RU2377298C1

RU2377298C1 - STRAIN 1H8 OF PERMANENT HYBRIDOMAL LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. Musculus - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO IgG OF SHEEP

Info

Publication number: RU2377298C1
Application number: RU2008123098/13A
Authority: RU
Inventors: Виктор Игоревич Юдин (RU); Виктор Игоревич Юдин; Владимир Егорович Козлов (RU); Владимир Егорович Козлов; Вячеслав Михайлович Безгин (RU); Вячеслав Михайлович Безгин; Михаил Иванович Гулюкин (RU); Михаил Иванович Гулюкин; Людмила Александровна Иванова (RU); Людмила Александровна Иванова
Priority date: 2008-06-10
Filing date: 2008-06-10
Publication date: 2009-12-27

Abstract

FIELD: veterinary.

SUBSTANCE: obtained is strain 1H8 of hybridomal line of cells of mouse Mus. musculus - producent of monoclonal antibodies to IgG of sheep, suitable for biotechnology in elaboration of diagnostic preparations. Strain is deposited with Special Collection of re-inoculated somatic cell cultures of agricultural and commerciall sold animals by No 73. When determined by method of immuno-enzymatic analysys (IEA) antibodies titers in native culture liquid constituted in IEA 1:32-1:64, in ascitic liquid 1:640-1:5120. Monoclonal antibodies are specific to immunoglobulin IgG of sheep and do not react with immunoglobulin of cattle. When used for fixation on solid phase of glycoproteidal antigen of cattle (C) leucosis virus (in composition of complex glycoproteidal antigen- monoclonal antibodies of sheep to glycoproteidal antigen) in IEA, they ensure strength of fixation and optimal availability of antigen for antibodies in testes samples.

EFFECT: strain 1H8 can be used in production of immuno-enzymatic test-system for diagnostics of C leucosis, which will allow to increase efficiency of sanitation measures, reduce terms of enhancement of adverse in terms of leucosis cattle-breeding farms.

1 tbl, 4 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, а именно к получению штаммов гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, которые могут быть использованы для приготовления высокоспецифических диагностических реагентов для выявления антител к различным инфекционным агентам, в частности вирусу лейкоза крупного рогатого скота.The present invention relates to the field of veterinary biotechnology, namely, to obtain strains of hybrid cells producing monoclonal antibodies that can be used to prepare highly specific diagnostic reagents for the detection of antibodies to various infectious agents, in particular cattle leukemia virus.

Вирус лейкоза крупного рогатого скота вызывает злокачественное лимфопролиферативное заболевание крупного рогатого скота - лейкоз, который занимает первое место в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота в Российской Федерации. Инфекционный процесс характеризуется отсутствием виремии с одновременной продукцией антител к белкам вируса, среди которых преобладают антитела к гликопротеиду вирусной оболочки (gp51). Для диагностики болезни широко применяются серологические методы исследования, а именно реакция диффузионной преципитации в геле агара и иммуноферментный анализ.The cattle leukemia virus causes a malignant lymphoproliferative disease in cattle - leukemia, which ranks first in the structure of cattle infectious pathology in the Russian Federation. The infectious process is characterized by the absence of viremia with the simultaneous production of antibodies to viral proteins, among which antibodies to the viral envelope glycoprotein (gp51) predominate. To diagnose the disease, serological research methods are widely used, namely the reaction of diffusion precipitation in agar gel and enzyme-linked immunosorbent assay.

Необходимость данной работы обусловлена тем, что наибольшей чувствительностью и специфичностью при выявлении антител к вирусу лейкоза обладают тест-системы, в основу которых положен принцип иммуноферментного анализа. Использование моноклональных антител для приготовления меченных пероксидазой видоспецифических антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота позволяет повысить специфичность анализа. В состав диагностических тест-систем входит антиген вируса лейкоза, который получают из культуральной жидкости перевиваемых культур клеток, в частности культуры клеток почки эмбриона овцы, хронически инфицированной вирусом лейкоза. Использование моноклональных антител для иммобилизации антигена на пластике планшета для титрования позволяет отказаться от трудоемкой и зачастую неэффективной очистки антигена и значительно повысить специфичность и чувствительность анализа. В разработанной нами тест-системе, предназначенной для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в биологических жидкостях крупного рогатого скота, для иммобилизации антигена применяются моноклональные антитела овцы Ovis aries к гликопротеидному антигену вируса лейкоза, продуцируемые межвидовой гибридной линией 8С12. Необходимость использования моноклональных антител к иммуноглобулинам IgG овцы в качестве антител, фиксирующих комплекс гликопротеидный антиген - моноклональные антитела к гликопротеидному антигену на твердой фазе, обусловлена тем, что культивирование межвидовой гибридной линии 8С12 возможно только in vitro, но не в организме животных. Однако содержание антител в культуральной жидкости гораздо ниже, чем в асцитической, и, кроме того, в состав питательной среды для культивирования постоянных культур клеток входит сыворотка крови (10-20%), которая загрязняет препарат моноклональных антител. Это обусловило необходимость использования для фиксации антигена моноклональных антител к иммуноглобулину IgG овцы, не обладающих перекрестной реактивностью с иммуноглобулинами крупного рогатого скота.The need for this work is due to the fact that test systems based on the principle of enzyme-linked immunosorbent assay have the greatest sensitivity and specificity in detecting antibodies to the leukemia virus. The use of monoclonal antibodies for the preparation of peroxidase-labeled species-specific antibodies to cattle IgG immunoglobulin can increase the specificity of the analysis. The diagnostic test systems include a leukemia virus antigen, which is obtained from the culture fluid of transplantable cell cultures, in particular, a kidney cell culture of a sheep embryo chronically infected with leukemia virus. The use of monoclonal antibodies to immobilize the antigen on the plastic of the titration tablet eliminates the time-consuming and often ineffective antigen purification and significantly increases the specificity and sensitivity of the analysis. In our test system designed to detect antibodies to cattle leukemia virus in cattle biological fluids, Ovis aries sheep monoclonal antibodies to the leukemia virus glycoprotein antigen produced by the interspecific hybrid 8C12 line are used to immobilize the antigen. The need to use monoclonal antibodies to sheep IgG immunoglobulins as antibodies that fix the glycoprotein antigen - monoclonal antibodies to the glycoprotein antigen on the solid phase is due to the fact that cultivation of the interspecific hybrid line 8C12 is possible only in vitro, but not in animals. However, the antibody content in the culture fluid is much lower than in the ascitic one, and, in addition, the serum (10-20%), which contaminates the monoclonal antibody preparation, is included in the nutrient medium for culturing constant cell cultures. This necessitated the use of sheep monoclonal antibodies to immunoglobulin IgG for antigen fixation, which do not have cross-reactivity with cattle immunoglobulins.

В доступной нам литературе сведения о штаммах гибридомных культур клеток, продуцирующих моноклональные антитела к иммуноглобулину IgG овцы, не найдены.In the literature available to us, information about strains of hybridoma cell cultures producing monoclonal antibodies to sheep IgG immunoglobulin was not found.

В задачу наших исследований входило получить штамм гибридных клеток, обладающих in vitro высокой продукцией моноклональных антител к иммуноглобулину IgG овцы, не дающих перекрестных реакций с иммуноглобулинами крупного рогатого скота.The objective of our research was to obtain a strain of hybrid cells with in vitro high production of monoclonal antibodies to sheep IgG immunoglobulin, which do not cross-react with cattle immunoglobulins.

Способ получения предложенного штамма состоит в следующем.A method of obtaining the proposed strain is as follows.

Штамм гибридных клеток получен путем слияния клеток перевиваемой культуры миеломы мыши P3-X63-Ag-8.653 с лимфоцитами селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной двукратно введением 100 мкг препарата иммуноглобулина IgG овцы, очищенного хроматографическими методами.The hybrid cell strain was obtained by merging cells of a transplanted mouse myeloma culture P3-X63-Ag-8.653 with BALB / c mouse spleen lymphocytes immunized twice with 100 μg of sheep immunoglobulin IgG purified by chromatographic methods.

На высоте иммунного ответа (через 3 дня после последней инъекции) провели слияние спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии P3-X63-Ag-8.653.At the height of the immune response (3 days after the last injection), splenocytes of immunized mice were fused with mouse P3-X63-Ag-8.653 mouse myeloma cells.

Слияние клеток проводили по стандартной методике с использованием ПЭГ с м.м. 1500. Соотношение клеток миеломы и лимфоцитов составляло 1:4-1:10. Селекцию гибридом проводили на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Гибридомы культивировали на 96-луночных панелях производства фирмы «Nunc» на среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров в атмосфере, содержащей 5% СО₂.Cell fusion was carried out according to standard methods using PEG with m.m. 1500. The ratio of myeloma cells and lymphocytes was 1: 4-1: 10. Hybridomas were selected on a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine. Hybridomas were cultured on 96-well panels manufactured by Nunc in RPMI-1640 medium supplemented with 10% serum of cow embryos in an atmosphere containing 5% CO ₂ .

Скрининг гибридом на продукцию специфических моноклональных антител проводили методом твердофазного ИФА с использованием препаратов очищенных IgG овцы и крупного рогатого скота для сенсибилизации твердой фазы и конъюгата поликлональных антител к иммуноглобулину IgG мыши с пероксидазой для выявления связавшихся антител. Клонирование и реклонирование клеточных культур проводили на 96-луночных панелях методом предельных разведений с использованием макрофагального фидерного слоя.Hybridomas were screened for the production of specific monoclonal antibodies by solid-phase ELISA using preparations of purified sheep and cattle IgG to sensitize the solid phase and conjugate of polyclonal antibodies to mouse IgG immunoglobulin with peroxidase to detect bound antibodies. Cloning and re-cloning of cell cultures was performed on 96-well panels by the method of limiting dilutions using a macrophage feeder layer.

В результате был отобран и размножен клон клеток 1Н8, продуцирующий моноклональные антитела к иммуноглобулину IgG овцы, не дающий перекрестных реакций с иммуноглобулинами крупного рогатого скота. Этот клон клеток был последовательно размножен в 96-, 24-луночных панелях, а затем в культуральных матрасах.As a result, a 1H8 cell clone was selected and propagated that produced monoclonal antibodies to sheep IgG immunoglobulin, which did not cross-react with cattle immunoglobulins. This clone of cells was sequentially propagated in 96-, 24-well panels, and then in culture mattresses.

Культуральная жидкость была исследована на содержание специфических антител. Титр специфических антител в ИФА составлял 1:32-1:64. Препараты моноклональных антител получали двукратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом. Была определена видовая принадлежность и специфичность моноклональных антител методами ИФА.The culture fluid was tested for specific antibodies. The titer of specific antibodies in ELISA was 1: 32-1: 64. Monoclonal antibody preparations were prepared by double precipitation with a solution of ammonium sulfate at 50% saturation followed by dialysis. The species and specificity of monoclonal antibodies were determined by ELISA.

Предложенный штамм обладает следующими свойствами.The proposed strain has the following properties.

Морфологические признаки. Клетки однородные, округлой формы с крупным овальным ядром, содержащим от 1 до 3, чаще 1-2, ядрышек. При посеве клетки равномерно распределяются на поверхности субстрата и в культуральной жидкости. Индекс пролиферации равен 5-6.Morphological signs. The cells are homogeneous, rounded in shape with a large oval nucleus containing from 1 to 3, usually 1-2, nucleoli. When inoculated, the cells are evenly distributed on the surface of the substrate and in the culture fluid. The proliferation index is 5-6.

Культуральные свойства. Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров. Клетки размножаются в суспензии и частично - прикрепляясь к поверхности культурального сосуда. Посевная концентрация 1×10⁴ клеток/мл. Через 5-7 суток с момента посева 80% культуральной жидкости удаляют вместе с находящимися в ней клетками. К оставшимся клеткам добавляют такой же объем свежей питательной среды. рН среды 7,2-7,4. Периодичность субкультивирования - 1 раз в 3-5 суток. Кратность рассева 1:5.Cultural properties. Cells were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% serum of cow embryos. Cells multiply in suspension and partially by attaching to the surface of the culture vessel. Inoculum concentration of 1 × 10 ⁴ cells / ml After 5-7 days from the time of seeding, 80% of the culture fluid is removed along with the cells in it. To the remaining cells add the same amount of fresh nutrient medium. The pH of the medium is 7.2-7.4. The frequency of subcultivation is 1 time in 3-5 days. Multiplicity of sieving 1: 5.

Культивирование в организме животных. Клетки вызывают образование асцитов у линейных мышей BALB/c, обработанных пристаном за 7-10 дней до внутрибрюшинного введения 2-10×10⁶ клеток/мышь. Активность в ИФА асцитной жидкости - 1:640-1:5120.Cultivation in the body of animals. Cells induce ascites in linear BALB / c mice treated with piers 7-10 days prior to intraperitoneal administration of 2-10 × 10 ⁶ cells / mouse. The activity in the ELISA of ascites fluid is 1: 640-1: 5120.

Иммунологические свойства. Штамм продуцирует моноклональные антитела мыши против иммуноглобулина IgG овцы, не имеющие перекрестной реактивности с иммуноглобулинами крупного рогатого скота. Специфичность антител определяют методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG овцы и крупного рогатого скота. В планшет вносят культуральную жидкость и инкубируют 1,5 часа при 37°С, вносят конъюгат антител против иммуноглобулина IgG мыши с пероксидазой, инкубируют в том же режиме. После каждого этапа проводят отмывание лунок от несвязавшихся реагентов. Вносят субстратную смесь. Интенсивность окрашивания оценивают через 5-10 мин. Значения оптической плотности в лунках, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG овцы и крупного рогатого скота, составляют соответственно более 1,5 и менее 0,05.Immunological properties. The strain produces monoclonal antibodies of the mouse against sheep IgG immunoglobulin that do not cross-react with cattle immunoglobulins. The specificity of antibodies is determined by enzyme-linked immunosorbent assay in plates sensitized with sheep and cattle IgG immunoglobulin. The culture fluid is added to the plate and incubated for 1.5 hours at 37 ° C, the conjugate of antibodies against mouse IgG immunoglobulin with peroxidase is added, incubated in the same mode. After each step, the wells are washed from unbound reagents. Make a substrate mixture. Staining intensity is evaluated after 5-10 minutes. The optical density values in the wells sensitized by sheep and cattle immunoglobulin IgG are more than 1.5 and less than 0.05, respectively.

Определение активности культуральной, асцитической жидкостей проводят методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG овцы. Готовят двукратные серийные разведения исследуемого материала и проводят анализ аналогично исследованию на специфичность. В качестве контроля используют сыворотку крови интактных линейных мышей BALB/c в разведении 1:25. За титр принимают то наибольшее разведение исследуемого материала, для которого оптическая плотность в два или более раз превышает оптическую плотность в контроле.Determination of the activity of culture, ascitic fluids is carried out by enzyme-linked immunosorbent assay in tablets sensitized with sheep immunoglobulin IgG. Twice serial dilutions of the test material are prepared and the analysis is carried out similarly to the specificity study. As a control, the blood serum of intact BALB / c linear mice was diluted 1:25. The highest dilution of the test material for which the optical density is two or more times higher than the optical density in the control is taken as the titer.

Контаминация. Контаминация простейшими, грибами, бактериями, микоплазмами, вирусами не выявлена.Contamination. Contamination with protozoa, fungi, bacteria, mycoplasmas, viruses was not detected.

Хранение культур. Среда для замораживания: 70% среды RPMI-1640, 20% сыворотки эмбрионов коров, 10% диметилсульфоксида. Концентрация клеток в пластиковых криопробирках 1,5×10⁶ клеток/мл. Режим замораживания: до -70°С, 1°/мин, далее жидкий азот (-196°С). Восстановление после замораживания: быстрое размораживание при 37°С, центрифугирование при 1200 об/мин 10 мин, ресуспендирование в ростовой среде. Жизнеспособность после размораживания 70-80%.Storage of crops. Freezing medium: 70% RPMI-1640 medium, 20% serum of cow embryos, 10% dimethyl sulfoxide. The cell concentration in plastic cryovials is 1.5 × 10 ⁶ cells / ml. Freezing mode: up to -70 ° С, 1 ° / min, then liquid nitrogen (-196 ° С). Recovery after freezing: rapid thawing at 37 ° C, centrifugation at 1200 rpm for 10 minutes, resuspension in a growth medium. Viability after thawing 70-80%.

Штамм используют при изготовлении диагностической тест-системы для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.The strain is used in the manufacture of a diagnostic test system to detect antibodies to cattle leukemia virus by enzyme immunoassay.

Преимущества: антитела к иммуноглобулину IgG овцы, не дающие перекрестных реакций с иммуноглобулинами крупного рогатого скота.Advantages: antibodies to sheep IgG immunoglobulin, which do not cross-react with cattle immunoglobulins.

Предложенный штамм 1Н8 гибридной линии клеток мыши Mus. musculus - продуцент моноклональных антител мыши к иммуноглобулину IgG овцы - депонирован в «Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных» (СХЖ РАСХН) под №73.The proposed strain 1H8 hybrid mouse cell line Mus. musculus, a producer of mouse monoclonal antibodies to sheep IgG immunoglobulin, was deposited in the Specialized Collection of Inoculated Somatic Cell Cultures of Agricultural and Commercial Animals (CJS RAAS) under No. 73.

Штамм гибридных клеток 1Н8 является постоянной линией клеток, пригодной для биотехнологии при наработке диагностических препаратов.The strain of hybrid cells 1H8 is a constant line of cells suitable for biotechnology in the production of diagnostic drugs.

Пример 1. Иммунологические свойства моноклональных антител. Специфичность антител в культуральной жидкости определяют методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG овцы и крупного рогатого скота по приведенному выше методу. Значения оптической плотности в лунках, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG овцы и крупного рогатого скота, составляли соответственно 1,750 и 0,032. Отношение значений оптической плотности, превышающее 54, свидетельствует о том, что моноклональные антитела реагируют с иммуноглобулинами овцы, но не реагируют с иммуноглобулинами крупного рогатого скота.Example 1. Immunological properties of monoclonal antibodies. The specificity of antibodies in the culture fluid is determined by enzyme-linked immunosorbent assay in plates sensitized with sheep IgG and cattle immunoglobulin according to the above method. The optical density values in the wells sensitized with sheep and cattle immunoglobulin IgG were 1.750 and 0.032, respectively. The ratio of optical density values in excess of 54 indicates that monoclonal antibodies react with sheep immunoglobulins, but do not react with cattle immunoglobulins.

Пример 2. Культивирование штамма in vitro и количественная оценка продукции антител. Клетки штамма 1Н8 культивируют в стеклянных матрасах при температуре 37,0°С в питательной среде, состоящей из среды RPMI-1640 и 10% сыворотки крови эмбрионов крови антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 500000 ед./л). Оптимальная плотность посадки 2×10⁴ клеток/мл среды. Через 2-3 суток после образования суспензии культуральную жидкость частично удаляют и добавляют необходимое количество свежей питательной среды. Титр антител к иммуноглобулину IgG овцы в культуральной жидкости составил в ИФА 1:64.Example 2. Cultivation of the strain in vitro and quantification of antibody production. Cells of strain 1H8 are cultured in glass mattresses at a temperature of 37.0 ° C in a nutrient medium consisting of RPMI-1640 medium and 10% blood serum of antibiotic blood embryos (penicillin and streptomycin, 500,000 units / l). The optimal planting density of 2 × 10 ⁴ cells / ml of medium. 2-3 days after the formation of the suspension, the culture fluid is partially removed and the required amount of fresh nutrient medium is added. The antibody titer to sheep IgG immunoglobulin in the culture fluid was in ELISA 1:64.

Пример 3. Культивирование в организме животных и количественная оценка продукции антител. Клетки штамма в дозе 2-10×10⁶ клеток/мышь в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера вводили в брюшную полость линейных мышей BALB/c, которым предварительно за 7 суток ввели 0,3 мл пристана. На 10-14 сутки получали асцитическую жидкость, титр специфических моноклональных антител к IgG овцы в которой составил в ИФА 1:2560.Example 3. Cultivation in animals and quantification of antibody production. The cells of the strain at a dose of 2-10 × 10 ⁶ cells / mouse in 0.5 ml of phosphate-buffered saline were introduced into the abdominal cavity of linear BALB / c mice, which were previously injected with 0.3 ml of pristan in 7 days. On day 10-14, ascitic fluid was obtained, the titer of specific monoclonal antibodies to sheep IgG in which amounted to 1: 2560 in ELISA.

Пример 4. Проведение иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител. Препараты моноклональных антител получали из асцитической жидкости трехкратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом. Далее их использовали в качестве антител, фиксирующих моноклональные антитела овцы к гликопротеидному антигену gp51 ВЛКРС 8С12, в иммуноферментном анализе для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в биологических жидкостях крупного рогатого скота. Иммобилизацию антигена на микропанелях проводили в три этапа.Example 4. Enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies. Monoclonal antibody preparations were obtained from ascitic fluid by threefold precipitation with a solution of ammonium sulfate 50% saturation, followed by dialysis. Further, they were used as antibodies, fixing sheep monoclonal antibodies to the glycoprotein antigen gp51 VLKRS 8C12, in an enzyme-linked immunosorbent assay to detect antibodies to cattle leukemia virus in biological fluids of cattle. Antigen immobilization on micropanels was carried out in three stages.

На первом этапе поверхность пластика панели для микротитрования сенсибилизировали за счет неспецифической адсорбции препаратом моноклональных антител к иммуноглобулинам овцы, продуцируемых штаммом 1Н8 (депонирован в СХЖ РАСХН под №73) из раствора с концентрацией 5 мкг/мл при рН 7,2-2-7,4. Инкубацию проводили в течение 16-20 часов при 4°С. На втором этапе проводили иммобилизацию за счет специфического иммунологического взаимодействия моноклональных антител к гликопротеидному антигену gp51 ВЛКРС из культуральной жидкости штамма 8С12 (депонирован в СХЖ РАСХН под №72) в течение 1,5 часов при 37°С. На третьем этапе проводили иммобилизацию также за счет специфического иммунологического взаимодействия антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота из культуральной жидкости вируспродуцирующей культуры. Избыток реагентов после каждой стадии сенсибилизации твердой фазы и проведения иммуноферментного анализа отмывали раствором детергента на фосфатно-солевом буферном растворе. Вносили контрольные и анализируемые образцы сыворотки крови крупного рогатого скота и инкубировали в течение 1,5 часов при 37°С. В качестве детектирующих антител использовали меченные пероксидазой моноклональные антитела против глобулинов крупного рогатого скота, не дающие перекрестных реакций с иммуноглобулинами овцы, продуцируемые штаммом 5А10 (депонирован в СХЖ РАСХН под №71). Инкубацию проводили в течение 1,5 часов при температуре 37°С. Учет реакции проводили по изменению оптической плотности анализируемых образцов по сравнению с контрольными образцами после добавления субстратной смеси, содержащей тетраметилбензидин (ТМВ) и перекись водорода Н₂О₂. Положительными считали пробы, оптическая плотность которых в два и более раз превышала оптическую плотность отрицательного контроля.At the first stage, the plastic surface of the microtiter panel was sensitized due to nonspecific adsorption of monoclonal antibodies to sheep immunoglobulins produced by strain 1H8 (deposited in the Union of Agricultural Sciences under No. 73) from a solution with a concentration of 5 μg / ml at pH 7.2-2-7, four. Incubation was carried out for 16-20 hours at 4 ° C. At the second stage, immobilization was carried out due to the specific immunological interaction of monoclonal antibodies to the glycoprotein antigen gp51 VLSC from the culture fluid of strain 8C12 (deposited in the Union of Agriculturalists of the Russian Academy of Agricultural Sciences under No. 72) for 1.5 hours at 37 ° C. At the third stage, immobilization was also carried out due to the specific immunological interaction of the antigen of the cattle leukemia virus from the culture fluid of the virus-producing culture. The excess reagents after each stage of sensitization of the solid phase and enzyme-linked immunosorbent assay were washed with a detergent solution in phosphate-buffered saline. Contributed and analyzed samples of blood serum of cattle and incubated for 1.5 hours at 37 ° C. Peroxidase-labeled monoclonal antibodies against bovine globulins that did not cross-react with sheep immunoglobulins produced by strain 5A10 (deposited in the Union of Agricultural Sciences under No. 71) were used as detecting antibodies. Incubation was carried out for 1.5 hours at a temperature of 37 ° C. The reaction was taken into account by changing the optical density of the analyzed samples as compared with the control samples after adding a substrate mixture containing tetramethylbenzidine (TMB) and hydrogen peroxide H ₂ O ₂ . Samples were considered positive, the optical density of which was two or more times higher than the optical density of the negative control.

При проведении исследования 662 сывороток крови из неблагополучного по лейкозу хозяйства параллельно в реакции диффузионной преципитации (РДП) и иммуноферментном анализе совпадение результатов (РДП+/ИФА+; РДП-/ИФА-) отмечали в 560, или 84,6%, несовпадение (РДП+/ИФА-; РДП-/ИФА+) - в 15,4% случаев. Только 3 положительные по результатам РДП пробы прореагировали отрицательно в ИФА (0,5%). В ИФА было выявлено 190 (28,7%) положительных проб, тогда как в РДП - только 94 (14,2%), т.е. на 14,5%, или в два раза, больше. По чувствительности метод иммуноферментного анализа превосходил РДП с гликопротеидным антигеном и не уступал ей по специфичности.When conducting a study of 662 blood sera from a leukemic dysfunctional economy in parallel in a diffusion precipitation (RDP) reaction and enzyme-linked immunosorbent assay, a coincidence of results (RDP + / ELISA +; RDP- / ELISA) was noted in 560, or 84.6%, mismatch (RDP + / IFA-; RDP- / IFA +) - in 15.4% of cases. Only 3 positive samples according to the results of the RDP reacted negatively in ELISA (0.5%). In ELISA, 190 (28.7%) positive samples were detected, while in the RPD - only 94 (14.2%), i.e. by 14.5%, or twice as much. In terms of sensitivity, the enzyme immunoassay method was superior to RDP with a glycoprotein antigen and was not inferior to it in specificity.

Предложенный штамм апробирован с положительным результатом в лабораторных условиях ГНУ Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко и Курской биофабрики с 2006 по 2007 гг.The proposed strain was tested with a positive result in laboratory conditions of the GNU All-Russian Institute of Experimental Veterinary Medicine named after Ya.R. Kovalenko and the Kursk Biofactory from 2006 to 2007

Технико-экономическое обоснование. Полученный штамм 1Н8 гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к иммуноглобулину IgG овцы, характеризуется следующими полезными свойствами:Feasibility study. The resulting 1H8 strain of hybrid cells producing monoclonal antibodies to sheep IgG immunoglobulin is characterized by the following useful properties:

- является постоянной линией клеток, пригодной для биотехнологии при наработке диагностических препаратов;- is a constant line of cells suitable for biotechnology in the production of diagnostic drugs;

- обладает высоким уровнем продукции моноклональных антител. При определении методом иммуноферментного анализа титры антител в нативной культуральной жидкости составляли в ИФА 1:32-1:64, в асцитической жидкости 1:640-1:512;- has a high level of production of monoclonal antibodies. When determined by enzyme-linked immunosorbent assay, antibody titers in native culture fluid were in ELISA 1: 32-1: 64, in ascitic fluid 1: 640-1: 512;

- монокональные антитела специфичны к иммуноглобулину IgG овцы;- monoconal antibodies specific for sheep IgG immunoglobulin;

- моноклональные антитела не реагируют с иммуноглобулинами крупного рогатого скота;- monoclonal antibodies do not react with cattle immunoglobulins;

- моноклональные антитела при использовании их для фиксации на твердой фазе гликопротеидного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота (в составе комплекса гликопротеидный антиген - моноклональные антитела овцы к гликопротеидному антигену) в иммуноферментном анализе обеспечивают прочность фиксации и оптимальную доступность антигена для антител в испытуемых пробах.- monoclonal antibodies when used for fixation on the solid phase of the glycoprotein antigen of the cattle leukemia virus (as part of the glycoprotein antigen – monoclonal sheep antibody to glycoprotein antigen complex) in an enzyme-linked immunosorbent assay ensure fixation strength and optimal accessibility of the antigen for antibodies in the test subjects.

Штамм 1Н8 - продуцент моноклональных антител к IgG овцы - найдет применение при изготовлении иммуноферментной тест-системы для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Использование этой тест-системы позволит повысить эффективность оздоровительных мероприятий, уменьшить сроки оздоровления неблагополучных по лейкозу животноводческих хозяйств и в итоге резко снизить заболеваемость крупного рогатого скота лейкозом.Strain 1H8, a producer of monoclonal antibodies to sheep IgG, will find application in the manufacture of an enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of cattle leukemia. The use of this test system will increase the effectiveness of recreational activities, reduce the recovery time of livestock farms that are unsuccessful for leukemia, and ultimately dramatically reduce the incidence of cattle leukemia.

Источники информацииInformation sources

"Immunofluorescence and related staining techniques" под ред. W. Knapp. - Elsevier: North-Holland Biomedical Press. - 1978. - 215-221."Immunofluorescence and related staining techniques", ed. W. Knapp. - Elsevier: North-Holland Biomedical Press. - 1978. - 215-221.

Claims

Strain 1H8 of the constant hybridoma mouse cell line Mus. Musculus - a producer of monoclonal antibodies to sheep IgG, deposited in the "Specialized Collection of transplantable somatic cell cultures of agricultural and commercial animals (SCC RAAS)", Moscow under No. 73.