RU2092553C1 - Strain of hybrid cultured animal cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies raised to a-determinant of hepatitis b virus surface antigen - Google Patents
Strain of hybrid cultured animal cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies raised to a-determinant of hepatitis b virus surface antigen Download PDFInfo
- Publication number
- RU2092553C1 RU2092553C1 RU94038719A RU94038719A RU2092553C1 RU 2092553 C1 RU2092553 C1 RU 2092553C1 RU 94038719 A RU94038719 A RU 94038719A RU 94038719 A RU94038719 A RU 94038719A RU 2092553 C1 RU2092553 C1 RU 2092553C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- hbsag
- hepatitis
- monoclonal antibodies
- determinant
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при диагностике вируса гепатита В. Гепатит В является тяжелым инфекционным заболеванием человека. HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В) - основной маркер заболевания, подтверждающий наличие острой или хронической формы инфекции или носительства. Для создания тест-систем для диагностики гепатита В необходимо наличие моноклональных антител к HBsAg. The invention relates to hybridoma technology and can be used in the diagnosis of hepatitis B. Hepatitis B is a serious human infectious disease. HBsAg (hepatitis B virus surface antigen) is a major marker of disease that confirms the presence of an acute or chronic form of infection or carriage. The creation of test systems for the diagnosis of hepatitis B requires the presence of monoclonal antibodies to HBsAg.
Ряд авторов [1,5] получили коллекции гибридом, продуцирующих МКА (моноклональные антитела) к HBsAg. Однако, только немногие из штаммов обладают свойствами, необходимыми для штаммов-продуцентов, пригодных в производстве диагностических тест-систем: высокими ростовыми характеристиками, большим выходом антител на мышь в асцитной жидкости, стабильностью продуцируемых антител в растворе с сорбированными на твердой фазе, высокой активностью в реакции антиген-антитело, специфичностью к определенному участку "а" антигенной детерминанты и главное способностью выявлять HBsAg в низких концентрациях [3,4]
Известно, что группоспецифическая а-детерминанта молекулы HBsAg является сложной и содержит несколько сайтов связывания антител [6] Наличие МКА к различным сайтам на а-детерминанте молекулы HBsAg могло бы позволить конструировать диагностикумы по двухсайтному методу, в котором взаимодействие иммуноспецифических реагентов проводится в одну стадию, используя независимость связывания МКА с разными эпитопами. При конструировании тест-систем по двухсайтному методу можно добиваться более высокой чувствительности [3]
Наиболее близкой к заявляемой является гибридома ЖАК-22. Она обладает следующими свойствами: титр асцитной жидкости в ИФА 4•105, содержание специфических антител 9,7 мг/мл, чувствительность при определении HBsAg и РИА 2 нг/мл, в ИФА 1 нг/мл [1,2]
По сравнению с ЖАК-22 HBSV-1 отличается большим выходом асцитной жидкости на мышь, более высокими титрами асцитной жидкости в ИФА и более высокой чувствительностью при определении HBsAg.A number of authors [1,5] obtained collections of hybridomas producing mAbs (monoclonal antibodies) against HBsAg. However, only a few of the strains possess the properties necessary for producer strains suitable in the production of diagnostic test systems: high growth characteristics, high yield of antibodies to the mouse in ascites fluid, stability of produced antibodies in solution with adsorbed on the solid phase, and high activity in antigen-antibody reactions, specificity for a specific site “a” of the antigenic determinant, and most importantly, the ability to detect HBsAg in low concentrations [3,4]
It is known that the group-specific a-determinant of the HBsAg molecule is complex and contains several antibody binding sites [6] The presence of MCAs to different sites on the a-determinant of the HBsAg molecule could allow constructing diagnostics using the two-site method in which the interaction of immunospecific reagents is carried out in one stage, using the independence of the binding of MCA to different epitopes. When designing test systems using the two-site method, higher sensitivity can be achieved [3]
Closest to the claimed is a hybridoma ZhAK-22. It has the following properties: titer of ascites fluid in ELISA 4 • 10 5 , the content of specific antibodies 9.7 mg / ml, the sensitivity in determining HBsAg and RIA 2 ng / ml, in ELISA 1 ng / ml [1,2]
Compared to ZhAK-22, HBSV-1 is characterized by a higher yield of ascitic fluid per mouse, higher titers of ascitic fluid in ELISA and higher sensitivity in the determination of HBsAg.
Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующих моноклональные антитела к определенному сайту группоспецифической а-детерминанты HBsAg. The aim of the invention is to obtain a strain of hybrid cultured animal cells of Mus musculus animals producing monoclonal antibodies to a specific site of the group-specific a-determinant of HBsAg.
Цель достигается получением коллекции гибридом, продуцирующих МКА к HBsAg (по реакции в ИФА) и состоящей из 50-ти различных клонов. Гибридомы сравниваются по ростовым характеристикам, стабильности продукции антител, прививаемости мышам сингенной линии, объему получаемых асцитных жидкостей, титрам антител асцитных и культуральных жидкостей в разных вариантах ИФА, а также в РПГА и иммунодиффузии. Продуцируемые гибридомами антитела сравнивают также в реакции конкурентного ИФА, что позволяет разделить их на несколько групп конкуренции. Реакция с adw и ayw генноинженерными вариантами HBsAg позволяет определить МКА комплементарные а-детерминанте молекулы HBsAg. The goal is achieved by obtaining a collection of hybridomas producing mAbs for HBsAg (by reaction in ELISA) and consisting of 50 different clones. Hybridomas are compared in terms of growth characteristics, stability of antibody production, grafting to syngeneic mice, the volume of ascites fluids obtained, antibody titers of ascites and culture fluids in different ELISA variants, as well as in RPHA and immunodiffusion. Antibodies produced by hybridomas are also compared in the reaction of competitive ELISA, which allows them to be divided into several competition groups. The reaction with adw and ayw genetically engineered variants of HBsAg allows the determination of MCAs complementary to the α-determinant of the HBsAg molecule.
В результате анализа был отобран штамм, комплементарный определенному участку а-детерминанты HBsAg и обладающий хорошими характеристиками штамма-продуцента МКА. As a result of the analysis, a strain was selected that was complementary to a specific site of the a-determinant of HBsAg and possesses good characteristics of the producer strain MAB.
Гибридомы получают слиянием клеток миеломы PЗ-NS1-Ag4-1 со спленоцитами мыши линии BALB/c, иммунизированной HBsAg. Мышь линии BALB/c (самка, 8 недель) иммунизируют внутрибрюшинно HBsAg, выделенным из плазмы сыворотки хронически больных людей, в количестве 20 мкг в 0,5 мл забуференного фосфатом физраствора (ЗФР), содержащего 50% полного адъюванта Фрейда и через 8 недель 200 мкг HBsAg в 0,5 мл ЗФР внутрибрюшинно. Через 3 дня после второй иммунизации клетки селезенки иммунной мыши гибридизируют с клетками миеломы мыши РЗ-NS1-Ag4-1 (соотношение 3: 1) в 1 мл раствора, содержащего 50% полиэтиленгликоля (м.м. 4000 "Merk") и 5% диметилсульфоксида. После гибридизации и отмывки от полиэтиленгликоля клетки высевают в 96-луночные планшеты по 3•105 клеток на лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду ДМЕМ (м) с добавлением 10% телячьей эмбриональном сыворотки, 4•10-7М аминоптерина, 10-4M гипоксантина и 1,6•10-5M тимидина. Гибриды-продуценты отбирают методом иммуноферментного анализа (ИФА) и дважды клонируют методом лимитирующих разведений.Hybridomas are obtained by fusion of P3-NS1-Ag4-1 myeloma cells with mouse BALB / c splenocytes immunized with HBsAg. A BALB / c mouse (female, 8 weeks old) was immunized intraperitoneally with HBsAg isolated from serum of chronically ill people in an amount of 20 μg in 0.5 ml phosphate-buffered saline (PBS) containing 50% Freud's complete adjuvant and after 8 weeks 200 mcg HBsAg in 0.5 ml PBS intraperitoneally. 3 days after the second immunization, spleen cells of the immune mouse hybridize with mouse myeloma cells PZ-NS1-Ag4-1 (3: 1 ratio) in 1 ml of a solution containing 50% polyethylene glycol (mm 4000 "Merk") and 5% dimethyl sulfoxide. After hybridization and washing from polyethylene glycol, cells are plated in 96-well plates with 3 x 10 5 cells per well. For cultivation and selection of hybrids, DMEM medium (m) with the addition of 10% calf fetal serum, 4 • 10 -7 M aminopterin, 10 -4 M hypoxanthine and 1.6 • 10 -5 M thymidine is used. Producing hybrids are selected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and cloned twice by limiting dilution method.
Продуктивный штамм обозначен HBSV-1. The productive strain is designated HBSV-1.
Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур 30.11.93 под номером ВСКК/П/630 Д. Штамм депонирован с научным списанием (паспортом). The strain was deposited in the Specialized collection of transplantable somatic vertebrate cells of the All-Union collection of cell cultures on 11/30/93 under the number VSCK / P / 630 D. The strain was deposited with a scientific write-off (passport).
Штамм характеризуется следующими признаками. The strain is characterized by the following features.
Родословная штамма. The pedigree of the strain.
Гибридома получена слиянием клеток миеломы РЗ-NS1-Ag4-1 со спленоцитами мыши линии BALB/c, иммунизированной HBsAg, с помощью полиэтиленгликоля (м.м. 4000). Селекцию гибридов проводили на НАТ среде. Клетки были дважды клонированы, процент позитивных клонов после 2-го клонирования 100% К моменту депонирования число пассажей 40. The hybridoma was obtained by fusion of myeloma cells PZ-NS1-Ag4-1 with splenocytes of the BALB / c mouse immunized with HBsAg using polyethylene glycol (mm 4000). Hybrid breeding was performed on NAT medium. Cells were cloned twice, the percentage of positive clones after the 2nd cloning was 100%. By the time of depositing the number of passages was 40.
Культуральные свойства. Cultural properties.
Среда для культивирования среда ДМЕМ с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 40 мкг/мл гентамицина при 37oC и 5% CO2. Гибридомы культивируются в стеклянных или пластиковых флаконах объемом 0,05-1,5 л в стационарном состоянии, клетки снимаются смесью растворов трипсина (25 мкг/л) и Версена в соотношении 1:2, посевная доза 150 тыс. клеток в мл, кратность пересева 1:4 или 1:5, время субкультивирования 2-3 суток.Cultivation medium DMEM medium with 10% fetal calf serum, 40 μg / ml gentamicin at 37 ° C and 5% CO 2 . Hybridomas are cultured in glass or plastic bottles with a volume of 0.05-1.5 L in a stationary state, the cells are removed with a mixture of trypsin solutions (25 μg / L) and Versen in a ratio of 1: 2, inoculative dose of 150 thousand cells per ml, reseeding rate 1: 4 or 1: 5, subculture time 2-3 days.
Культивирование гибридомы в организме животного. The cultivation of hybridomas in the body of the animal.
Гибридома может быть культивирована в организме мышей линии BALB/c, сенсибилизированных внутрибрюшинно за 5-40 дней 0,5 мл пристана или вазелинового масла. Доза клеток при прививке 1-10•106. Асцит образуется через 7-18 дней. Гибридома может перевиваться.The hybridoma can be cultured in the body of BALB / c mice sensitized intraperitoneally for 5-40 days with 0.5 ml of pristan or paraffin oil. The dose of cells when vaccinated is 1-10 • 10 6 . Ascites is formed after 7-18 days. Hybridoma may interrupt.
Морфологические признаки. Morphological signs.
Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных по морфологии и размерам с исходной родительской миеломой РЗ-NS1-Ag4-1. The culture consists of large rounded cells, similar in morphology and size to the original parent myeloma RE-NS1-Ag4-1.
Данные о видовой принадлежности. Species data.
Гибридома является мышиной получена слиянием клеток мышиной миеломы и спленоцитов мыши, может культивироваться в организме мыши, секретируемые ею МКА взаимодействуют с антисывороткой к иммуноглобулинам мыши. A hybridoma is a mouse obtained by fusion of mouse myeloma cells and mouse splenocytes; it can be cultured in the mouse organism; the MCAs secreted by it interact with antiserum to mouse immunoglobulins.
Маркерные признаки и методы их оценки. Marker signs and methods for their assessment.
Гибридома представляет собой монослойно-суспензионную культуру клеток и продуцирует антитела со следующими маркерными признаками-антитела принадлежат к классу IgG1, слабо взаимодействует с белком А золотистого стафилококка (по данным ИФА и аффинной хромотографии), реагируют в ИФА с HBs-антигеном плазматическим, HBs-антигеном генноженерным adw и ayw серотипов, дают положительный ответ в реакции диффузной преципитации в геле, РПГА и в "сэндвич"-варианте ИФА, взаимодействуя одновременно с HBsAg, сорбированном на твердой фазе, и с HBsAg, конъюгированном с пероксидазой и находящемся в растворе. The hybridoma is a monolayer suspension cell culture and produces antibodies with the following marker features — antibodies belong to the IgG1 class, weakly interacts with Staphylococcus aureus A protein (according to ELISA and affinity chromatography), react in ELISA with plasma HBs antigen, HBs antigen by genotype adw and ayw serotypes, give a positive response in the diffuse precipitation reaction in the gel, RPHA, and the sandwich ELISA variant, interacting simultaneously with HBsAg adsorbed on the solid phase and with HBsAg conjugated with peroxidase and in solution.
Данные о контаминации. Contamination data.
Бактерии и грибы не обнаружены, контроль на контаминацию вирусами и микоплазмами не проводился. Bacteria and fungi were not detected, control for contamination with viruses and mycoplasmas was not carried out.
Характеристика биосинтеза полезных продуктов. Characterization of the biosynthesis of useful products.
Секретируемые гибридомой МКА имеют титр около 1•10-3 в культуральной жидкости, 1•10-6 в асцитной жидкости (по данным ИФА), стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 40 пассажей в культуре клеток (срок наблюдения).MAB secreted by hybridoma have a titer of about 1 • 10 -3 in the culture fluid, 1 • 10 -6 in the ascites fluid (according to ELISA), antibody production stability is maintained for 40 passages in the cell culture (observation period).
Способ криоконсервации. The method of cryopreservation.
Клетки замораживаются на ростовой среде с 40%-ной фетальной сывороткой теленка и 10%-ным диметилсульфоксидом при минут 70oC в пенопластовом контейнере с толщиной стенок 1,5см в течение ночи, хранятся в жидком азоте, размораживаются в течение 1-2 мин при 37-40oC, отмываются от криозащитной среды и культивируются на ростовой среде в стеклянных или пластиковых флаконах; выживаемость клеток при размораживании составляет 70-80% (по окраске трипановым синим).Cells are frozen on growth medium with 40% fetal calf serum and 10% dimethyl sulfoxide at 70 ° C in a foam container with a wall thickness of 1.5 cm overnight, stored in liquid nitrogen, thawed for 1-2 minutes at 37-40 o C, washed from cryoprotective medium and cultivated on a growth medium in glass or plastic bottles; cell survival during thawing is 70-80% (by trypan blue stain).
На чертеже приведены кривые конкуренций клонов ЖАК-22 и HBSV-1: на оси абцисс номер трехкратного разведения конкурента, конкурентом в реакции являются МКА HBSV-1 из культуральной жидкости; меченые антитела МКА HBSV-1 (1) и ЖАК-22 (2). The drawing shows the competition curves of the ZhAK-22 and HBSV-1 clones: on the abscissa axis the number of three-fold dilution of the competitor, the competitor in the reaction are HBSV-1 MCAs from the culture fluid; Labeled antibodies MCA HBSV-1 (1) and JAC-22 (2).
Приведенные ниже примеры подробно раскрывают сущность изобретения. The following examples detail the essence of the invention.
Пример 1. Определение специфической активности антител. Example 1. Determination of the specific activity of antibodies.
HBsAg из плазмы больных людей или генноинженерный avw серотипа сорбируют в лунки полистироловых планшетов из раствора ЗФР, содержащего антиген в концентрации 10 мкг/мл, в течение ночи; неспецифические места связывания на пластике блокируют с помощью 0,1%-ного раствора казеина в ЗФР, проводят титрование культуральной асцитной жидкости с разведения 1/30 с кратностью 3 в блокирующем буфере; время реакции антиген-антитело ночь при комнатной температуре; после отмывки в лунки добавляют антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена [7] После окончания инкубации (1ч и 37oC) несвязавшиеся продукты реакции отмывают и связавшийся конъюгат определяют количественно по расщеплению субстрата (H2O2) в присутствии хромогена ортофенилендиамина. Положительная реакция проявляется коричневым окрашиванием и просчитывается при 492 нм. Титром считаются разведение раствора антител, при котором наблюдалось оптическое поглощение 0,2 о.е./мл при длине волны 492 нм.HBsAg from the plasma of sick people or a genotypically engineered avw serotype is sorbed into the wells of polystyrene plates from a PBS solution containing 10 μg / ml antigen overnight; nonspecific binding sites on the plastic are blocked with a 0.1% solution of casein in PBS, titration of the culture ascites fluid with a dilution of 1/30 with a multiplicity of 3 in a blocking buffer is performed; antigen-antibody night reaction time at room temperature; after washing, antibodies against mouse immunoglobulins conjugated with horseradish peroxidase are added to the wells [7] After incubation (1 h and 37 ° C), unbound reaction products are washed and the bound conjugate is quantified by cleavage of the substrate (H 2 O 2 ) in the presence of the orthophenylenediamine chromogen. A positive reaction is manifested by brown staining and calculated at 492 nm. A titer is considered to be a dilution of an antibody solution in which an optical absorption of 0.2 pu / ml was observed at a wavelength of 492 nm.
При реакции с плазматическим HBsAg титры в культуральной жидкости составляют примерно 10-3, титры асцитной жидкости составляют примерно 10-6. Соотношение титров при реакции с HBsAg плазматическим и генноинженерным ayw серотипа 1:3.When reacting with plasma HBsAg, titers in the culture fluid are about 10 -3 , and ascites fluid titers are about 10 -6 . The ratio of titers in the reaction with HBsAg plasma and genetically engineered ayw serotype 1: 3.
Пример 2. Реакция МКА HBSV-1 с разными серотипами HBsAg. При сравнении реакции МКА с разными серотипами генноинженерного HBsAg (adw и ayw) антитела из раствора ЗФР, с концентрацией 10 мкг/мл, сорбируют в лунках полистироловых планшетов, блокируют 0,1%-ным раствором казеина и добавляют adw и ayw варианты генноинженерного HBsAg в блокирующем буфере с концентрацией от 100 до 1,3 нг/мл с кратностью разведений 3. МКА для сорбции очищают с помощью аффинной хроматографии на белке А золотистого стафилококка [8] Реакцию антиген-антитело ведут в течение ночи при комнатной температуре. После отмывки добавляют МКА HBSV-1, конъюгированные с пероксидазой хрена, на 1 ч при 37oC. Положительную реакцию определяют как описано выше, МКА HBSV-1 реагируют как с adw, так и с avw серотипами генноинженерного HBsAg с соотношением титров 1:1.Example 2. The reaction of HBSV-1 MCA with different serotypes of HBsAg. When comparing the reaction of MCA with different serotypes of genetically engineered HBsAg (adw and ayw), antibodies from a PBS solution with a concentration of 10 μg / ml are sorbed in the wells of polystyrene plates, blocked with 0.1% casein solution, and adw and ayw variants of genetically engineered HBsAg are added to blocking buffer with a concentration of from 100 to 1.3 ng / ml with a dilution ratio of 3. Stabilized staphylococcus aureus Protein A affinity MCA for adsorption was purified [8]. The antigen-antibody reaction was carried out overnight at room temperature. After washing, add HBSV-1 MCA conjugated to horseradish peroxidase for 1 h at 37 ° C. The positive reaction is determined as described above, HBSV-1 MCAs react with both adw and avw serotypes of genetically engineered HBsAg with a titer ratio of 1: 1 .
Пример 3. Проведение конкурентного ИФА. Example 3. Carrying out a competitive ELISA.
Метод основан на конкуренции между мечеными пероксидазой хрена и немечеными МКА при ограниченной концентрации антигена. Конъюганты МКА получают периодатным методом [7] В лунки полистироловых планшетов с сорбированным HBsAg добавляют конкурирующие антитела в серии 3- кратных разведений и инкубируют 2 ч при 43oC, после чего вносят меченые МКА на 2 ч при 43oC. Разведение меченых МКА подбирают так, чтобы они в отсутствие конкурента давали в ИФА значение экстинкции на 492 нм 1 о.е./мл. Количество связавшейся метки определяют, как описано выше. Процент конкуренции вычисляют по формуле:
где А величина связывания метки в отсутствие конкурента,
В связывание метки в присутствии немеченного МКА.The method is based on competition between horseradish peroxidase labeled and unlabeled MCA with a limited concentration of antigen. Conjugants of MCA are prepared by the periodic method [7] Competitive antibodies are added to wells of polystyrene tablets with adsorbed HBsAg in a series of 3-fold dilutions and incubated for 2 hours at 43 ° C, after which labeled MCAs are added for 2 hours at 43 ° C. Dilution of labeled MCAs is selected so that they, in the absence of a competitor, give an extinction value of 492 nm 1 pu / ml in ELISA. The amount of bound label is determined as described above. The percentage of competition is calculated by the formula:
where A is the amount of label binding in the absence of a competitor,
In label binding in the presence of unlabeled MCA.
Связывание МКА HBSV-1, меченного пероксидазой хрена, с HBsAg подавляется немеченными МКА HBSV-1 и ЖАК-22. Таким образом МКА ЖАК-22 и HBSV-1 относятся к одной группе конкуренции и конкурируют между собой за сайт связывания на молекуле HBsAg. The binding of HBSV-1 MCA labeled with horseradish peroxidase to HBsAg is inhibited by unlabeled HBSV-1 and JAC-22 MCAs. Thus, LCA JAC-22 and HBSV-1 belong to the same competition group and compete with each other for the binding site on the HBsAg molecule.
Пример 4. Определение стабильности МКА в растворах. Стабильность МКА определяют по соотношению титров в ИФА культуральных и асцитных жидкостей после их обработки следующими способами: прогрев при 37oC в течение 43 ч, прогрев при 60oC в течение 1 ч, трехкратная заморозка и разморозка. Показано, что при всех методах обработки титры специфических антител, определенные методом ИФА, в культуральной и асцитной жидкости не меняются.Example 4. Determination of the stability of MCA in solutions. The stability of the MCA is determined by the ratio of titers in ELISA of culture and ascites liquids after their treatment in the following ways: heating at 37 ° C for 43 hours, heating at 60 ° C for 1 hour, triple freezing and defrosting. It was shown that with all processing methods, the titers of specific antibodies determined by ELISA did not change in the culture and ascites fluids.
Пример 5. Определение HBsAg в растворах. Example 5. Determination of HBsAg in solutions.
МКА HBSV-1, очищенные методом аффинной хроматографии на белке А золотистого стафилококка, конъюгируют с пероксидазой хрена. В лунках полистироловых планшетов сорбируют очищенные МКА HBSV-1 из раствора ЗФР, содержащего МКА в концентрации 10 мкг/мл в течение ночи; места неспецифического связывания блокируют 0,1%-ным раствором казеина в ЗФР, отмывают трижды водой и добавляют HBsAg в серии 3-кратных разведений в концентрации от 100 нг до 0,01нг в объеме 100 мкл и конъюгат МКА HBSV-1 с пероксидазой хрена в разведении 1/1000 в объеме 50 мкл на 3 ч при 43oC. Реакцию проявляют, как описано выше. Положительной считают реакцию, когда значение экстинкции на 492 нм превышает значение экстинкции для контрольной лунки (без HBsAg) на 0,04 о.е. Метод позволяет определять до 0,3нг/мл HBsAg в растворе.HBSV-1 MCAs, purified by affinity chromatography on Staphylococcus aureus Protein A, are conjugated to horseradish peroxidase. In the wells of polystyrene plates, purified HBSV-1 MCAs are sorbed from a PBS solution containing 10 μg / ml MCA overnight; nonspecific binding sites are blocked with a 0.1% solution of casein in PBS, washed three times with water and HBsAg is added in a series of 3-fold dilutions at a concentration of 100 ng to 0.01 ng in a volume of 100 μl and HBSV-1 MCA conjugate with horseradish peroxidase in dilution 1/1000 in a volume of 50 μl for 3 h at 43 o C. the Reaction is shown as described above. A reaction is considered positive if the extinction value at 492 nm exceeds the extinction value for the control well (without HBsAg) by 0.04 p.u. The method allows determination of up to 0.3 ng / ml HBsAg in solution.
Штамм отличается от других близких штаммов следующей совокупностью признаков: продуцируемые им МКА реагируют в ИФА со следующими вариантами HBsAg: плазматическим из сыворотки переболевших людей, генноинженерными осповакцинными серотипов adw и ayw; конкурируют за сайт связывания на молекуле HBsAg с МКА ЖАК-22; не связываются с HBsAg, денатурированным 2-меркаптоэтанолом, следовательно, МКА комплементарны конформационному эпитопу на группоспецифической "а" антигенной детерминанте молекулы HBsAg (этот участок а-детерминанты молекулы HBsAg обозначается как А); МКА относятся к 1gG1; могут быть очищены с помощью аффинной хромотографии на белке А золотистого стафилококка с высоким выходом (98%), обладают высокой стабильностью при хранении в растворах и сорбированными на пластике; клетки обладают отличными ростовыми характеристиками, стабильны по продукции МКА (срок наблюдения около 40 пассажей), хорошо прививаются животным и дают большой выход асцитной жидкости на мышь (4-10 мл) с высоким содержанием специфических антител (5-10 мг/мл) и с высокими титрами специфических антител в ИФА (105-106); МКА пригодны для выявления HBsAg в растворах, сыворотке людей и сорбированного на пластике.The strain differs from other similar strains in the following set of features: the MABs produced by it react in ELISA with the following HBsAg variants: plasma from the serum of ill people, genetically engineered vaccinia serotypes adw and ayw; compete for the binding site on the HBsAg molecule with LCA JAC-22; do not bind to HBsAg denatured with 2-mercaptoethanol, therefore, MCAs are complementary to the conformational epitope on the group-specific "a" antigenic determinant of the HBsAg molecule (this section of the a-determinant of the HBsAg molecule is denoted by A); MCAs refer to 1gG1; can be purified by affinity chromatography on protein A of Staphylococcus aureus with high yield (98%), have high stability when stored in solutions and adsorbed on plastic; the cells have excellent growth characteristics, are stable in MCA production (observation period of about 40 passages), graft well in animals and give a large yield of ascites fluid to the mouse (4-10 ml) with a high content of specific antibodies (5-10 mg / ml) and high titers of specific antibodies in ELISA (10 5 -10 6 ); MCAs are suitable for the detection of HBsAg in solutions, human serum and sorbed on plastic.
Перечисленные свойства позволяют использовать штамм HBSV-1 для производства диагностических тест-систем. These properties allow the use of strain HBSV-1 for the production of diagnostic test systems.
Список литературы:
1. Кущ А.А. Момот А.М. Шумай Е.П. и др.Bibliography:
1. Kushch A.A. Momot A.M. Shumai E.P. and etc.
Получение и характеристика гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к поверхностному антигену вируса гепатита B. Вопросы вирусологии, 1987, N4, с. 448-451. Obtaining and characterization of hybridomas producing monoclonal antibodies to the hepatitis B surface antigen. Issues in Virology, 1987, N4, p. 448-451.
2. Жданов Е.М. Кущ А.А. Момот А.М. и др. 2. Zhdanov E.M. Kushch A.A. Momot A.M. and etc.
Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1986, N12, с.37-40. Molecular Genetics, Microbiology and Virology, 1986, N12, p. 37-40.
3. Кущ А.А. Момот А.М. и др. 3. Kushch A.A. Momot A.M. and etc.
Сравнение различных тест-систем для радиоиммунологического определения поверхностного антигена вируса гепатита B с использованием моноклональных антител. Вопросы вирусологии, 1987, N5, с. 544-548. Comparison of various test systems for radioimmunological determination of hepatitis B virus surface antigen using monoclonal antibodies. Questions of Virology, 1987, N5, p. 544-548.
4. Воробьев С.М. Симонов В.И. Кущ А.А. 4. Vorobyov S.M. Simonov V.I. Kushch A.A.
Использование моноклональных антител для иммуноферментного определения поверхностного антигена вируса гепатита В. Биотехнология, 1987, N6, с. 720-724. The use of monoclonal antibodies for enzyme immunoassay to determine the surface antigen of hepatitis B. Biotechnology, 1987, N6, p. 720-724.
5. Wands J.R. Zurawski V.R. 5. Wands J.R. Zurawski V.R.
HIgh affinity monoclonal antibodies to hepatitis B surface antigen, produced by somatio cell hybrids. HIgh affinity monoclonal antibodies to hepatitis B surface antigen, produced by somatio cell hybrids.
Gastroenterology, 1981, v. 80, p. 225-232. Gastroenterology, 1981, v. 80, p. 225-232.
6. Wands et al. 6. Wands et al.
Signature analisis of hepatitis B viral antigen structure: analisis by monoclonal radioimmunoassays. Signature analisis of hepatitis B viral antigen structure: analisis by monoclonal radioimmunoassays.
PNAS USA, 1984, v. 81, p. 2237-2241. PNAS USA, 1984, v. 81, p. 2237-2241.
7. Nakane P.K. and Kawaoi,
Histochem. Cytochem. 1974 y. v. 22, p. 1084.7. Nakane PK and Kawaoi,
Histochem. Cytochem. 1974 yv 22, p. 1084.
8. Ey P.L. et a1. 8. Ey P.L. et a1.
Isolation of pure IgG1, IgG2a and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-Sepharose. Isolation of pure IgG1, IgG2a and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-Sepharose.
Immunochemistry, 1978, v. 15, p. 429-436. Immunochemistry, 1978, v. 15, p. 429-436.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94038719A RU2092553C1 (en) | 1994-10-12 | 1994-10-12 | Strain of hybrid cultured animal cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies raised to a-determinant of hepatitis b virus surface antigen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94038719A RU2092553C1 (en) | 1994-10-12 | 1994-10-12 | Strain of hybrid cultured animal cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies raised to a-determinant of hepatitis b virus surface antigen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94038719A RU94038719A (en) | 1996-09-27 |
| RU2092553C1 true RU2092553C1 (en) | 1997-10-10 |
Family
ID=20161735
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94038719A RU2092553C1 (en) | 1994-10-12 | 1994-10-12 | Strain of hybrid cultured animal cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies raised to a-determinant of hepatitis b virus surface antigen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2092553C1 (en) |
-
1994
- 1994-10-12 RU RU94038719A patent/RU2092553C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Кущ А.А., Момот А.М., Шумай Е.П. и др. Вопросы вирусологии, 1987, N 4, с. 448 - 451. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU94038719A (en) | 1996-09-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0634712B2 (en) | Monoclonal antibody-producing hybridoma cell line against hepatitis B virus | |
| US7871621B2 (en) | Anti-HBs monoclonal antibody | |
| Teramoto et al. | Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay, DNA hybridization, hemagglutination, and electron microscopy for detection of canine parvovirus infections | |
| JP3681206B2 (en) | Anti-factor Xa / tissue factor pathway inhibitor complex monoclonal antibody and use thereof | |
| JPS62500173A (en) | Monoclonal antibodies and their uses | |
| RU2395576C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus museums L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING NUCLEOPROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC TEST SYSTEM FOR EXPOSING NUCLEOPROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) | |
| RU2092553C1 (en) | Strain of hybrid cultured animal cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies raised to a-determinant of hepatitis b virus surface antigen | |
| RU2097426C1 (en) | Strain of the hybrid cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to a-determinant of hepatitis b virus surface antigen | |
| RU2097425C1 (en) | Strain of the hybrid cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to a-determinant of hepatitis b virus surface antigen | |
| US5856182A (en) | Monoclonal antibodies specific for the PSA-ACT complex | |
| EP1098198A1 (en) | Method for the qualitative and quantitative determination of class igG human antibodies | |
| JPH0789998A (en) | Antimicrocystin monoclonal antibody and hybridoma producing the antibody | |
| RU2117042C1 (en) | Strain of cultured hybrid cells of animal mus musculus - producer of monoclonal antibodies to thermostable component of capsule-like substance of meliodosis pathogen | |
| RU2012594C1 (en) | Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to 146s-component of foot and mouth disease virus asia-1 | |
| RU2478703C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus 5G6 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO Yersinia pestis V ANTIGEN | |
| RU2451078C1 (en) | Mus musculus cultivated hybrid cell strain 11d6 producer of monoclonal antibodies specific to lipopolysaccharide francisella tularensis | |
| JP2525569B2 (en) | How to identify Candida | |
| SU1555360A1 (en) | Strain of mus musculus hybrid cultivated animal cells used to obtain monoclonal antibodies to alpha-subunit of gonadotropic hormones of man | |
| RU1778183C (en) | Strain of hybrid cultivated cells of - mus | |
| RU2117043C1 (en) | Strain of cultured hybrid cells of animal mus musculus - producer of monoclonal antibodies to thermostable antigen which is common for glanders and meliodosis pathogens | |
| RU2116344C1 (en) | Strain of cultured hybrid cells of animal mus musculus - a producer of monoclonal antibody raised to thermostable surface antigen of meliodosis pathogen | |
| SU1752764A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculus l - producer of monoclonal antibodies to bacteria of brucella genus | |
| RU2004589C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells mus musculus - a producer of monoclonal antibodies used for ibaraki disease diagnosis | |
| RU2142507C1 (en) | Strain of hybrid cultured cell of animal rattus norvegicus used for preparing monoclonal antibodies raised to human hepatitis a virus | |
| RU2003682C1 (en) | Strain of hybrid cultured mammalian cells mus muscullus l - a producer of monoclonal antibodies to lambda-light chains of human immunoglobulins |