RU2377297C1 - STRAIN 8C12 OF PERMANENT INTER-SPECIES HYBRID LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus AND SHEEP Ovis aries - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO GLYCOPROTEIDAL ANTIGEN OF VIRUS OF CATTLE LEUCOSIS - Google Patents
STRAIN 8C12 OF PERMANENT INTER-SPECIES HYBRID LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus AND SHEEP Ovis aries - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO GLYCOPROTEIDAL ANTIGEN OF VIRUS OF CATTLE LEUCOSIS Download PDFInfo
- Publication number
- RU2377297C1 RU2377297C1 RU2008123101/13A RU2008123101A RU2377297C1 RU 2377297 C1 RU2377297 C1 RU 2377297C1 RU 2008123101/13 A RU2008123101/13 A RU 2008123101/13A RU 2008123101 A RU2008123101 A RU 2008123101A RU 2377297 C1 RU2377297 C1 RU 2377297C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- monoclonal antibodies
- leucosis
- antigen
- cattle
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, а именно к получению клеточных гибридов, используемых при иммунохимических исследованиях.The invention relates to the field of veterinary biotechnology, and in particular to the production of cell hybrids used in immunochemical studies.
Методы гибридизации соматических клеток в настоящее время широко применяются для решения многих проблем биологии, медицины, ветеринарии. Гибридные линии клеток животных используют для решения проблем вирусологии, патологии сельскохозяйственных животных, получения биологически активных веществ и моноклональных антител, которые могут использоваться для приготовления высокоспецифических диагностических реагентов с целью выявления вирусов или антител к ним в биологических жидкостях.Somatic cell hybridization methods are currently widely used to solve many problems of biology, medicine, and veterinary medicine. Hybrid animal cell lines are used to solve the problems of virology, pathology of farm animals, and the production of biologically active substances and monoclonal antibodies, which can be used to prepare highly specific diagnostic reagents in order to detect viruses or antibodies to them in biological fluids.
Вирус лейкоза крупного рогатого скота вызывает злокачественное лимфопролиферативное заболевание крупного рогатого скота - лейкоз, который занимает первое место в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота в Российской Федерации. Инфекционный процесс характеризуется отсутствием виремии с одновременной продукцией антител к белкам вируса, среди которых преобладают антитела к гликопротеиду вирусной оболочки (gp51).The cattle leukemia virus causes a malignant lymphoproliferative disease in cattle - leukemia, which ranks first in the structure of cattle infectious pathology in the Russian Federation. The infectious process is characterized by the absence of viremia with the simultaneous production of antibodies to viral proteins, among which antibodies to the viral envelope glycoprotein (gp51) predominate.
Для диагностики болезни широко применяются серологические методы исследования, а именно - реакция диффузионной преципитации в геле агара (РДП) и иммуноферментный анализ (ИФА). Чувствительность серологических методов высока в тех случаях, когда они направлены на выявление антител к гликопротеиду gp51.Serological research methods are widely used to diagnose the disease, namely, the reaction of diffusion precipitation in agar gel (RDP) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The sensitivity of serological methods is high in those cases when they are aimed at identifying antibodies to the gp51 glycoprotein.
Необходимость данной работы обусловлена тем, что наибольшей чувствительностью и специфичностью при выявлении антител к вирусу лейкоза обладают тест-системы на основе принципа иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител для осуществления фиксации антигена на стадии сенсибилизации твердофазной основы. Такие тест-системы значительно превосходят по чувствительности и специфичности традиционные, в которых сенсибилизация твердой фазы осуществляется при непосредственной адсорбции очищенного вируса лейкоза крупного рогатого скота.The need for this work is due to the fact that test systems based on the principle of enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies to carry out antigen fixation at the sensitization stage of the solid-phase base have the greatest sensitivity and specificity in detecting antibodies to leukemia virus. Such test systems are significantly superior in sensitivity and specificity to the traditional ones, in which sensitization of the solid phase is carried out with the direct adsorption of purified cattle leukemia virus.
Известны штаммы гибридомной культуры клеток, продуцирующей антитела к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота. Штаммы клеток, продуцирующих моноклональные антитела к gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, получали в результате слияния лимфоцитов мышей, иммунизированных поверхностным антигеном вируса лейкоза крупного рогатого скота gp51 с клетками мышиной миеломы. После селекции и клонирования полученных гибридов клетки вводили внутриперитонеально мышам. Асцитическую жидкость использовали как источник моноклональных антител к gp51 вируса лейкоза (1).Known strains of hybridoma cell culture producing antibodies to the glycoprotein antigen of bovine leukemia virus. Strains of cells producing monoclonal antibodies to gp51 in bovine leukemia virus were obtained by fusion of lymphocytes from mice immunized with the surface antigen of bovine leukemia virus gp51 with mouse myeloma cells. After selection and cloning of the obtained hybrids, the cells were injected intraperitoneally to mice. Ascitic fluid was used as a source of monoclonal antibodies to gp51 leukemia virus (1).
Иммунизация мышей вирусом лейкоза крупного рогатого скота недостаточно эффективна, так как мышь не относится к чувствительным к этому вирусу видам животных и отвечает на иммунизацию недостаточно интенсивным образованием клеток, продуцирующих антитела; кроме того, содержание гликопротеидного антигена в препаратах очищенных вирионов очень низкое. Иммунизации мышей очищенным гликопротеидным антигеном более эффективна, однако сама процедура очистки довольно трудоемкая при низком выходе продукта. В свою очередь, сами моноклональные антитела должны обладать рядом свойств, определяющих возможность их использования в диагностической тест-системе твердофазного иммуноферментного анализа. Моноклональные антитела, которые могут быть пользованы для фиксации антигена на твердофазном носителе, должны прочно связывать антиген и обеспечивать доступность его эпитопов для анализируемых антител.Immunization of mice with cattle leukemia virus is not effective enough, since the mouse is not an animal species sensitive to this virus and responds to immunization with insufficiently intense formation of antibody-producing cells; in addition, the glycoprotein antigen content of purified virion preparations is very low. Immunization of mice with purified glycoprotein antigen is more effective, however, the cleaning procedure itself is quite time-consuming with a low product yield. In turn, monoclonal antibodies themselves should have a number of properties that determine the possibility of their use in the diagnostic test system of enzyme-linked immunosorbent assay. Monoclonal antibodies, which can be used to fix the antigen on a solid-phase carrier, must firmly bind the antigen and ensure the availability of its epitopes for the antibodies being analyzed.
Известен штамм межвидовой гибридомной культуры клеток, продуцирующей антитела к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота ВМАb/сс-1, полученный при слиянии лимфоцитов периферической крови теленка голштинской породы, гипериммунизированного инактивированным антигеном ВЛКРС с клетками мышиной миеломы SP2/0-Agl4. Штамм обладает высокой продукцией моноклональных антител крупного рогатого скота подкласса IgG1, специфичных к гликопротеидному антигену ВЛКРС в ИФА. При изучении в вестерн-блот-анализе моноклональные антитела выявлена иммунореактивность моноклональных антител против вирусного антигена, который представляет собой гликопротеид с мол. массой 69 Кд. Асцитные антитела, полученные в результате интраперитонеальной инокуляции 1×107 клеток гибридомы мышам BALB/c-nu/nu, в четырехкратном разведении, оказывали 50% ингибирующее действие на ранний поликариоцитоз (2).A known strain of interspecific hybridoma cell culture producing antibodies to the glycoprotein antigen of bovine leukemia virus BMAb / cc-1 obtained by the fusion of peripheral blood lymphocytes of Holstein calf hyperimmunized with inactivated VLKRS antigen with murine SP2 / 0 murine myeloma cells. The strain has a high production of cattle monoclonal antibodies of subclass IgG 1 , specific for ELV glycoprotein antigen in ELISA. When studying in a Western blot analysis of monoclonal antibodies, the immunoreactivity of monoclonal antibodies against a viral antigen, which is a glycoprotein with mol. weighing 69 cd. Ascitic antibodies obtained as a result of intraperitoneal inoculation of 1 × 10 7 hybridoma cells in BALB / c-nu / nu mice, in four dilutions, had a 50% inhibitory effect on early polykaryocytosis (2).
В задачу наших исследований входило получить штамм гибридных клеток, обладающих in vitro высокой продукцией моноклональных антител к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота, обладающих высокой авидностью и аффинностью и обеспечивающих оптимальную пространственную ориентацию антигена, фиксированного с помощью этих антител на твердофазном носителе, при использовании в диагностической тест-системе.The objective of our research was to obtain a strain of hybrid cells having in vitro high production of monoclonal antibodies to the glycoprotein antigen of the cattle leukemia virus, having high avidity and affinity and providing optimal spatial orientation of the antigen fixed using these antibodies on a solid phase carrier, when used in diagnostic test system.
Получен межвидовой гибридный штамм клеток миеломы мыши Р3-X63-Ag-8. 653 со спленоцитами овцы, инфицированной вирусом лейкоза крупного рогатого скота. Штамм межвидовых гибридных клеток 8С12 является постоянной линией клеток с неограниченным сроком жизни, пригодным для биотехнологии при наработке препаратов.An interspecific hybrid strain of mouse myeloma cells P3-X63-Ag-8 was obtained. 653 with splenocytes of a sheep infected with cattle leukemia virus. The strain of interspecific hybrid cells 8C12 is a constant cell line with an unlimited lifespan, suitable for biotechnology in the production of drugs.
С целью инфицирования вирусом лейкоза крупного рогатого скота овце подкожно ввели 2 мл культуральной жидкости культуры клеток почки эмбриона овцы, хронически инфицированной вирусом лейкоза крупного скота. Через 2 недели после инокуляции вируссодержащего материала в крови овцы методом РДП были выявлены антитела к гликопротеидному антигену gp51 ВЛКРС. Через 1 месяц ввели внутривенно препарат, антигена ВЖРС, полученный осаждением с помощью полиэтиленгликоля (7%) из культуральной жидкости вируспродуцирующей культуры.In order to infect the cattle leukemia virus, the sheep was subcutaneously injected with 2 ml of culture fluid from a cell culture of a kidney of a sheep embryo chronically infected with cattle leukemia virus. 2 weeks after the inoculation of the virus-containing material in the sheep’s blood, the antibodies to the glycoprotein antigen gp51 VLCCR were detected by the RDP method. After 1 month, the drug was injected intravenously, the HPLC antigen obtained by precipitation using polyethylene glycol (7%) from the culture fluid of the virus-producing culture.
На 3 сутки после бустерного введения овцу убивали, извлекали селезенку и проводили слияние клеток селезенки инфицированной ВЛКРС овцы с клетками мышиной миеломы линии P3-X63-Ag-8. 653.On the 3rd day after booster administration, the sheep were killed, the spleen was removed, and the spleen cells of the infected VLCC infected sheep were merged with the mouse P3-X63-Ag-8 mouse myeloma cells. 653.
Слияние клеток проводили по стандартной методике с использованием ПЭГ с м.м. 1500. Соотношение клеток миеломы и лимфоцитов составляло 1:4-1:10. Селекцию гибридом проводили на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Гибридомы культивировали на 96-луночных панелях производства фирмы «Nunc» на среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров в атмосфере, содержащей 5% СO2.Cell fusion was carried out according to standard methods using PEG with m.m. 1500. The ratio of myeloma cells and lymphocytes was 1: 4-1: 10. Hybridomas were selected on a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine. Hybridomas were cultured in 96-well panels «Nunc» manufactured on the medium RPMI-1640 supplemented with 10% fetal bovine serum in an atmosphere containing 5% CO 2.
Скрининг гибридом на продукцию специфических моноклональных антител проводили методом непрямого твердофазного ИФА с использованием препарата очищенного ВЛКРС в концентрации 5 мкг/мл для сенсибилизации твердой фазы и видоспецифического иммунопероксидазного конъюгата - для выявления связавшихся антител. Клонирование и реклонирование клеточных культур проводили на 96-луночных панелях методом предельных разведений с использованием макрофагального фидерного слоя.Hybridomas were screened for the production of specific monoclonal antibodies by the method of indirect solid-phase ELISA using a purified VLCRC preparation at a concentration of 5 μg / ml to sensitize the solid phase and a species-specific immunoperoxidase conjugate to detect bound antibodies. Cloning and re-cloning of cell cultures was performed on 96-well panels by the method of limiting dilutions using a macrophage feeder layer.
В результате был отобран и размножен клон клеток, продуцирующий моноклональные антитела к гликопротеиду вируса лейкоза крупного рогатого скота. Этот клон клеток был последовательно размножен в 96-, 24-луночных панелях, а затем в культуральных матрасах.As a result, a clone of cells producing monoclonal antibodies to the cattle leukemia virus glycoprotein was selected and propagated. This clone of cells was sequentially propagated in 96-, 24-well panels, and then in culture mattresses.
Была определена видовая принадлежность и специфичность моноклональных антител, продуцируемых отобранным клоном методами ИФА, иммуноблоттинга и иммуноцитохимии и дана количественная оценка продукции антител.The species and specificity of monoclonal antibodies produced by the selected clone by ELISA, immunoblotting and immunocytochemistry were determined and a quantitative assessment of antibody production was performed.
Штамм обладает следующими свойствами.The strain has the following properties.
Морфологические признаки: Клетки однородные, округлой формы с крупным овальным ядром, содержащим от 1 до 3, чаще 1-2 ядрышек. При посеве клетки равномерно распределяются на поверхности субстрата и в культуральной жидкости. Индекс пролиферации составляет 5-6.Morphological signs: Cells are homogeneous, round in shape with a large oval nucleus containing from 1 to 3, often 1-2 nucleoli. When inoculated, the cells are evenly distributed on the surface of the substrate and in the culture fluid. The proliferation index is 5-6.
Культуральные свойства. Межвидовой гибридный штамм 8С12 культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров. Клетки размножаются в суспензии и частично - прикрепляясь к поверхности культурального сосуда. Посевная концентрация 1×104 клеток на 1 мл среды. Через 5-7 суток с момента посева 80% культуральной жидкости удаляют вместе с находящимися в ней клетками. К оставшимся клеткам добавляют такой же объем свежей питательной среды. рН среды 7,2-7,4. Периодичность субкультивирования - 1 раз в 3-5 суток. Кратность рассева 1:5.Cultural properties. The interspecific hybrid strain 8C12 was cultured in RPMI-1640 medium with the addition of 10% serum of cow embryos. Cells multiply in suspension and partially by attaching to the surface of the culture vessel. Inoculum concentration of 1 × 10 4 cells per 1 ml of medium. After 5-7 days from the time of seeding, 80% of the culture fluid is removed along with the cells in it. To the remaining cells add the same amount of fresh nutrient medium. The pH of the medium is 7.2-7.4. The frequency of subcultivation is 1 time in 3-5 days. Multiplicity of sieving 1: 5.
Иммунологические свойства. Моноклональные антитела распознают общую антигенную детерминанту наружного гликопротеида gp51 и трансмембранного гликопротеида gp 30 вируса лейкоза крупного рогатого скота.Immunological properties. Monoclonal antibodies recognize the common antigenic determinant of the external glycoprotein gp51 and the transmembrane glycoprotein gp 30 of bovine leukemia virus.
Контаминация. Контаминация простейшими, грибами, бактериями, микоплазмами, вирусами не выявлена.Contamination. Contamination with protozoa, fungi, bacteria, mycoplasmas, viruses was not detected.
Хранение культур. Среда для замораживания: 70% среды RPMI-1640, 20% сыворотки эмбрионов коров, 10% диметилсульфоксида. Концентрация клеток в пластиковых криопробирках 1,5Ч106 кл/мл. Режим замораживания: до -70°С - -1°/мин, далее - жидкий азот (-196°С) Восстановление после замораживания: быстрое размораживание при 37°С, центрифугирование при 1200 об/мин 10 мин, ресуспендирование в ростовой среде. Жизнеспособность после размораживания 70-80%.Storage of crops. Freezing medium: 70% RPMI-1640 medium, 20% serum of cow embryos, 10% dimethyl sulfoxide. The concentration of cells in plastic cryovials 1.5 × 10 6 cells / ml. Freezing mode: up to -70 ° С - -1 ° / min, then liquid nitrogen (-196 ° С) Recovery after freezing: quick defrosting at 37 ° С, centrifugation at 1200 rpm 10 min, resuspension in a growth medium. Viability after thawing 70-80%.
Предложенный штамм гибридных клеток мыши Mus. Musculus 8С12, продуцент моноклональных антител овцы к оболочечному гликопротеиду gp51 ВЛКРС хранится в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) под №72.The proposed strain of hybrid mouse cells Mus. Musculus 8C12, a producer of sheep monoclonal antibodies to the envelope glycoprotein gp51 VLCRC is stored in the Specialized Collection of transplantable somatic cell cultures of agricultural and commercial animals (CJS RASHN) under No. 72.
Штамм используют при изготовлении диагностической тест-системы для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.The strain is used in the manufacture of a diagnostic test system to detect antibodies to cattle leukemia virus by enzyme immunoassay.
Пример 1. Культивирование штамма in vitro и количественная оценка продукции антител. Клетки штамма 8С12 культивируют в стеклянных матрасах при температуре 37,0°С в питательной среде, состоящей из среды RPMI-1640 и 10% сыворотки крови эмбрионов крови антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 500000 ед/л). Оптимальная плотность посадки 2×104 клеток/мл среды. Через 3-5 суток после образования суспензии культуральную жидкость частично удаляют и добавляют необходимое количество свежей питательной среды. Титр антител к гликопротеидному антигену ВЛКРС в культуральной жидкости определяют методом иммуноферментного анализа с очищенным антигеном ВЛКРС и видоспецифическими антителами кролика против глобулинов овцы, меченными пероксидазой. В нативной (неконцентрированной) культуральной жидкости он составляет 1:32.Example 1. Cultivation of the strain in vitro and quantification of antibody production. Cells of strain 8C12 were cultured in glass mattresses at a temperature of 37.0 ° C in a nutrient medium consisting of RPMI-1640 medium and 10% blood serum of antibiotic blood embryos (penicillin and streptomycin, 500,000 units / l). The optimal planting density of 2 × 10 4 cells / ml of medium. 3-5 days after the formation of the suspension, the culture fluid is partially removed and the required amount of fresh nutrient medium is added. The antibody titer of VLCC glycoprotein antigen in the culture fluid is determined by enzyme immunoassay with purified VLCC antigen and species-specific rabbit antibodies against sheep globulins labeled with peroxidase. In the native (non-concentrated) culture fluid, it is 1:32.
Пример 2. Иммунологические свойства моноклональных антител. Очищенный вирус лейкоза крупного рогатого скота разделяли методом электорофореза в 12,5% геле СДС-ПААГ (додецил-сульфат натрия-полиакриламид) и после переноса на нитроцеллюлозный фильтр проводили инкубацию с моноклональными антителами, продуцируемыми культурой 8С12 и затем, после промывания фильтра - с меченными пероксидазой антителами против глобулинов овцы. Связавшуюся пероксидазу проявляли раствором, содержащем 3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлорида в 0,1 М трис-НС1, рН 7,4 и 1:5000 перекиси водорода Н2O2. Проявлялись две окрашенные полосы в двух зонах, соответствующих по молекулярной массе наружному гликопротеиду gp51 и трансмембранному гликопротеиду gp 30 вируса лейкоза крупного рогатого (с молекулярной массой 67 и 31 КДа).Example 2. Immunological properties of monoclonal antibodies. The purified cattle leukemia virus was separated by electrophoresis in a 12.5% SDS-PAGE gel (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide) and, after transfer to a nitrocellulose filter, incubation was performed with monoclonal antibodies produced by 8C12 culture and then, after washing the filter, labeled peroxidase antibodies against sheep globulins. Bound peroxidase was developed with a solution containing 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride in 0.1 M Tris-HCl, pH 7.4 and 1: 5000 hydrogen peroxide H 2 O 2 . Two colored bands appeared in two zones corresponding in molecular weight to the external glycoprotein gp51 and the transmembrane glycoprotein gp 30 bovine leukemia virus (with a molecular weight of 67 and 31 KDa).
Пример 3. Иммунологические свойства моноклональных антител. Из культуральной жидкости культуры 8С12, полученной, как описано в примере 1, выделяли иммуноглобулины трехкратным осаждением раствором сульфата аммония 50% от насыщения с последующим диализом. Иммуноглобулины метили пероксидазой периодатным методом (3). Первичную культуру куриных фибробластов заражали рекомбинантным штаммом вируса осповакцины WR 601 BLV со встроенным в ДНК геном env вируса лейкоза крупного рогатого скота. Рекомбинантный вирус характеризуется высокой экспрессией полного продукта гена env ВЛКРС (gp51+gp30). Множественность заражения составляла 2-3 БОЕ на 1 клетку. Через 48 часов культивирования при 37°С удаляли культуральную жидкость, монослой фиксировали раствором Буэна и инкубировали с моноклональными антителами, продуцируемыми культурой 8С12, меченными пероксидазой. Реакцию проявляли окрашиванием ДАБ-Н2О2. Фокусы ЦПД окрашивались в коричневый цвет.Example 3. Immunological properties of monoclonal antibodies. Immunoglobulins were isolated from the culture fluid of the 8C12 culture obtained as described in Example 1 by triple precipitation with a solution of ammonium sulfate 50% saturation followed by dialysis. Immunoglobulins were labeled with peroxidase by the periodic method (3). The primary chicken fibroblast culture was infected with a recombinant strain of the vaccinia virus WR 601 BLV with the bovine leukemia virus env gene embedded in the DNA. The recombinant virus is characterized by high expression of the full product of the VLCC env gene (gp51 + gp30). The multiplicity of infection was 2-3 PFU per 1 cell. After 48 hours of cultivation at 37 ° C, the culture fluid was removed, the monolayer was fixed with a Buen solution and incubated with monoclonal antibodies produced by an 8C12 culture labeled with peroxidase. The reaction was stained with DAB-H 2 O 2 . The focuses of the CPDs were stained brown.
Пример 4. Проведение иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител. Моноклональные антитела овцы к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота, продуцируемые штаммом 8С12, были использованы для фиксации антигена ВЛКРС на твердой фазе в непрямом иммуноферментном анализе. Для иммобилизации антигена применяли трехстадийный метод фиксации. На первой стадии поверхность пластика панели для микротитрования сенсибилизировали за счет неспецифической адсорбции препаратом моноклональных антител 1Н8 к иммуноглобулинам овцы, продуцируемых штаммом 1Н8 (депонирован в СХЖ РАСХН под №73) из раствора с концентрацией 5 мкг/мл при рН 7,2-2-7,4. Инкубацию проводили в течение 16-20 часов при 4°С. На второй стадии проводили иммобилизацию за счет специфического иммунологического взаимодействия моноклональных антител к гликопротеидному антигену gp51 ВЛКРС из культуральной жидкости штамма 8С12 (депонирован в СХЖ РАСХН под №72) в течение 1,5 часов при 37°С. На третьей стадии проводили иммобилизацию также за счет специфического иммунологического взаимодействия антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота из культуральной жидкости вируспродуцирующей культуры. Избыток реагентов после каждой стадии сенсибилизации твердой фазы и проведения иммуноферментного анализа отмывали раствором детергента на фосфатно-солевом буферном растворе. Вносили контрольные и анализируемые образцы сыворотки крови крупного рогатого скота и инкубировали в течение 1,5 часов при 37°С. В качестве детектирующих антител использовали меченные пероксидазой моноклональные антитела против глобулинов крупного рогатого скота, не дающие перекрестных реакций с иммуноглобулинами овцы, продуцируемые штаммом 5А10 (депонирован в СХЖ РАСХН под №71).Инкубацию проводили в течение 1,5 часов при температуре 37°С. Учет реакции проводили по изменению оптической плотности анализируемых образцов по сравнению с контрольными образцами после добавления субстратной смеси, содержащей тетраметилбензидин (ТМВ) и перекись водорода Н2O2. Положительными считали пробы, оптическая плотность которых в два и более раз превышала оптическую плотность отрицательного контроляExample 4. Enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies. Sheep monoclonal antibodies to the glycoprotein antigen of bovine leukemia virus produced by strain 8C12 were used to fix the VLCC antigen on the solid phase in an indirect enzyme-linked immunosorbent assay. A three-stage fixation method was used to immobilize the antigen. At the first stage, the plastic surface of the microtiter panel was sensitized due to nonspecific adsorption of monoclonal antibodies 1H8 to sheep immunoglobulins produced by strain 1H8 (deposited in the Union of Agricultural Sciences under No. 73) from a solution with a concentration of 5 μg / ml at pH 7.2-2-2-7 ,four. Incubation was carried out for 16-20 hours at 4 ° C. At the second stage, immobilization was carried out due to the specific immunological interaction of monoclonal antibodies to the glycoprotein antigen gp51 VLSC from the culture fluid of strain 8C12 (deposited in the Union of the Russian Academy of Agricultural Sciences No. 72) for 1.5 hours at 37 ° C. In the third stage, immobilization was also carried out due to the specific immunological interaction of the cattle leukemia virus antigen from the culture fluid of the virus-producing culture. The excess reagents after each stage of sensitization of the solid phase and enzyme-linked immunosorbent assay were washed with a detergent solution in phosphate-buffered saline. Contributed and analyzed samples of blood serum of cattle and incubated for 1.5 hours at 37 ° C. Peroxidase-labeled monoclonal antibodies against bovine globulins that did not cross-react with sheep immunoglobulins produced by strain 5A10 (deposited in the Union of Agricultural Sciences under No. 71) were used as detecting antibodies. The incubation was carried out for 1.5 hours at 37 ° C. The reaction was taken into account by changing the optical density of the analyzed samples compared with the control samples after adding a substrate mixture containing tetramethylbenzidine (TMB) and hydrogen peroxide H 2 O 2 . Samples were considered positive, the optical density of which was two or more times higher than the optical density of the negative control
При проведении исследования 662 сывороток крови из неблагополучного по лейкозу хозяйства параллельно в реакции диффузионной преципитации (РДП) и иммуноферментном анализе совпадение результатов (РДП+/ИФА+; РДП-/ИФА-) отмечали в 560 или 84,6%, несовпадение (РДП+/ИФА-; РДП-/ИФА+) - в 15,4% случаев. Только 3 положительные по результатам РДП-пробы прореагировали отрицательно в ИФА (0,5%). По чувствительности метод иммуноферментного анализа превосходил РДП с гликопротеидным антигеном и не уступал ей по специфичности. В ИФА было выявлено 190 (28,7%) положительных проб, тогда как в РДП - только 94 (14,2%), т.е. на 14,5% или в два раза больше.When conducting a study of 662 blood sera from a leukemic dysfunctional economy, in parallel in a diffusion precipitation reaction (RDP) and enzyme-linked immunosorbent assay, a coincidence of results (RDP + / ELISA +; RDP- / ELISA-) was noted in 560 or 84.6%, mismatch (RDP + / IFA-; RDP- / IFA +) - in 15.4% of cases. Only 3 positive by results of RDP tests reacted negatively in ELISA (0.5%). In terms of sensitivity, the enzyme immunoassay method was superior to RDP with a glycoprotein antigen and was not inferior to it in specificity. In ELISA, 190 (28.7%) positive samples were detected, while in the RPD - only 94 (14.2%), i.e. 14.5% or twice as much.
Предложенный штамм апробирован с положительным результатом в лабораторных условиях Всероссийского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко и Курской биофабрики с 2006 по 2007 гг.The proposed strain was tested with a positive result in laboratory conditions of the All-Russian Institute of Experimental Veterinary Medicine named after Ya.R. Kovalenko and the Kursk Biofactory from 2006 to 2007
Технико-экономическое обоснование. Получен штамм 8С12 гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, характеризующийся следующими полезными свойствами:Feasibility study. The obtained strain 8C12 hybrid cells producing monoclonal antibodies, characterized by the following useful properties:
- является постоянной линией клеток с неограниченным сроком жизни, пригодным для биотехнологии при наработке препаратов;- is a constant line of cells with an unlimited lifespan, suitable for biotechnology in the production of drugs;
- обладает высоким уровнем продукции моноклональных антител. Титры антител в нативной культуральной жидкости составляли 1:32-1:64 в иммуноферментном анализе;- has a high level of production of monoclonal antibodies. Antibody titers in native culture fluid were 1: 32-1: 64 in an enzyme immunoassay;
- моноклональные антитела специфичны к общей антигенной детерминанте гликопротеидов вируса лейкоза - наружного gp 51 и трансмембранного gp30.- monoclonal antibodies are specific for the common antigenic determinant of glycoproteins of the leukemia virus - external gp 51 and transmembrane gp30.
- Моноклональные антитела обеспечивают прочное связывание гликопротеидного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота с твердофазным носителем во время проведения иммуноферментного анализа.- Monoclonal antibodies provide strong binding of the glycoprotein antigen of the cattle leukemia virus to a solid phase carrier during enzyme-linked immunosorbent assay.
- Пространственное расположение гликопротеидного антигена, связанного с твердофазным носителем посредством моноклональных антител при проведении иммуноферментного анализа, обеспечивает выявление антител в сыворотке крови естественно инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота с высокой чувствительностью и специфичностью.- The spatial arrangement of the glycoprotein antigen associated with a solid-phase carrier by means of monoclonal antibodies during enzyme-linked immunosorbent assay provides the detection of antibodies in the blood serum of naturally infected bovine leukemia virus with high sensitivity and specificity.
Штамм 8С12 - продуцент моноклональных антител к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота - найдет применение при изготовлении иммуноферментной тест-системы для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Использование этой тест-системы позволит повысить эффективность оздоровительных мероприятий, уменьшить сроки оздоровления неблагополучных по лейкозу животноводческих хозяйств и в итоге - резко снизить заболеваемость крупного рогатого скота лейкозом.Strain 8C12, a producer of monoclonal antibodies to the cattle leukemia virus glycoprotein antigen, will find application in the manufacture of an enzyme-linked immunosorbent assay system for the diagnosis of cattle leukemia. Using this test system will improve the effectiveness of health measures, reduce the recovery time of livestock farms that are unsuccessful for leukemia, and ultimately dramatically reduce the incidence of cattle leukemia.
Источники информацииInformation sources
1. Журнал. Virology. - 1982, - v.l22, - p.342-352.1. The magazine. Virology. - 1982, - v.l22, - p.342-352.
2. Журнал. Jpn.J.Vet.Sci. - 1988, - v.50, - р.1136-1138.2. The magazine. Jpn.J. Vet.Sci. - 1988, - v.50, - p. 1136-1138.
3. Книга "Immunofluorescence and related staining techniques" под ред. W Knapp. - Elsevier: North-Holland Biomedical Press. - 1978. - 215-221.3. The book "Immunofluorescence and related staining techniques", ed. W Knapp. - Elsevier: North-Holland Biomedical Press. - 1978. - 215-221.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008123101/13A RU2377297C1 (en) | 2008-06-10 | 2008-06-10 | STRAIN 8C12 OF PERMANENT INTER-SPECIES HYBRID LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus AND SHEEP Ovis aries - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO GLYCOPROTEIDAL ANTIGEN OF VIRUS OF CATTLE LEUCOSIS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008123101/13A RU2377297C1 (en) | 2008-06-10 | 2008-06-10 | STRAIN 8C12 OF PERMANENT INTER-SPECIES HYBRID LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus AND SHEEP Ovis aries - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO GLYCOPROTEIDAL ANTIGEN OF VIRUS OF CATTLE LEUCOSIS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2377297C1 true RU2377297C1 (en) | 2009-12-27 |
Family
ID=41642997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008123101/13A RU2377297C1 (en) | 2008-06-10 | 2008-06-10 | STRAIN 8C12 OF PERMANENT INTER-SPECIES HYBRID LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus AND SHEEP Ovis aries - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO GLYCOPROTEIDAL ANTIGEN OF VIRUS OF CATTLE LEUCOSIS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2377297C1 (en) |
-
2008
- 2008-06-10 RU RU2008123101/13A patent/RU2377297C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Моноклональные антитела / Под ред. КЕННЕТА Р.Г. и др. - М.: Медицина, 1983, стр.145-254. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8765133B2 (en) | Method of producing anti-CD166 antibody in ostrich | |
| RU2395577C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING VP40 PROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC TEST SYSTEM FOR EXPOSING VP40 PROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) | |
| RU2377297C1 (en) | STRAIN 8C12 OF PERMANENT INTER-SPECIES HYBRID LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus AND SHEEP Ovis aries - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO GLYCOPROTEIDAL ANTIGEN OF VIRUS OF CATTLE LEUCOSIS | |
| RU2395576C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus museums L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING NUCLEOPROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC TEST SYSTEM FOR EXPOSING NUCLEOPROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) | |
| RU2377962C1 (en) | Method for diagnostics of cattle leucosis | |
| RU2377299C1 (en) | STRAIN 5A10 OF PERMANENT HYBRIDOMAL LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. musculus - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO IgG OF CATTLE | |
| RU2377298C1 (en) | STRAIN 1H8 OF PERMANENT HYBRIDOMAL LINE OF CELLS OF MOUSE Mus. Musculus - PRODUCENT OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO IgG OF SHEEP | |
| RU2535982C1 (en) | Strain of cultivated hybrid animal cells mus musculus l cchfv vd-1-producer of monoclonal antibody 4g4/b6 to virus of crimean-congo hemorrhagic fever (cchf) | |
| RU2395575C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING VP40 PROTEIN OF MARBURG VIRUS, (Popp STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC SYSTEM FOR EXPOSING VP40 MATRIX PROTEIN OF MARBURG VIRUS (Popp STRAIN) | |
| JPH06153979A (en) | Monoclonal antibody against fish iridovirus, hybridoma for producing the antibody and production method | |
| AU2012203085B2 (en) | Antibody produced using ostrich and method for production thereof | |
| SU1740415A1 (en) | Strain of hybrid cultured cells of animals mus musculus l as a producer of monoclonal antibodies to the pseudomonas pseudomalei antibodies, which do not react with malleus infection pathogenic organism of the nearest relationship | |
| RU2092554C1 (en) | Strain of the hybrid cultured animal cell mus musculus l - a producer of monoclonal antibody raised to aujeszky's disease virus, strain uniiev-18b | |
| RU2451071C1 (en) | Mus musculus cultivated hybrid cell strain producer of monoclonal antibodies specific to human recombinant erythropoietin (versions) | |
| RU2070926C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies to the c-terminal part of protein p24 of human immunodeficiency virus type 1 | |
| RU2265658C2 (en) | Strain of hybrid cells of animal mus musculus l, 9e2, used in preparing monoclonal antibody to west nile virus protein e of strain wnv/leiv-vig99-27889 | |
| RU2012594C1 (en) | Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to 146s-component of foot and mouth disease virus asia-1 | |
| RU2528869C1 (en) | STRAIN OF CULTIVATED HYBRID CELLS OF ANIMAL MUS MUSCULUS L CCHFV Vd-3-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODY 3H6/F2 TO VIRUS OF CRIMEAN-CONGO HAEMORRHAGIC FEVER | |
| RU2093572C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibody raised to l-chains of immunoglobulins | |
| RU2117700C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells of animal mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies raised to pig vesicular disease virus, strain t-75 | |
| RU2004589C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells mus musculus - a producer of monoclonal antibodies used for ibaraki disease diagnosis | |
| RU2092553C1 (en) | Strain of hybrid cultured animal cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies raised to a-determinant of hepatitis b virus surface antigen | |
| RU2560260C1 (en) | Strain of f26 of constant monoclonal antibody line of cells of mus musculus mouse - producer of monoclonal antibodies to oligopolysaccharide (ops) antigen b abortus | |
| RU2549713C1 (en) | STRAIN AS25 OF CONSTANT HYBRIDOMA CELL LINE OF MOUSE Mus musculus-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO ANTIGEN H3 OF EQUINE INFLUENZA VIRUS | |
| RU2093574C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibody raised to pig jgg |