattle - leukemia, which ranks first in the structure of cattle infectious pathology in the Russian Federation. The infectious process is characterized by the absence of viremia with the simultaneous production of antibodies to viral proteins, among which antibodies to the viral envelope glycoprotein (gp51) predominate.
Для диагностики болезни наиболее широко применяются серологические методы исследования, а именно реакция диффузионной преципитации в геле агара (РДП) и иммуноферментный анализ (ИФА).For the diagnosis of the disease, serological research methods are most widely used, namely the reaction of diffusion precipitation in agar gel (RDP) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Наибольшей чувствительностью и специфичностью при выявлении антител к вирусу лейкоза обладают тест-системы, в основу которых положен принцип иммуноферментного анализа. Использование моноклональных антител для приготовления меченных пероксидазой видоспецифических антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота позволяет повысить специфичность анализа. В разработанной нами тест-системе для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в биологических жидкостях крупного рогатого скота для иммобилизации антигена применяются моноклональные антитела овцы Ovis aries к гликопротеидному антигену вируса лейкоза, продуцируемые межвидовой гибридной линией 8С12 и моноклональные антитела мыши Mus. musculus к иммуноглобулину IgG овцы, продуцируемые штаммом 1Н8.The greatest sensitivity and specificity in detecting antibodies to the leukemia virus are test systems, which are based on the principle of enzyme-linked immunosorbent assay. The use of monoclonal antibodies for the preparation of peroxidase-labeled species-specific antibodies to cattle IgG immunoglobulin can increase the specificity of the analysis. In our test system for detecting antibodies to cattle leukemia virus in cattle biological fluids, Ovis aries sheep monoclonal antibodies to the leukemia virus glycoprotein antigen produced by the 8C12 interspecific hybrid line and Mus monoclonal antibodies are used to immobilize the antigen. musculus to sheep IgG immunoglobulin produced by strain 1H8.
Это обусловило необходимость использования в качестве детектирующих моноклональных антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота, не обладающих перекрестной иммунореактивностью с иммуноглобулинами овцы и мыши. Использование этих моноклональных антител для приготовления меченных пероксидазой видоспецифических антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота позволяет повысить специфичность анализа.This necessitated the use of cattle IgG immunoglobulins that do not have cross-reactivity with sheep and mouse immunoglobulins as detecting monoclonal antibodies to immunoglobulin. The use of these monoclonal antibodies for the preparation of peroxidase-labeled species-specific antibodies to cattle IgG immunoglobulin can increase the specificity of the analysis.
Известен штамм 7DS, продуцирующий моноклональные антитела к IgG крупного рогатого скота. Штамм 7DS продуцирует моноклональные антитела мыши подкласса γ1-иммуноглобулина G (IgG). Активность моноклональных антител в асцитной жидкости составляла 1:25600 в ИФА и 1:4 в РДП. Моноклональные антитела обладали широкой видоспецифичностью, реагируя с иммуноглобулинами не только крупного рогатого скота, но и человека, оленя, свиньи, мыши, овцы и козы [1].A known strain 7DS producing monoclonal antibodies to cattle IgG. Strain 7DS produces mouse monoclonal antibodies of the subclass of γ1-immunoglobulin G (IgG). The activity of monoclonal antibodies in ascites fluid was 1: 25600 in ELISA and 1: 4 in RDP. Monoclonal antibodies had a wide species-specificity, reacting with immunoglobulins not only in cattle, but also in humans, deer, pigs, mice, sheep and goats [1].
В задачу наших исследований входило получить штамм постоянной гибридомной линии клеток, обладающий in vitro высокой продукцией моноклональных антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота, не дающих перекрестных реакций с иммуноглобулинами овцы и позволяющих использовать их в иммуноферментном анализе в качестве детектирующих антител, меченных пероксидазой.The goal of our research was to obtain a strain of a constant hybridoma cell line that has in vitro high production of monoclonal antibodies to cattle IgG immunoglobulin, which do not give cross reactions with sheep immunoglobulins and allow their use in enzyme immunoassay as detection antibodies labeled with peroxidase.
Предлагаемый штамм гибридных клеток получен путем слияния клеток перевиваемой культуры миеломы мыши P3-X63-Ag-8. 653 с лимфоцитами селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной двукратно введением 100 мкг препарата иммуноглобулина IgG крупного рогатого скота, очищенного хроматографическими методами.The proposed strain of hybrid cells obtained by fusion of cells of an inoculated culture of mouse myeloma P3-X63-Ag-8. 653 with BALB / c mouse spleen lymphocytes immunized twice with 100 μg cattle immunoglobulin IgG preparation purified by chromatographic methods.
На высоте иммунного ответа (через 3 дня после последней инъекции) провели слияние спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии P3-X63-Ag-8. 653.At the height of the immune response (3 days after the last injection), splenocytes of immunized mice were fused with mouse P3-X63-Ag-8 mouse myeloma cells. 653.
Слияние клеток проводили по стандартной методике с использованием ПЭГ с м.м. 1500. Соотношение клеток миеломы и лимфоцитов составляло 1:4-1:10. Селекцию гибридом проводили на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Гибридомы культивировали на 96-луночных панелях производства фирмы «Nunc» на среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров в атмосфере, содержащей 5% СО2.Cell fusion was carried out according to standard methods using PEG with m.m. 1500. The ratio of myeloma cells and lymphocytes was 1: 4-1: 10. Hybridomas were selected on a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine. Hybridomas were cultured on 96-well panels manufactured by Nunc in RPMI-1640 medium supplemented with 10% serum of cow embryos in an atmosphere containing 5% CO 2 .
Скрининг гибридом на продукцию специфических моноклональных антител проводили методом твердофазного ИФА с использованием препаратов очищенных IgG крупного рогатого скота и овцы и мыши для сенсибилизации твердой фазы и конъюгата поликлональных видоспецифических антител к иммуноглобулину IgG мыши с пероксидазой - для выявления связавшихся антител.Hybridomas were screened for the production of specific monoclonal antibodies by the method of solid-phase ELISA using preparations of purified cattle and sheep and mouse IgG to sensitize the solid phase and conjugate of polyclonal species-specific antibodies to mouse IgG immunoglobulin with peroxidase to detect bound antibodies.
Клонирование и реклонирование клеточных культур проводили методом предельных разведений с использованием макрофагального фидерного слоя.Cloning and cloning of cell cultures was carried out by the method of limiting dilutions using a macrophage feeder layer.
В результате был отобран и размножен клон клеток, продуцирующий моноклональные антитела к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота. Этот клон клеток был последовательно размножен в 96-, 24-луночных панелях, а затем в культуральных матрасах.As a result, a clone of cells producing monoclonal antibodies to bovine IgG immunoglobulin was selected and propagated. This clone of cells was sequentially propagated in 96-, 24-well panels, and then in culture mattresses.
Культуральная жидкость была исследована на содержание специфических антител. Титр специфических антител в ИФА составлял 1:32-1:64. Препараты моноклональных антител получали трехкратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом. Была определена видовая принадлежность и специфичность моноклональных антител методом ИФА.The culture fluid was tested for specific antibodies. The titer of specific antibodies in ELISA was 1: 32-1: 64. Monoclonal antibody preparations were prepared by triply precipitating with a solution of ammonium sulfate at 50% saturation, followed by dialysis. The species affinity and specificity of monoclonal antibodies was determined by ELISA.
Предложенный штамм обладает следующими свойствами.The proposed strain has the following properties.
Морфологические признаки: Клетки однородные, округлой формы с крупным овальным ядром, содержащим от 1 до 3, чаще 1-2 ядрышек. При посеве клетки равномерно распределяются на поверхности субстрата и в культуральной жидкости. Индекс пролиферации равен 5-6.Morphological signs: Cells are homogeneous, round in shape with a large oval nucleus containing from 1 to 3, often 1-2 nucleoli. When inoculated, the cells are evenly distributed on the surface of the substrate and in the culture fluid. The proliferation index is 5-6.
Культуральные свойства. Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров. Клетки размножаются в суспензии и частично - прикрепляясь к поверхности культурального сосуда. Посевная концентрация 1×104 клеток/мл. Через 5-7 суток с момента посева 80% культуральной жидкости удаляют вместе с находящимися в ней клетками. К оставшимся клеткам добавляют такой же объем свежей питательной среды, рН 7,2-7,4. Периодичность субкультивирования - 1 раз в 3-5 суток. Кратность рассева 1:5.Cultural properties. Cells were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% serum of cow embryos. Cells multiply in suspension and partially by attaching to the surface of the culture vessel. Inoculum concentration of 1 × 10 4 cells / ml After 5-7 days from the time of seeding, 80% of the culture fluid is removed along with the cells in it. To the remaining cells add the same volume of fresh nutrient medium, pH 7.2-7.4. The frequency of subcultivation is 1 time in 3-5 days. Multiplicity of sieving 1: 5.
Культивирование в организме животных. Клетки вызывают образование асцитов у линейных мышей BALB/c, обработанных пристаном за 7-10 дней до внутрибрюшинного введения 2-10×106 клеток/мышь. Активность в ИФА асцитной жидкости составляет 1:640-1:5120.Cultivation in the body of animals. Cells induce ascites in linear BALB / c mice treated with piers 7-10 days prior to intraperitoneal administration of 2-10 × 10 6 cells / mouse. The activity in the ELISA of ascites fluid is 1: 640-1: 5120.
Иммунологические свойства. Штамм продуцирует моноклональные антитела к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота, не имеющие перекрестной реактивности с иммуноглобулинами овцы. Специфичность антител определяют методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG крупного рогатого скота и овцы. В планшет вносят культуральную жидкость и инкубируют 1,5 часа при 37°С, вносят конъюгат антител против иммуноглобулина IgG мыши с пероксидазой, инкубируют в том же режиме. После каждого этапа реакции проводят отмывание лунок от не связавшихся реагентов. Вносят субстратную смесь. После развития окрашивания в течение 10 мин измеряют оптическую плотность продуктов реакции. Значения оптической плотности в лунках, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG крупного рогатого скота и овцы, составляют соответственно более 1,5 и менее 0,05.Immunological properties. The strain produces monoclonal antibodies to cattle IgG immunoglobulin that do not cross-react with sheep immunoglobulins. The specificity of antibodies is determined by enzyme-linked immunosorbent assay in tablets sensitized with immunoglobulin IgG cattle and sheep. The culture fluid is added to the plate and incubated for 1.5 hours at 37 ° C, the conjugate of antibodies against mouse IgG immunoglobulin with peroxidase is added, incubated in the same mode. After each reaction step, the wells are washed from unbound reagents. Make a substrate mixture. After the development of staining for 10 min, the optical density of the reaction products is measured. The values of optical density in the wells sensitized by immunoglobulin IgG of cattle and sheep are respectively more than 1.5 and less than 0.05.
Определение активности культуральной или асцитической жидкостей проводят методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG крупного рогатого скота. Готовят двукратные серийные разведения исследуемого материала и проводят анализ аналогично исследованию на специфичность. В качестве контроля используют сыворотку крови интактных линейных мышей BALB/c в разведении 1:25. За титр принимают то наибольшее разведение исследуемого материала, для которого оптическая плотность в два или более раз превышает оптическую плотность в контроле. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:32-1:64, в асцитической жидкости - 1:640-1:5120.The determination of the activity of culture or ascitic fluids is carried out by enzyme-linked immunosorbent assay in tablets sensitized with immunoglobulin IgG cattle. Twice serial dilutions of the test material are prepared and the analysis is carried out similarly to the specificity study. As a control, the blood serum of intact BALB / c linear mice was diluted 1:25. The highest dilution of the test material for which the optical density is two or more times higher than the optical density in the control is taken as the titer. The antibody titer in the culture fluid is 1: 32-1: 64, in ascitic fluid - 1: 640-1: 5120.
Контаминация. Контаминация простейшими, грибами, бактериями, микоплазмами, вирусами не выявлена.Contamination. Contamination with protozoa, fungi, bacteria, mycoplasmas, viruses was not detected.
Хранение культур. Среда для замораживания: 70% среды RPMI-1640, 20% сыворотки эмбрионов коров, 10% диметилсульфоксида. Концентрация клеток в пластиковых криопробирках 1,5×106 клеток/мл среды. Режим замораживания: до -70°С - 1°/мин, далее - жидкий азот (-196°С). Восстановление после замораживания: быстрое размораживание при 37°С, центрифугирование при 1200 об/мин 10 мин, ресуспендирование в ростовой среде. Жизнеспособность после размораживания 70-80%.Storage of crops. Freezing medium: 70% RPMI-1640 medium, 20% serum of cow embryos, 10% dimethyl sulfoxide. The concentration of cells in plastic cryovials 1,5 × 10 6 cells / ml of medium. Freezing mode: up to -70 ° С - 1 ° / min, then liquid nitrogen (-196 ° С). Recovery after freezing: rapid thawing at 37 ° C, centrifugation at 1200 rpm for 10 minutes, resuspension in a growth medium. Viability after thawing 70-80%.
Штамм используют при изготовлении диагностической тест-системы для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.The strain is used in the manufacture of a diagnostic test system to detect antibodies to cattle leukemia virus by enzyme immunoassay.
Предложенный штамм гибридных клеток мыши Mus. musculus 5А10 - продуцент моноклональных антител мыши к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота депонирован и хранится в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) г.Москвы под №71.The proposed strain of hybrid mouse cells Mus. musculus 5A10 - producer of mouse monoclonal antibodies to immunoglobulin IgG cattle deposited and stored in the Specialized Collection of transplantable somatic cell cultures of agricultural and commercial animals (CXC RASH), Moscow, under No. 71.
Штамм гибридных клеток 5А10 является постоянной линией клеток с неограниченным сроком жизни, пригодным для биотехнологии при наработке препаратов.The strain of hybrid cells 5A10 is a constant line of cells with an unlimited lifespan suitable for biotechnology in the production of drugs.
Свойства штамма и продуцируемых им моноклональных антител отражены в конкретных примерах.The properties of the strain and the monoclonal antibodies produced by it are reflected in specific examples.
Пример 1. Иммунологические свойства моноклональных антител.Example 1. Immunological properties of monoclonal antibodies.
Специфичность антител определяют методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG крупного рогатого скота и овцы. В планшет вносят культуральную жидкость и инкубируют 1,5 часа при 37°С, вносят конъюгат антител против иммуноглобулина IgG мыши с пероксидазой, инкубируют в том же режиме и вносят субстратную смесь, содержащую перекись водорода и ТМБ. После развития окрашивания в течение 10 мин останавливают реакцию добавлением раствора серной кислоты и измеряют значения оптической плотности. Значения оптической плотности в лунках, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG крупного рогатого скота и овцы, составили соответственно 1,876 и 0,029. Отношение оптических плотностей, превышающее 64, свидетельствует о том, что моноклональные антитела реагируют с иммуноглобулинами крупного рогатого скота, но не реагируют с иммуноглобулинами овцы.The specificity of antibodies is determined by enzyme-linked immunosorbent assay in tablets sensitized with immunoglobulin IgG cattle and sheep. The culture fluid is added to the plate and incubated for 1.5 hours at 37 ° C, the conjugate of antibodies against mouse IgG immunoglobulin with peroxidase is added, incubated in the same mode and the substrate mixture containing hydrogen peroxide and TMB is added. After the development of staining for 10 min, stop the reaction by adding a solution of sulfuric acid and measure the optical density. The optical density values in the wells sensitized by cattle and sheep immunoglobulin IgG were 1.876 and 0.029, respectively. The ratio of optical densities in excess of 64 indicates that monoclonal antibodies react with cattle immunoglobulins, but do not react with sheep immunoglobulins.
Пример 2. Культивирование штамма in vitro и количественная оценка продукции антител. Клетки штамма 5А10 культивируют в стеклянных матрасах при температуре 37,0°С в питательной среде, состоящей из среды RPMI-1640 и 10% сыворотки крови эмбрионов крови антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 500000 ЕД/л). Оптимальная плотность посадки 2×104 клеток на мл среды. Через 3-5 суток после образования суспензии культуральную жидкость частично удаляют и добавляют необходимое количество свежей питательной среды. Титр антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота в культуральной жидкости в ИФА составил 1:64.Example 2. Cultivation of the strain in vitro and quantification of antibody production. Cells of strain 5A10 are cultured in glass mattresses at a temperature of 37.0 ° C in a nutrient medium consisting of RPMI-1640 medium and 10% blood serum of antibiotic blood embryos (penicillin and streptomycin at 500,000 U / L). The optimal planting density of 2 × 10 4 cells per ml of medium. 3-5 days after the formation of the suspension, the culture fluid is partially removed and the required amount of fresh nutrient medium is added. The titer of antibodies to immunoglobulin IgG cattle in the culture fluid in ELISA was 1:64.
Пример 3. Культивирование в организме животных и количественная оценка продукции антител. Клетки штамма в дозе 2-10×106 клеток/мышь в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера вводили в брюшную полость линейных мышей BALB/c, которым предварительно за 7 суток ввели 0,3 мл пристана. На 10-14 сутки получали асцитическую жидкость, титр специфических моноклональных антител к IgG крупного рогатого скота в которой составил в ИФА 1:2560.Example 3. Cultivation in animals and quantification of antibody production. The cells of the strain at a dose of 2-10 × 10 6 cells / mouse in 0.5 ml of phosphate-buffered saline were introduced into the abdominal cavity of linear BALB / c mice, which were previously injected with 0.3 ml of pristan in 7 days. On day 10-14, ascitic fluid was obtained, the titer of specific monoclonal antibodies to cattle IgG in which amounted to 1: 2560 in ELISA.
Пример 4. Получение конъюгата моноклональных антител с пероксидазой. Из асцитической жидкости получали препарат антител трехкратным осаждением раствором сульфата аммония 50% от насыщения с последующим диализом противExample 4. Obtaining a conjugate of monoclonal antibodies with peroxidase. An antibody preparation was obtained from the ascitic fluid by triple precipitation with a solution of ammonium sulfate 50% of saturation, followed by dialysis against
0,01 М натрий-карбонатного буфера, рН 9,5. Содержание антител в препарате составляло 10-12 мг/мл. Связывание антител с пероксидазой из корней хрена проводили методом, разработанным Wilson, Nakane после активации фермента перйодатом натрия [2]. Активность полученного конъюгата в иммуноферментном анализе для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота составила 1:15000.0.01 M sodium carbonate buffer, pH 9.5. The antibody content in the preparation was 10-12 mg / ml. Antibody binding to horseradish root peroxidase was performed by the method developed by Wilson, Nakane after activation of the enzyme with sodium periodate [2]. The activity of the obtained conjugate in an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to cattle leukemia virus was 1: 15000.
Пример 5. Проведение иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител. Препараты моноклональных антител, меченные пероксидазой, использовали в качестве детектирующих антител в иммуноферментном анализе для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотке крови крупного рогатого скота. Для иммобилизации антигена применяли трехстадийный метод фиксации. На первой стадии поверхность пластика микропанели для титрования сенсибилизировали за счет неспецифической адсорбции препаратом моноклональных антител к иммуноглобулинам овцы, продуцируемых штаммом 1Н8 (депонирован в СХЖ РАСХН по №73) из раствора с концентрацией 5 мкг/мл при рН 7,2-2-7,4. Инкубацию проводили в течение 16-20 часов при 4°С. На второй стадии проводили иммобилизацию за счет специфического иммунологического взаимодействия моноклональных антител к гликопротеидному антигену gp51 ВЛКРС из культуральной жидкости штамма 8С12 (депонирован в СЖЖ РАСХН под №72) в течение 1,5 часов при 37°С. На третьей стадии проводили иммобилизацию также за счет специфического иммунологического взаимодействия антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота из культуральной жидкости вируспродуцирующей культуры. Избыток реагентов после каждой стадии сенсибилизации твердой фазы и проведения иммуноферментного анализа отмывали раствором детергента на фосфатно-солевом буферном растворе. Вносили контрольные и анализируемые образцы сыворотки крови крупного рогатого скота и инкубировали в течение 1,5 часов при 37°С. В качестве детектирующих антител использовали меченные пероксидазой моноклональные антитела против глобулинов крупного рогатого скота, не дающие перекрестных реакций с иммуноглобулинами овцы, продуцируемые штаммом 5А10 (депонирован в СХЖ РАСХН под №71). Инкубацию проводили в течение 1,5 часов при температуре 37°С. Учет реакции проводили по изменению оптической плотности анализируемых образцов по сравнению с контрольными образцами после добавления субстратной смеси, содержащей тетраметилбензидин (ТМВ) и перекись водорода Н2О2. Положительными считали пробы, оптическая плотность которых в два и более раз превышала оптическую плотность отрицательного контроля.Example 5. Enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies. Monoclonal antibody preparations labeled with peroxidase were used as detecting antibodies in an enzyme-linked immunosorbent assay to detect antibodies to cattle leukemia virus in cattle serum. A three-stage fixation method was used to immobilize the antigen. At the first stage, the surface of the plastic micropanel for titration was sensitized due to nonspecific adsorption of monoclonal antibodies to sheep immunoglobulins produced by strain 1H8 (deposited in the Union of Agriculturalists of the Russian Academy of Agricultural Sciences No. 73) from a solution with a concentration of 5 μg / ml at pH 7.2-2-7, four. Incubation was carried out for 16-20 hours at 4 ° C. At the second stage, immobilization was carried out due to the specific immunological interaction of monoclonal antibodies to the glycoprotein antigen gp51 VLKRS from the culture fluid of strain 8C12 (deposited in the SCL RASHN under No. 72) for 1.5 hours at 37 ° C. In the third stage, immobilization was also carried out due to the specific immunological interaction of the cattle leukemia virus antigen from the culture fluid of the virus-producing culture. The excess reagents after each stage of sensitization of the solid phase and enzyme-linked immunosorbent assay were washed with a detergent solution in phosphate-buffered saline. Contributed and analyzed samples of blood serum of cattle and incubated for 1.5 hours at 37 ° C. Peroxidase-labeled monoclonal antibodies against bovine globulins that did not cross-react with sheep immunoglobulins produced by strain 5A10 (deposited in the Union of Russian Academy of Agricultural Sciences under No. 71) were used as detecting antibodies. Incubation was carried out for 1.5 hours at a temperature of 37 ° C. The reaction was taken into account by changing the optical density of the analyzed samples compared to the control samples after adding a substrate mixture containing tetramethylbenzidine (TMB) and hydrogen peroxide H 2 O 2 . Samples were considered positive, the optical density of which was two or more times higher than the optical density of the negative control.
При проведении исследования 662 сывороток крови крупного рогатого скота из неблагополучного по лейкозу хозяйства параллельно в реакции диффузионной преципитации (РДП) и иммуноферментном анализе. Совпадение результатов (РДП+/ИФА+; РДП-/ИФА-) отмечали в 560 или 84,6%, несовпадение (РДП+/ИФА-; РДП-/ИФА+) - в 15,4% случаев. Только 3 положительные по результатам РДП пробы прореагировали отрицательно в ИФА (0,5%). В ИФА было выявлено 190(28,7%) положительных проб, тогда как в РДП - только 94(14,2%), т.е. на 14,5% или в два раза больше.When conducting a study of 662 blood serum of cattle from a dysfunctional leukemia farm in parallel in a diffusion precipitation (RDP) reaction and enzyme-linked immunosorbent assay. The coincidence of results (RDP + / ELISA +; RDP- / ELISA-) was noted in 560 or 84.6%, mismatch (RDP + / ELISA-; RDP- / ELISA +) in 15.4% of cases. Only 3 positive samples according to the results of the RDP reacted negatively in ELISA (0.5%). In ELISA, 190 (28.7%) positive samples were detected, while in the RPD - only 94 (14.2%), i.e. 14.5% or twice as much.
По чувствительности метод иммуноферментного анализа превосходил РДП с гликопротеидным антигеном и не уступал ей по специфичности.In terms of sensitivity, the enzyme immunoassay method was superior to RDP with a glycoprotein antigen and was not inferior to it in specificity.
Предложенный штамм апробирован с положительным результатом в лабораторных условиях Всероссийского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко и Курской биофабрики с 2006 по 2007 гг.The proposed strain was tested with a positive result in laboratory conditions of the All-Russian Institute of Experimental Veterinary Medicine named after Ya.R. Kovalenko and the Kursk Biofactory from 2006 to 2007
Технико-экономическое обоснование. Получен штамм 5А10 гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота, характеризующийся следующими полезными свойствами:Feasibility study. The obtained strain 5A10 hybrid cells producing monoclonal antibodies to immunoglobulin IgG cattle, characterized by the following useful properties:
- является постоянной линией клеток с неограниченным сроком жизни, пригодным для биотехнологии при наработке препаратов;- is a constant line of cells with an unlimited lifespan, suitable for biotechnology in the production of drugs;
- обладает высоким уровнем продукции моноклональных антител. Титры антител в нативной культуральной жидкости составляли 1:32-1:64, в асцитической жидкости 1:640-1:5120 в иммуноферментном анализе;- has a high level of production of monoclonal antibodies. Antibody titers in native culture fluid were 1: 32-1: 64, in ascitic fluid 1: 640-1: 5120 in an enzyme-linked immunosorbent assay;
- моноклональные антитела специфичны к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота;- monoclonal antibodies specific for cattle IgG immunoglobulin;
- моноклональные антитела не реагируют с иммуноглобулинами- monoclonal antibodies do not react with immunoglobulins
овцы;sheeps;
- моноклональные антитела, меченные пероксидазой, обеспечивают высокую чувствительность и специфичность иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в биологическом материале, полученном от крупного рогатого скота.- monoclonal antibodies labeled with peroxidase provide high sensitivity and specificity of enzyme-linked immunosorbent assay to detect antibodies to the cattle leukemia virus in biological material obtained from cattle.
Штамм 5А10 - продуцент моноклональных антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота - найдет применение при изготовлении иммуноферментной тест-системы для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Использование этой тест-системы позволит повысить эффективность оздоровительных мероприятий, уменьшить сроки оздоровления неблагополучных по лейкозу животноводческих хозяйств и в итоге - резко снизить заболеваемость крупного рогатого скота лейкозом.Strain 5A10, a producer of monoclonal antibodies to cattle IgG immunoglobulin, will find application in the manufacture of an enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of cattle leukemia. Using this test system will improve the effectiveness of health measures, reduce the recovery time of livestock farms that are unsuccessful for leukemia, and ultimately dramatically reduce the incidence of cattle leukemia.
Источники информацииInformation sources
1. Ж.Сельхоз. Биология, 1993, №6-111-116.1. J. Selkhoz. Biology, 1993, No. 6-111-116.
2. Кн."Immunofluorescence and related staining techniques" под ред. W Knapp et al. - Elsevier: North-Holland Biomedical Press. - 1978. - 215-221.2. Prince "Immunofluorescence and related staining techniques", ed. W Knapp et al. - Elsevier: North-Holland Biomedical Press. - 1978. - 215-221.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008123099/13A RU2377299C1 (en) | 2008-06-10 | 2008-06-10 | STRAIN 5A10 OF PERMANENT HYBRIDOMAL LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO IgG OF CATTLE |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008123099/13A RU2377299C1 (en) | 2008-06-10 | 2008-06-10 | STRAIN 5A10 OF PERMANENT HYBRIDOMAL LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO IgG OF CATTLE |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2377299C1 true RU2377299C1 (en) | 2009-12-27 |
Family
ID=41642999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008123099/13A RU2377299C1 (en) | 2008-06-10 | 2008-06-10 | STRAIN 5A10 OF PERMANENT HYBRIDOMAL LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO IgG OF CATTLE |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2377299C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114805589A (en) * | 2022-06-14 | 2022-07-29 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | Monoclonal antibody capable of simultaneously recognizing antibodies of cattle, goats and sheep |
-
2008
- 2008-06-10 RU RU2008123099/13A patent/RU2377299C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Моноклональные антитела / Под ред. КЕННЕТА Р.Г. и др. М.: Медицина, 1983, стр.145-254. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114805589A (en) * | 2022-06-14 | 2022-07-29 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | Monoclonal antibody capable of simultaneously recognizing antibodies of cattle, goats and sheep |
| CN114805589B (en) * | 2022-06-14 | 2024-03-26 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | Monoclonal antibody capable of simultaneously recognizing cow, goat and sheep antibodies |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS63157977A (en) | Monoclonal antibody to human tumor necrosis factor | |
| CN113717949A (en) | Hybridoma cell strain capable of secreting ketoconazole monoclonal antibody and application thereof | |
| RU2395577C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING VP40 PROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC TEST SYSTEM FOR EXPOSING VP40 PROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) | |
| WO1986002364A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use | |
| RU2377299C1 (en) | STRAIN 5A10 OF PERMANENT HYBRIDOMAL LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO IgG OF CATTLE | |
| RU2395576C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus museums L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING NUCLEOPROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC TEST SYSTEM FOR EXPOSING NUCLEOPROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) | |
| CN112375744A (en) | Dihydropyridine monoclonal antibody hybridoma cell strain and application thereof | |
| CN108588030B (en) | Anti-human IgM monoclonal antibody, hybridoma cell strain and application thereof | |
| RU2377962C1 (en) | Method for diagnostics of cattle leucosis | |
| RU2377298C1 (en) | STRAIN 1H8 OF PERMANENT HYBRIDOMAL LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. Musculus - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO IgG OF SHEEP | |
| RU2401299C1 (en) | Animal mus musculus hybrid cell clone l-producer of monoclonal cholera toxin antibodies | |
| CN108531460B (en) | Anti-human IgM monoclonal antibody, hybridoma cell strain and application thereof | |
| RU2377297C1 (en) | STRAIN 8C12 OF PERMANENT INTER-SPECIES HYBRID LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus AND SHEEP Ovis aries - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO GLYCOPROTEIDAL ANTIGEN OF VIRUS OF CATTLE LEUCOSIS | |
| RU2535982C1 (en) | Strain of cultivated hybrid animal cells mus musculus l cchfv vd-1-producer of monoclonal antibody 4g4/b6 to virus of crimean-congo hemorrhagic fever (cchf) | |
| RU2549713C1 (en) | STRAIN AS25 OF CONSTANT HYBRIDOMA CELL LINE OF MOUSE Mus musculus-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO ANTIGEN H3 OF EQUINE INFLUENZA VIRUS | |
| RU2093573C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies raised to pig igm | |
| RU2093574C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibody raised to pig jgg | |
| RU2093572C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibody raised to l-chains of immunoglobulins | |
| WO1986002355A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use | |
| RU2395575C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING VP40 PROTEIN OF MARBURG VIRUS, (Popp STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC SYSTEM FOR EXPOSING VP40 MATRIX PROTEIN OF MARBURG VIRUS (Popp STRAIN) | |
| RU2401303C1 (en) | Animal mus musculus hybrid cell g10b6 clone l-producer of monoclonal diphtheria toxin antibodies | |
| WO1986002362A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use | |
| CN108642017A (en) | One plant can the anti-conotoxin of stably excreting cell strain of monoclonal antibody and application | |
| CN108531459B (en) | Anti-human IgM monoclonal antibody, hybridoma cell strain and application thereof | |
| SU1740415A1 (en) | Strain of hybrid cultured cells of animals mus musculus l as a producer of monoclonal antibodies to the pseudomonas pseudomalei antibodies, which do not react with malleus infection pathogenic organism of the nearest relationship |